胰腺导管腺癌（PDA）仍然是一种几乎普遍致命的疾病；化疗对非手术患者提供的最佳支持性治疗的益处微乎其微(1). 我们之前已经证明，白细胞主动浸润PDA的基质室，即使在肿瘤发展的早期阶段，也会引起免疫抑制的免疫反应(2). 在这项研究中，我们研究了这种免疫抑制的可逆性，最初假设这样做会释放肿瘤特异性细胞免疫来消除PDA。肿瘤坏死因子（TNF）受体超家族成员CD40的激活已被证明是T细胞依赖性抗肿瘤免疫发展中的一个关键调节步骤，该免疫依赖于CD40介导的抗原呈递细胞（APC）的“许可”来启动和激活肿瘤特异性T细胞(3–8).
基于这一前提，我们在人和小鼠身上研究了用激动剂CD40单克隆抗体（mAb）激活系统性CD40是否可以绕过肿瘤诱导的免疫抑制，并在PDA中激活T细胞依赖的生产性抗肿瘤免疫。我们首先通过对全人类激动剂CD40单克隆抗体CP-870893进行临床试验来评估CD40活化的临床影响(9)联合吉西他滨化疗（2′-脱氧-2′，2′-二氟胞苷）治疗化疗初发、手术无法治愈的PDA患者(10). 我们用吉西他滨测试了CP-870893，因为在激动剂CD40单克隆抗体之前进行化疗可以促进APC增强肿瘤抗原提呈(11–14). 21名患者（90%患有转移性疾病）在第1天、第8天和第15天每周接受吉西他滨治疗，在每个28天周期的第3天给予CP-870893(图S1). 治疗总体耐受性良好(图S2)最常见的副作用是轻度至中度细胞因子释放综合征，特征是在CP-870893输注当天出现寒战、发热、僵硬和其他症状。症状是暂时的（<24小时），在门诊部接受支持治疗。
使用两种标准模式评估治疗对原发性和转移性病灶的影响：（i）[18F] 2-氟-2-脱氧-D-葡萄糖（FDG）在正电子发射断层扫描-计算机断层扫描（PET-CT）上的亲和力作为治疗靶向生物效应的测量，以及（ii）用于实体瘤反应评估标准（RECIST）评估的CT成像。在两个疗程后评估的88%患者中，通过FDG–PET-CT观察到原发性和代谢性病变的代谢反应(图S3). 通过RECIST，21名患者中有4名出现部分缓解（PR），11名患者病情稳定（SD），4名患者病情进展（PD）(). 两名患者在肿瘤反应研究中未进行评估。其中一名患者（患者10031010）因4级脑血管意外，在服用一剂CP-870893后退出了研究方案，但神经功能恢复，仅重新开始服用吉西他滨并获得PR。第二名患者（病人10031001）因疾病进展出现临床恶化，未获得治疗后的CT图像。21例患者中位无进展生存期（PFS）为5.6个月（95%可信区间，4.0个月不可估计），中位总生存期（OS）为7.4个月，95%可信区间为5.5-12.8个月。PFS和OS的中位数基于截至2010年8月25日的中期数据，21名患者中有6名存活。单用吉西他滨的历史肿瘤缓解率为5.4%，中位PFS为2.3个月，中位OS为5.7个月(1). 因此，CP-870893和吉西他滨对转移性PDA患者显示出治疗效果。
激动剂CD40单克隆抗体联合吉西他滨可诱导手术无法治愈的PDA患者的临床反应。(A类)肿瘤靶病变测量中与基线相比的最佳总体变化百分比如瀑布图所示*患者10061001因出现新的非靶向病变而被定义为PD**患者10031001在服用一剂CP-870893后，由于疾病进展导致临床恶化，因此未获得治疗后扫描***患者10031010在服用一剂CP-870893后退出研究，但再次单独服用吉西他滨并获得PR(B类)在基线检查和第3周期结束时获得的CT图像。原发性胰腺肿瘤和两个转移性肝脏病灶用箭头标记，并标注了最长的尺寸。(C类)活检转移病灶[来自患者10031016（左）]和手术切除的原发性胰腺病灶[来自于患者10061003（右）]的组织病理学。患者10031016在完成四个疗程后进行了肿瘤活检；患者10061003在12个疗程后接受了原发肿瘤的手术切除。箭头（左）表示在广泛的肿瘤坏死中巨噬细胞占主导地位的炎症浸润。箭头（右）表示无淋巴细胞的多形核浸润细胞；箭头标记肿瘤细胞。比例尺，50μm。
