人类乳腺癌的白细胞成分

摘要

几种表达CD45的白细胞亚型浸润乳腺癌（BC），包括CD4⁺和CD8⁺T细胞，CD20⁺B细胞和多髓系细胞，包括肿瘤相关巨噬细胞（TAM），通常通过免疫组织化学（IHC）检测CD68来识别(1). 40岁以下患者的高淋巴细胞浸润与生存率增加相关(2)肿瘤也被TAM严重浸润的患者亚群预后良好(三). 更具体地说，对BC患者的大规模队列研究表明，CD68的存在⁺肿瘤组织中的细胞与预后不良相关(4–6)，肿瘤分级较高(7–9)，血管生成增加(10–13)，降低无病生存率(6,11,14,15)以及结合内皮细胞和癌细胞标记物评估时增加系统性转移的风险(16).

特定白细胞在BC发育中的功能意义是基于使用小鼠乳腺癌模型的实验研究得出的，在该模型中，评估了白细胞发育或募集基因中含有纯合无效突变的小鼠。在表达由小鼠乳腺癌病毒启动子调控的多瘤病毒中间T抗原的转基因小鼠（MMTV-PyMT小鼠）中，缺乏该基因的小鼠乳腺癌进展和肺转移减少集落刺激因子-1(csf1)基因是巨噬细胞成熟和募集的关键细胞因子(17,18). 乳腺肿瘤组织中的TAM通常与血管系统有关(19)VEGFA的产生促进了组织的血管生成程序(20,21)EGF的产生促进了侵袭性肿瘤的生长和随后的转移(22,23). 此外，由上皮性CSF1调节的TAM表达高水平的几种低氧诱导基因(iNOS系统和精氨酸酶-1)反过来，通过阻断细胞毒性T细胞增殖和激活介导抗肿瘤免疫抑制(6,24). 因此，TAM在乳腺肿瘤中的存在和生物活性与其临床活动相对应，进一步表明TAM不仅在促进肿瘤发展，而且在抑制抗肿瘤免疫方面的重要性。

CD4细胞⁺从人类BC分离的T细胞产生高水平的II型辅助细胞（T_H（H）2） 细胞因子包括IL-4和IL-13(25,26)，鉴于研究表明TAMs的几种抑瘤活性受CD4衍生的IL-4调节，这一点具有重要意义⁺T细胞(1,27). 基于这些发现，我们最近报道了CD68的浸润⁺，CD4⁺和CD8⁺人类BC中的免疫细胞可以预测总生存率CD68型到CD8a型在接受新辅助化疗（CTX）的早期BC患者中，肿瘤组织中的mRNA与完全病理反应（pCR）相关(6). 尽管这些特异性免疫细胞类型与BC临床结果之间存在明显的相关性，但肿瘤组织中白细胞复杂性的描述仍然很差，大多数研究依赖于单标记IHC检测。此外，尽管一些研究已经检测了CTX对循环外周血白细胞的存在和功能的影响(28)，有关CTX对肿瘤浸润免疫细胞影响的数据有限(29).

在此，我们评估了主要激素受体阳性患者的乳腺组织中白细胞浸润，这些患者在最终手术前接受或未接受CTX。在CTX-幼稚患者中，我们发现活化的T淋巴细胞构成肿瘤内大多数免疫细胞，而髓系细胞在非邻近正常乳腺组织中占主导地位。相反，新佐剂CTX后残留病患者的肿瘤中浸润的髓样细胞水平较高，同时从T细胞转移到T细胞_H（H）2为主的淋巴细胞反应。

结果

肿瘤组织中T细胞增多。

为了评估人类BC中肿瘤浸润白细胞的组成，通过多色流式细胞术和组织切片中白细胞谱系的IHC检测来评估20名患者的肿瘤，如材料和方法9例浸润性导管癌（IDC）和5例浸润性小叶癌（ILC。从术前接受新辅助CTX治疗（CTX治疗）的患者中采集了6个肿瘤样本，全部为二级或三级IDC。值得注意的是，六个CTX治疗的肿瘤中有三个为HER2/neu阳性，而14个CTX原发性肿瘤中只有一个为HER2阳性，而这两个组的雌激素、孕激素和HER2受体阴性肿瘤的百分比大致相等（三重阴性）。肿瘤病理学的详细信息概述于表S1除来自同侧导管原位癌（DCIS）患者的两次对侧预防性乳房切除术的组织外，还从7例CTX初诊患者和4例CTX治疗患者中获得了同侧非相邻组织，用作“正常”组织。

