CD127表达与FoxP3和人CD4的抑制功能呈负相关⁺T调节细胞

新型T调节细胞特异性细胞表面分子的分析

为了确定与T reg细胞功能和表型相关的其他细胞表面标记，进行微阵列分析，比较CD4表达的mRNA⁺CD25型^你好带有CD4的T细胞⁺CD25型^否定从健康供体PBMC分离的T细胞。从三名献血者中制备mRNA，并在Affymetrix U133A基因芯片上制备和测试cRNA。分类参数基于已发表的研究，其中CD4的前1–2%⁺CD25型⁺T细胞被选为T调节细胞亚群的原型(16,37). 在两个亚群之间存在差异的基因中，CD4中IL-7R（CD127）的表达水平低2.4倍⁺CD25型^你好T细胞与CD4的比较⁺CD25型^否定T细胞。为了证实这一发现，从三个独立的CD4中分离出mRNA⁺CD25型^你好和CD4⁺CD25型^否定用实时定量PCR（qPCR）检测T细胞制剂。CD127 mRNA的表达与CD25的表达呈负相关。事实上，CD4的表达水平低3.14⁺CD25型^你好T细胞与CD4的比较⁺CD25型⁻T细胞（范围：2.26–4.21倍）。

正如基因表达研究预测的那样，大多数CD4⁺CD25型⁺细胞，尤其是CD4⁺CD25型^你好T细胞CD127低表达(图2 a). 然而，并不是所有的CD4⁺CD127型^lo/−T细胞为CD25⁺事实上，CD4的显著百分比⁺CD127型⁻T细胞（该个体中15.8%）为CD25阴性。也就是说，大多数CD4⁺CD25型⁻T细胞为CD127明亮型（73.8%），占基因阵列分析中观察到的差异表达。更重要的是，流式细胞术对CD127阳性和阴性T细胞亚群中FoxP3的表达进行分析，结果表明⁺CD127中有T细胞^lo/–T细胞亚群(图2b). 有趣的是，CD127的相对表达与FoxP3呈负相关，FoxP3-CD4表达最高⁺表达最低水平CD127的T细胞。这些结果在检查的20多个个体中得到了一致的观察。

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图2。

FoxP3在不同CD4上的表达⁺CD127型^+/−人类T细胞亚群。（a） 从人外周血中采集PBMC，用CD4、CD25、CD127以及FoxP3特异性单克隆抗体进行细胞内染色，然后在Becton-Dickinson FACSCalibur上进行分析。（b） 对人PBMCs进行CD4和CD127细胞表面表达染色。将染色细胞固定并在细胞内进行FoxP3染色。为了进行分析，PBMC在淋巴细胞上进行门控（基于正向和侧向光散射），并分析CD127和FoxP3的表达。点图中的数字表示表达相关标记的门控细胞的百分比。数据代表了20多个独立个体和10多个实验。

在小鼠中也观察到类似的结果。CD4细胞⁺对FoxP3-GFP敲除小鼠分离的T细胞进行CD127染色(36,38). 绝大多数小鼠CD4⁺福克斯P3⁺T细胞为CD127^lo/−(图3 a). 对这些小鼠的进一步分析表明，CD4⁺CD25型⁺福克斯P3⁺T细胞为CD127^lo/−然而，与人类一样，CD127是一个比CD25更好的标记物，因为所有CD4⁺T细胞为CD127^lo/−独立于CD25表达(图3b).

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图3。

FoxP3在不同CD4上的表达⁺CD127型^+/−小鼠T细胞亚群。对小鼠脾脏和淋巴结细胞进行CD4和CD127细胞表面表达染色。为了进行分析，对FoxP3-GFP小鼠的脾细胞进行淋巴细胞门控（基于正向和侧向光散射），并分析CD127和FoxP3（GFP）的表达。点图中的数字表示表达相关标记的门控细胞的百分比。象限中的字母A和B代表灰色粗实线（底部）。（b） 对从FoxP3转基因小鼠分离的脾脏和淋巴结细胞进行CD4、CD25和CD127的细胞表面表达染色。为了进行分析，脾细胞在CD4上进行了门控⁺淋巴细胞（基于正向和侧向光散射）并分析CD127和FoxP3的表达。点图中的数字表示表达相关标记的门控细胞的百分比。象限中的字母A、B和C表示虚线、细实线和粗实线（底部）。