一名PR患者的原发性胰腺病变减少了46%，7.6厘米的肝转移完全消失，剩下的一个肝转移减少了47%(). 经过四个疗程的治疗后，经活检，这个剩余的肝脏病变没有显示出活的肿瘤。相反，我们观察到坏死和以巨噬细胞为主的浸润，但没有淋巴细胞(). 第二名PR患者在所有肝转移灶完全消退，原发胰腺病变减少64%后，接受原发肿瘤的手术切除。对切除的原发病灶进行组织学分析，发现细胞浸润，无淋巴细胞(). 根据植入式肿瘤模型的结果，这种没有淋巴细胞浸润的肿瘤退化是意料之外的，CD40诱导的抗肿瘤活性依赖于T细胞(6–8). 因此，为了了解CD40介导的肿瘤退行性变的机制，我们求助于PDA的自发小鼠模型。
PDA的KPC模型是一种基因工程小鼠模型，融合了两种突变体的条件表达喀斯特G12D系列和第53页172H兰特胰腺细胞中的等位基因(15). 因为免疫活性KPC小鼠自发发展为PDA肿瘤，显示出与人类PDA的组织病理学和分子特征高度吻合(15)KPC模型被认为与了解患者的治疗机制有关(16,17). 因此，我们在首次输注吉西他滨48小时后，每周用激动剂CD40 mAb FGK45评估吉西他宾的治疗效果，从而在KPC小鼠中建立了我们的临床研究模型。三维超声监测肿瘤反应(图S4) (10). 我们发现FGK45与吉西他滨联合使用可使30%的小鼠肿瘤消退()与我们患者的客观反应率相似。单独使用FGK45治疗导致相同的肿瘤消退率，而单独使用吉西他滨则没有().
激动剂CD40单抗在KPC小鼠中的抗肿瘤活性与T细胞无关。(A类)在第0天和第7天用吉西他滨或磷酸盐缓冲盐水（PBS）治疗KPC小鼠，在第2天给药对照IgG2a或FGK45。接受FGK45治疗的KPC小鼠的队列中也缺乏CD4+或CD8+CD4细胞或两者+和CD8+分别在-1、0、1、3、7和10天使用GK1.5和2.43抗体的细胞。每只小鼠从第-1天（基线）到第+14天肿瘤体积的百分比变化显示为瀑布图（与PBS+IgG2a、吉西他滨+FGK45相比：P（P）< 0.05; 吉西他滨+IgG2a：P（P）= 1.00; PBS+FGK45：P（P）< 0.05; FGK45+GK1.5：P（P）< 0.05; FGK+2.43：P（P）< 0.05; FGK45+GK1.5+2.43：P（P）< 0.05; 费希尔精确测试）。苏木精和伊红（H&E）组织学[（B）至（E）]和CD3免疫组织化学[（F）至（I）]显示了用IgG2a治疗的KPC小鼠的肿瘤(B类和F类)或FGK45(C类到E类和G公司到我). 响应者（D）、（E）、（H）和（I）被定义为FGK45治疗的小鼠，其通过超声分析显示肿瘤消退。FGK45治疗的小鼠经超声检查肿瘤进展被定义为无反应（C）和（G）。比例尺，50μm。
CD40通路的激活是肿瘤特异性T细胞免疫发展的关键事件(18). 为了测试CD40免疫治疗是否依赖T细胞激活，我们检测了从KPC小鼠脾脏和胰腺（包括肿瘤和胰周淋巴结）分离的T细胞的功能。用FGK45治疗7天后，CD4和CD4+和CD8+KPC小鼠的T细胞分泌细胞因子的能力增强，包括干扰素-γ（IFN-γ）和白介素IL-17A(图S5A); 然而，在缺乏CD4的KPC小鼠中，FGK45诱导了相同的肿瘤消退率+或CD8+细胞或CD4两者+和CD8+单元格(). 考虑到CD40活化与生产性抗肿瘤T细胞免疫的发展之间已建立的联系，这是出乎意料的(6–8). 在第14天，与无应答动物相比，应答动物的肿瘤组织病理学外观大体相似，但应答动物的瘤较小(). CD3（CD3）+在基线检查时或用FGK45治疗后的任何时候，在KPC小鼠中均未观察到T细胞浸润肿瘤(). 相反，CD3+T细胞仍局限于靠近肿瘤发展的胰周淋巴结(). 此外，当整个胰腺与胰周淋巴结整块切除时，CD3+治疗前后T细胞的频率没有变化(图S5、B和C). 因此，CD40通路的激活不会触发T细胞渗入肿瘤，并且不足以在KPC模型中诱导生产性抗肿瘤T细胞免疫。