泛白细胞标记物CD45检测到的免疫浸润在正常组织和肿瘤组织中都存在，但在BC中密度显著增加(图1A类). 通过使用血统标记的组合来鉴定特定亚群来评估白细胞亚群(图S1和S2系列)，这些种群的复杂性如所示图1B类占CD45总数的百分比⁺每个样本中的单元格。CTX初诊患者的BC组织含有以T淋巴细胞为主的浸润（CD3ε⁺)自然杀伤细胞（CD3ε⁻CD56型⁺NKG2D公司⁺)和B淋巴细胞（CD19/20⁺人类白细胞抗原-DR⁺CD3（CD3）⁻). 相比之下，髓系细胞包括巨噬细胞（CD14）^你好CD11b型⁺人类白细胞抗原-DR⁺)，肥大细胞（FcεR1α⁺CD117号⁺CD11b型⁻CD49天⁺)中性粒细胞（CD15⁺CD11b型⁺CD49天⁻)在这些患者的正常组织中更明显。在两次预防性乳房切除术获得的乳腺组织中观察到类似的免疫状况(图1B类).

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图1。

人类乳腺肿瘤的白细胞浸润。(A类)组织切片苏木精和伊红（H&E）染色(左侧)具有代表性的CD45免疫组化(赖特)为每个显示。(B类)人类乳腺肿瘤内白细胞群的流式细胞术分析。结果显示为CD45总量的百分比⁺带有用于定义特定谱系的标记的细胞如下所示。

新佐剂CTX患者残留肿瘤中髓系细胞的增加。

新佐剂CTX后患者残余BC组织的对比分析显示，与CTX初始组相比，髓系细胞百分比存在明显差异。除了一些例外，这种差异包括巨噬细胞在白细胞总数中所占百分比的增加(图2A类)以及通过IHC对组织中CSF1受体（CSF1R）阳性细胞的密度评估(图2B类). 肥大细胞百分比增加(图2C)和中性粒细胞(图2D类)在大多数CTX治疗患者中也很明显，与CTX治疗组相比，CTX治疗的患者增加了约14倍。嗜碱性粒细胞（FcεR1α⁺CD117号⁻CD11b型⁻CD49天⁺;图2E类)在六个CTX处理的样本中，只有一个样本的骨髓树突状细胞（CD11c⁺人类白细胞抗原-DR⁺CD14号机组^洛/-;图2F类)没有变化。对表达CD85g/ILT7的浆细胞样树突状细胞的评估检测到用于分析的事件数量不足。因此，除嗜碱性粒细胞、树突状细胞和CD15外⁺CD11b型⁺CD49天⁺嗜酸性粒细胞（在检测的组织中仅以可检测的水平存在）增加了髓系细胞的存在，这是接受新佐剂CTX治疗的女性残余肿瘤的典型表现。

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图2。

CTX治疗患者的髓系-粒细胞浸润增加。(A类)CD14号机组^你好CD11b型⁺人类白细胞抗原-DR⁺巨噬细胞占总CD45的百分比⁺通过流式细胞术测定的细胞。(B类)CTX肿瘤CSF1R的代表性免疫组化研究(上部)或CTX处理(下部)患者。红色箭头表示放大的插图中显示的单元格。FcεR1α⁺CD117号⁺CD11b型⁻CD49天⁺肥大细胞(C)，CD15⁺CD11b型⁺CD49天⁻中性粒细胞(D类)，FcεR1α⁺CD117号⁻CD11b型⁻CD49天⁺嗜碱性粒细胞(E类)和CD11c⁺人类白细胞抗原-DR⁺CD14号机组^lo/−(F类)DC占总CD45的百分比⁺细胞。N、 非相邻正常；T、 肿瘤。

CD68在人类BC中不是巨噬细胞特异性标记。

巨噬细胞被公认为是小鼠乳腺肿瘤发生的调节器(30)，其中它们可以代表晚期乳腺癌中存在的高达80%的白细胞(1). 在人类BC中，CD68的免疫反应被广泛用于鉴定巨噬细胞，CD68⁺细胞密度与总存活率降低相关(6,11,14,15).

CD68数量高⁺文献中报告的细胞，并显示在图3A类与数量有限的CD14形成对比^你好CD11b型⁺人类白细胞抗原-DR⁺流式细胞术观察BC悬浮液中的巨噬细胞(图1B类和​和2A类).2A类). 为了了解这种差异，我们首先评估了CD68在BC组织切片中的表达，并与CD163（一种血红蛋白清除剂受体，也常用作巨噬细胞的标记物）和CSF1R进行了比较(图3A类). 这一比较分析揭示了三个标记之间的细胞密度缺乏相关性。接下来，我们在免疫荧光检测CD68与CSF1R或CD45联合使用后，通过共焦显微镜评估冷冻BC组织切片(图3B类). 尽管所有表达高水平CSF1R的细胞也表达CD68，但有一个明显的CD68群体⁺既不表达CSF1R也不表达CD45的细胞。CD68与角蛋白无明显共定位⁺上皮细胞，CD31⁺血管周围内皮细胞或表达平滑肌肌动蛋白α的壁细胞(图3C). 该表达与从MMTV-PyMT转基因小鼠分离的小鼠乳腺肿瘤进行了对比(17)，其中CD68⁺细胞同时表达CSF1R和小鼠巨噬细胞标记物F4/80(图S3). 符合历史文献(31,32)因此，这些结果表明CD68在人类BC中不是巨噬细胞特异性标记物。

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图3。

CD68不是人类乳腺肿瘤组织中的特异性巨噬细胞标志物。(A类)CD68在肿瘤中的代表性免疫组织化学(左侧)，CSF1R(居中)和CD163(赖特)CTX治疗患者的连续切片。红色箭头表示放大的插图中显示的单元格。(B类)人乳腺肿瘤CD68（红色）与CSF1R的免疫荧光染色(我和ii（ii）)或CD45(三和iv（四）). （C） CD68（红色）结合泛角蛋白（绿色）的免疫荧光染色；我)或CD31（绿色）和平滑肌肌动蛋白-α（SMA；紫色；ii（ii）).

肿瘤浸润性T细胞表现出激活的表型。

为了揭示浸润BCs的T细胞的表型，我们检测了组织浸润CD4的表面标记物和趋化因子受体的表达⁺和CD8⁺T细胞(图4A类和B类). 具体来说，CD4和CD4⁺和CD8⁺与外周血T细胞相比，T细胞显示活化标记物CD69和HLA-DR的表达增加，而原始T细胞、CD45RA和CCR7的标记物相应减少。此外，尽管所有T细胞组成性表达共刺激受体CD28(图S4A类)，另一种共刺激受体CD27的表达在大部分组织过滤细胞中降低，表明与配体CD70相互作用后脱落(33)效应器功能的潜在获取(34,35). CD4细胞⁺和CD8⁺T细胞还显示出趋化因子受体CCR4和CCR5的表达显著上调(图4B类)，尽管CD8⁺T细胞组成性表达CXCR3，组织过滤CD4⁺T细胞在外周血中表现出较高的CXCR3表达。组织过滤CD4的表面标记表达⁺和CD8⁺在一些样本中，肿瘤组织和良性组织的T细胞有细微差别；然而，这些变化在患者之间，或在CTX治疗组和CTX治疗小组之间并不一致(图S4B类).

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图4。

组织滤过性T细胞表现出激活的表型。(A类和B类)CD3的代表直方图⁺CD4细胞⁺(上部)或CD3⁺CD8（CD8）⁺(下部)从一名CTX治疗患者的正常（蓝色）组织和肿瘤（红色）组织中分离出的T细胞。活化标记CD69的表达(左侧)，HLA-DR(居中左对齐)，CD45RA(居中右对齐)和CD27(赖特)如所示A类和趋化因子受体CCR4的表达(左侧)，CCR5(居中左对齐)，抄送7(居中右对齐)和CXCR3(赖特)如所示B类.

新佐剂CTX后残留肿瘤中淋巴细胞平衡的改变。

虽然我们观察到CD3e的百分比没有差异⁻CD56型⁺NKG2D公司⁺自然杀伤细胞(图5A类)，CD19/CD20水平更高⁺人类白细胞抗原-DR⁺与正常组织和CTX治疗的肿瘤相比，一些CTX原发肿瘤中的B细胞明显。据报道(36)，B细胞与T细胞聚集在一起(图5C). 值得注意的是，CD4⁺T细胞占总CD45的百分比⁺与正常组织和新辅助治疗后残留肿瘤相比，CTX原发肿瘤的患者人数也增加了(图5D类). 作为CD8的百分比⁺T细胞没有变化(图5E类)，CD4的百分比较低⁺CTX治疗组的T细胞导致CD8与CD4比率增加(图5F类). 尽管尚不清楚CD8的密度⁺CTX治疗后残留肿瘤中的细胞增加(图5G公司)在六种CTX治疗的肿瘤中，有两种肿瘤表达颗粒酶B的细胞数量显著(图5H（H）)而在CTX原发性肿瘤中，即使在CD8高表达的区域，也观察到最小颗粒酶B染色⁺T细胞(图5我).