CD40在广泛的白细胞上表达，包括单核细胞、组织巨噬细胞、B细胞和树突状细胞，也可以在一些肿瘤上发现(19). 通过免疫组织化学，我们发现PDA细胞呈CD40阴性，而肿瘤基质中的细胞表达CD40，尤其是F4/80+肿瘤相关巨噬细胞(图S6). 因此，我们研究了CD40免疫治疗对F4/80的影响+KPC小鼠的巨噬细胞。在给药18小时内，FGK45诱导外周血中巨噬细胞的短暂耗竭，随后在脾脏中积聚(图S7、A和B). 为了测试CD40单克隆抗体是否首先与外周血巨噬细胞上的CD40结合，然后再迁移到组织中，我们比较了FGK45和RB6-8C5的生物分布，RB6-8C6是一种单克隆抗体，用作对照，对外周血粒细胞和未成熟髓细胞上表达的Gr-1具有特异性(图S7、C和D). 全身服用RB6-8C5，Gr-1后2至10分钟内+发现外周血中的细胞被抗体包裹(图S8A). 相反，F4/80细胞表面未发现FGK45+外周血巨噬细胞(图S8A)FGK45与CD40结合后也没有内化(图S8B). 相反，在10分钟时，观察到FGK45与KPC小鼠脾脏、淋巴结和胰腺内的白细胞结合(图S9A). 在肿瘤微环境中，FGK45最初被发现定位于胰周淋巴结()而不是肿瘤()与RB6-8C5相反，RB6-8C6在治疗后10分钟就将肿瘤周围的白细胞结合在一起(). 18小时时，观察到FGK45与F4/80结合+巨噬细胞浸润肿瘤而非淋巴结(; 和图S9、B和C). 在肿瘤微环境中，FGK45与白细胞的结合发生在细胞簇中，而不是扩散。我们观察到FGK45治疗后胰腺中巨噬细胞的频率没有变化(图S10). 为了确定FGK45在肿瘤浸润前是否与巨噬细胞结合，我们用氯膦酸盐包封脂质体（CEL）治疗KPC小鼠，以耗尽系统巨噬细胞(图S11A). 由于脂质体不能穿过毛细血管壁产生的血管屏障，CEL不能扩散到组织中(20)因此，不会耗尽肿瘤内的巨噬细胞(图S11，B至E). 然而，当KPC小鼠接受CEL治疗时，在肿瘤中无法检测到FGK45标记()尽管CD40持续存在+肿瘤内的巨噬细胞。这些发现支持FGK45在巨噬细胞迁移到肿瘤之前与巨噬细胞结合的假设。
激动剂CD40单克隆抗体在肿瘤浸润前以系统巨噬细胞为靶点。免疫组织化学用于定量白细胞浸润（A）至胰周淋巴结(A类,B类，以及F类)和KPC肿瘤(A类,C类,D类,E类，以及G公司)通过用针对大鼠IgG的生物素化山羊抗体染色以检测在处理后10分钟（a）至（D）或18小时（a）和（E）至（G）结合到细胞的FGK45或RB6-8C5。在FGK45处理（A）和（G）之前，用CEL耗尽巨噬细胞。LN，胰周淋巴结；T、 肿瘤；标尺，50μm。（A）中的误差条表示SD(H（H）)热图显示了使用对照IgG2a与FGK45治疗3天后，单个KPC小鼠肿瘤相关巨噬细胞（柱）的流式细胞术分析细胞表面分子（行）的表达。（顶部）具有表面分子表达的肿瘤相关巨噬细胞的百分比。（底部）平均荧光强度是指与平均值的标准偏差数，这是通过使用对照IgG2a治疗确定的。P（P）值基于学生的吨测试；nd，未确定。
巨噬细胞根据其表型可以促进或抑制肿瘤进展(21,22). 在没有任何治疗的情况下，我们发现肿瘤相关巨噬细胞被激活，能够分泌IL-10、TNF-α和IL-6，但与荷瘤KPC小鼠和正常窝友的脾巨噬细胞相比，MHC II类分子的表达降低(图S12). FGK45治疗后，KPC肿瘤和荷瘤KPC小鼠脾脏中的巨噬细胞上调MHC II类和共刺激分子CD86，表达水平在第3天达到峰值，7天后恢复到基线水平(，以及图S13和S14). 这些变化与FGK45治疗后第1天细胞因子激增相一致，KPC动物的血清IL-12、TNF-α和IFN-γ水平升高，但IL-10水平没有升高(图S15).