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图5。

CTX治疗肿瘤的细胞毒性T细胞反应改善。CD3ε⁻CD56型⁺NKG2D公司⁺自然杀伤细胞(A类)和CD3ε⁻CD19/20号⁺人类白细胞抗原-DR⁺B细胞(B类)显示为CD45总量的百分比⁺流式细胞术检测细胞。(C)CD20（绿色）和CD3（红色）肿瘤的免疫荧光染色。CD3ε⁺CD4细胞⁺T细胞(D类)和CD3ε⁺CD8（CD8）⁺T细胞(E类)显示为总CD45的百分比⁺细胞。(F类)CD8比率⁺至CD4⁺CTX-naive与CTX-treated肿瘤中的T细胞。CD8-阳性数量(G公司)和颗粒酶B阳性(H（H）)通过自动计数确定每个区域的细胞数。(我)用CTX-naive的CD8或颗粒酶B染色的代表性切片(左侧)或CTX处理(赖特)肿瘤。红色箭头表示放大的插图中显示的单元格。N、 非相邻正常；T、 肿瘤。

尽管CD4的百分比降低⁺CTX治疗患者肿瘤中的T细胞，IHC检测到的表达FoxP3的调节性T细胞密度没有变化(图S5A类)CD3特异性表达⁺CD4细胞⁺肿瘤中的细胞(图S5B类). CD25上的选通^你好细胞，由>80%的FoxP3组成⁺所有测试样本中的细胞，也表明这些细胞的相对百分比在各组之间是不变的(图S5C). 表型，CD4⁺福克斯P3⁺细胞表现出活化的表型，表面水平相当于CD45RO和CD69到CD4⁺福克斯P3⁻细胞和外周血细胞(37)，表达较低水平的CD127(图S5D类). 有趣的是，虽然不是所有的FoxP3⁺细胞表达HLA-DR，它们确实构成了大多数表达HLA-DRCD4的细胞⁺T细胞，以及共存的高水平CD25。

这些数据共同揭示了肿瘤内部向T的转移_H（H）以B细胞和CD4增加为特征的BC 2型反应⁺T细胞与非邻近正常乳腺组织的比较。这种转变在CTX治疗患者获得的肿瘤中得到逆转，更多证据表明细胞毒性T细胞反应通过更有利的CD8/CD4 T细胞比率和增加粒细胞B表达淋巴细胞的存在；因此，即使是对CTX反应不良的患者的残留肿瘤也可能含有更倾向于抗肿瘤T的免疫微环境_H（H）1型免疫反应。

讨论

在此，我们详细描述了一组患有2/3期肿瘤的CTX初发患者与新辅助CTX后有明显残留疾病的患者相比，在BC中评估的白细胞复杂性。T淋巴细胞是CTX初治和CTX治疗肿瘤中的主要人群，几乎完全处于激活状态，这取决于CD69和趋化因子受体的表达增加，同时失去初治标记物CCR7和CD45RA。然而，激活标记物的存在并不能明确证明肿瘤内T细胞具有功能活性。事实上，颗粒酶B在CTX幼稚患者的肿瘤中表达最低，这表明浸润CD8的细胞毒性活性可以忽略不计⁺T细胞。相比之下，颗粒酶B在三分之一经CTX治疗的肿瘤中高表达，这表明接触CTX后，某些肿瘤中的细胞毒性T细胞反应更强。

重要的是，CTX治疗患者的残留肿瘤中B细胞和CD4的百分比也降低了⁺T细胞。肿瘤滤过性CD4⁺已知BC中的T细胞表达T_H（H）2种细胞因子IL-4和IL-13与IFN-γ的产生(25,26)与CXCR3和CCR4的共表达一致(38,39)正如我们在这里观察到的。CD4是否产生细胞因子还有待确定⁺新佐剂CTX改变T细胞；然而，CD4和CD4的联合减少⁺T细胞和B细胞表明从T细胞_H（H）2微环境。这种转变可能与TAM功能有关，如MMTV-PyMT模型所述，其中TAM由IL-4编程为T_H（H）2表型(1)最近，在治疗胰腺导管腺癌时，激动剂CD40单克隆抗体促进了巨噬细胞的细胞溶解活性(40).

尽管淋巴细胞浸润程度与患者亚群预后的改善有关(2,三)，CTX后带pCR(41,42)，关于单个淋巴细胞亚群与存活之间关系的信息有限。高FoxP3计数与雌激素受体（ER）阳性肿瘤的总体生存率和无复发生存率降低相关(43)新佐剂CTX的pCR与FoxP3分级降低相关(44,45). 虽然两项通过流式细胞术检测T细胞浸润的研究发现CD8:CD4比率和淋巴结转移的结果相互矛盾(46,47)，CD8的数量⁺组织内的T细胞与患者生存率的提高有关(48). 我们还报道了CD68/CD4/CD8免疫标志物预测总生存率和无复发生存率，当与其他标记物联合使用时，CD4明显呈负相关(6). 因此，迫切需要进行额外的前瞻性研究，评估淋巴细胞浸润和功能的多个参数，以确定预测结果和指导特异性治疗的最重要的生物标志物比较。

尽管在多项研究中成功地将TAM浸润与临床相关结果联系起来，但我们的结果表明，鉴于多个基质细胞表达巨噬细胞，并且其中一部分为CSF1R-和CD45-阴性，仅CD68无法准确评估人类乳腺组织中巨噬细胞的存在。我们观察到非白细胞CD68⁺细胞主要位于肿瘤基质内，因此，根据这种定位和形态学，我们推测CSF1R⁻CD68型⁺细胞可能反映肿瘤相关的成纤维细胞或单核细胞衍生的纤维细胞，与其他报告一致(31,32,49–52). 我们的发现并没有使CD68作为临床相关标记物无效，重要的是，已经在乳腺腺癌中确定了CSF1-反应基因特征，这些特征可以预测复发风险和转移(53,54). 然而，鉴于成纤维细胞（可能还有纤维细胞）在促进肿瘤发生方面发挥的重要作用(55–57)，在肿瘤内的巨噬细胞、成纤维细胞和其他基质人群之间进行区分，有可能提高目前通过CD68免疫检测产生的诊断信息。

正如我们报告的csf1信使核糖核酸(6)，多个编码髓系细胞趋化因子的基因在人类BC细胞系中有差异表达，这些基因对CTX的反应不同(图S6). 尽管与BC特定亚型对应的细胞系之间的差异表达是明显的，但这些细胞系能否准确地代表BC肿瘤组织的反应值得怀疑；因此，我们正在研究骨髓细胞浸润的差异是否反映了BC的不同分子亚型，以及CTX治疗患者残余肿瘤的差异程度。

重要的是要承认，鉴于已知对CTX诱导的细胞死亡的免疫反应，对CTX有反应的肿瘤内的白细胞组成可能与接受过CTX的患者的残余或复发肿瘤有很大不同(28). 然而，我们最近报道，在MMTV-PyMT小鼠的乳腺癌中，阻断对TAM募集至关重要的CSF1-CSF1R通路可以通过CD8改善CTX的反应⁺T细胞依赖效应(6). 因此，尽管本文的研究结果基于一个异质性肿瘤亚型的小数据集，但我们的结果可能会有偏差，因为在CTX治疗组中，样本选择倾向于CTX反应较大和/或较低的肿瘤，CTX-naive肿瘤和CTX-treated肿瘤之间的髓系结构的明显差异具有挑衅性，这表明CSF1靶向策略可能是一种有希望的方法，可以提高细胞毒CTX的治疗效果，尤其是对于难治性BC的治疗。此外，考虑到对CTX耐药的肿瘤中粒细胞数量的增加，以及这些细胞参与调节慢性炎症疾病的免疫反应(58–62)，这些人群也可能在功能上相关，靶向肿瘤微环境中常见的免疫抑制途径可能提供额外的治疗机会，以提高新佐剂CTX的疗效。

材料和方法

手术时，根据机构审查委员会的批准，从旧金山加利福尼亚大学的同意患者处收集组织。肿瘤和同侧非相邻的正常组织由经认证的病理学家（a.a.）收集，并在切除当天进行分析。巨噬细胞和CD8的百分比⁺据报道，这里描述的一部分患者的T细胞(6). 如前所述进行流式细胞术、免疫组织化学和免疫荧光(6)，详细方法包含在SI材料和方法，以及中可用的抗体列表表S2和第3章使用Student’s吨通过Prism 4.0软件（GraphPad软件）进行测试。

补充材料

致谢

脚注

工具书类