为了确定巨噬细胞是否是CD40介导的肿瘤消退所必需的，我们用CEL耗尽KPC小鼠的系统巨噬细胞。CEL治疗使FGK45诱导肿瘤消退的能力减弱(). 用FGK45裂解的肿瘤细胞在体内治疗荷瘤KPC动物胰腺中分离的巨噬细胞(). 这一发现与FGK45治疗后18小时肿瘤局部区域裂解caspase 3表达的体内观察相关(). 治疗后的这个时候，肿瘤间质和相关纤维化区域似乎正在退化(). 这些区域显示I型胶原含量减少，与肿瘤基质降解一致(). 在使用CEL耗尽系统巨噬细胞的KPC小鼠中，FGK45治疗未能诱导基质降解(). 这些发现确定了一种新的机制，通过靶向参与癌症炎症的肿瘤浸润巨噬细胞，CD40通路可以在治疗上被利用以恢复肿瘤免疫监视。
CD40激活的肿瘤浸润巨噬细胞介导肿瘤消退。(A类)KPC小鼠接受对照IgG2a、FGK45或FGK45治疗，并通过CEL去除系统巨噬细胞。所示为瀑布图，显示了从基线检查到第+14天肿瘤体积的百分比变化（与IgG2a、FGK45相比：P（P）< 0.05; FGK45+CEL：P（P）= 1.00; 费希尔精确测试）。(B类)80层/四层+从用FGK45（蓝色方块）或对照IgG2a（绿色圆圈）处理并与KPC衍生肿瘤细胞株孵育的KPC小鼠中分离出肿瘤相关巨噬细胞。通过7-氨基放线菌素D（7-AAD）标记和24小时流式细胞仪分析测定体外肿瘤细胞死亡。所示为来自两个独立实验的代表性分析，每个实验一式三份。描述了平均值±SD*P（P）<0.05，学生的吨测试。(C类)在用对照IgG2a（顶部面板）或FGK45（底部面板）治疗18小时后，通过免疫组织化学方法检测KPC肿瘤上裂解caspase 3的表达。（D） 至（L）KPC肿瘤在用对照IgG2a治疗后18小时进行分析(D类,F类，以及H（H）)，FGK45(E类,G公司，以及我)或FGK45+CEL(J型,K（K），以及L（左）). 图示为苏木精和伊红组织学（D，E，J）；Masson’s三色染色显示蓝色细胞外基质[（F）、（G）和（K）]，免疫组化显示I型胶原[（H）、（I）和（L）]。比例尺，50μm。
PDA是一种常见的、毁灭性的、高致死性的肿瘤，迫切需要新的治疗方法。我们的研究结果确定了CD40通路在通过肿瘤相关巨噬细胞的再培养来调节与PDA相关的免疫反应和纤维化中的先前未被重视的作用。从机制上讲，CD40激动剂改变了肿瘤基质，并且在小鼠和人类中都显示出对抗PDA的疗效。虽然以前曾描述过抑制肿瘤的巨噬细胞(22)，其作用在很大程度上与T细胞抗肿瘤免疫的协调有关。在这项研究中，CD40活化本身不足以激活生产性抗肿瘤T细胞免疫，我们假设CD40活化后T细胞免疫在PDA中的充分参与将需要调节额外的肿瘤和宿主因子或加入新疫苗(23). 我们的研究结果强调，肿瘤免疫监测有时可以严格由CD40通路调节下的先天免疫控制，并支持针对肿瘤微环境中炎症细胞和基质的新兴治疗策略的持续发展。