利用多参数流式细胞术进一步研究CD4、CD127、FoxP3和CD25之间的关系(图4). 绝大多数CD4⁺CD25型⁺CD127型^低/−T细胞表达FoxP3（该个体中94%）(图4a). 然而，CD4的显著百分比⁺CD25型⁻CD127型^lo/−细胞也是FoxP3⁺（该个体为35%），尽管平均荧光通常小于CD4⁺CD25型^你好细胞。与此形成鲜明对比的是，FoxP3很少⁺CD4中的T细胞⁺CD127型⁺除表达CD25的人群中的一小部分外(图4b). 有趣的是，CD4的回馈⁺CD127型⁺福克斯P3⁺亚群显示CD25在这些T细胞中的表达是中间的，与CD25不同^你好该子集被描述为“经典”T调节细胞（未发表的数据），表明它们可能是一个过渡细胞。最后，值得注意的是，在这个个体中（这是大多数受试个体的代表），FoxP3的显著百分比⁺CD4中的T细胞⁺CD25型⁻CD127型^lo/−T细胞亚群。反转录显示这些细胞位于CD25内^整数人口（未发布的数据）。从10名健康供体获得的PBMC中，先对CD4、CD127、CD25的细胞表面表达进行染色，然后用FoxP3特异性单克隆抗体进行细胞内染色，也观察到类似的结果(图4c和表一). 对多人的检查证实，大多数CD4⁺福克斯P3⁺T细胞位于CD25内⁺CD127型^低/−子集；然而，在一些个体中，CD25的显著百分比⁻CD127型^lo/−和/或CD25⁺CD127型⁺T细胞为FoxP3⁺如中所示表一，约占CD4的40%⁺CD127型^lo/−细胞为FoxP3⁺相比之下，只有2.5%的CD4⁺CD127型⁺值得注意的是，CD4平均>85%⁺CD25型⁺CD127型^lo/−细胞为FoxP3⁺因此，CD127是一种比CD25更好的细胞表面标记物，用于识别CD4⁺福克斯P3⁺T细胞；然而，细胞表面标志物的最佳组合是CD4⁺CD25型⁺CD127型^低/−占FoxP3的约80%⁺取决于个人。因此，CD4的广泛门控策略⁺CD25型⁺CD127型^lo/−产生高纯度FoxP3⁺T细胞群与其他亚群的比较(图4b).

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图4。

FoxP3在不同CD4上的表达⁺T细胞亚群。（a） 对人PBMC进行CD4、CD25和CD127细胞表面表达染色。将染色细胞固定并在细胞内进行FoxP3染色。为了进行分析，PBMC通过CD4进行门控⁺淋巴细胞（基于正向和侧向光散射和CD4染色），并分析CD127和FoxP3的表达。方框代表CD25的任意名称⁺与CD25相比⁻细胞。直方图中的数字表示表达相关标记的门控细胞的百分比。（b） 对人PBMC进行CD4、CD25和CD127细胞表面表达染色。将染色细胞固定并在细胞内进行FoxP3染色。为了进行分析，对PBMC进行淋巴细胞门控（基于正向和侧向光散射），并分析CD4、CD25、CD127和FoxP3的表达。方框代表CD127的任意名称⁺与CD127相比^lo/−细胞。点图中的数字表示表达相关标记的门控细胞的百分比。（c） 对从10个健康个体获得的全血进行类似的染色和分析。每个符号代表一个人，窄条代表FoxP3的平均百分比⁺CD4上的T细胞⁺基于CD25和/或CD127表达的T细胞门控。

FoxP3与CD127相互作用的ChIP-ChIP分析

数据清楚地显示了FoxP3表达和CD127下调之间的“一般”关系。然而，我们发现FoxP3和CD127蛋白之间存在明显的负相关(图2b). 这些结果表明，转录因子FoxP3和CD127转录之间可能存在直接的结构关系。鉴于之前的研究表明FoxP3抑制基因表达，这一点尤其有吸引力(39). 转录因子结合基因组DNA的染色质免疫沉淀（ChIP）和富含IP的DNA的微阵列杂交（芯片）是一种新的技术，可以在全基因组范围内分析转录因子结合。ChIP-ChIP数据不同于通过测量mRNA水平获得的经典微阵列基因表达数据，因为它们检查基因转录的直接控制，而不仅仅是潜在的间接下游调节。我们对抗CD3/抗CD28–扩增CD4进行了ChIP-ChIP实验⁺CD25型^你好人类T调节细胞(37). 使用抗-FoxP3或对照兔Ig从核裂解物中沉淀交联蛋白-DNA复合物。去除免疫沉淀材料的交联并进行蛋白酶处理，纯化和扩增DNA。使用GeneChip Human Tiling 1.0R Array Set（Affymetrix 900774）将所得材料与整个基因组杂交，以确定FoxP3结合位点的位置。进行统计分析以确定与FoxP3蛋白而非兔Ig选择性相关的位点。IL-7R启动子区域在FoxP3蛋白免疫沉淀物结合的各个位点中进行评分（未公布数据）。通过qPCR证实CD127启动子结合。将跨越CD127启动子区的寡核苷酸引物用于CD4的抗FoxP3免疫沉淀DNA⁺CD25型^你好人类T调节细胞(图5). 与特异性位于IL-7R启动子区域的兔Ig免疫沉淀物相比，从抗FoxP3免疫沉淀物质扩增的CD127 DNA富集程度很高，但基因组上该区域周围的其他DNA序列没有富集。这些数据支持FoxP3对CD127的直接调节。

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图5。

CD4细胞FoxP3结合DNA的ChIP芯片和ChIP-qPCR分析⁺CD25型^你好人类T调节细胞。使用抗FoxP3或对照兔Ig从扩张的CD4沉淀交联蛋白-DNA复合物⁺CD25型^你好人类T调节细胞裂解。去除免疫沉淀材料的交联并进行蛋白酶处理，纯化和扩增DNA。使用GeneChip Human tiling 1.0R阵列集将所得材料与整个基因组杂交，以确定FoxP3结合位点的位置。在hs上生成了两组曲线图：FoxP3 IP与Ig对照，FoxP3IP与输入DNA。NCBIv35版本的基因组基本上遵循了考利等人（参考文献50). （a） IL-7R位点的信号富集图（chr5:35863179-35918811）。IL-7R基因座中的几个区域被预测为阳性（chr5:358952564-35892809启动子）和阴性（chr5:3589601835890846 2K上游；chr5:359077667-35907852内含子4；chr5:35911721-5911888内含子7和外显子8）。（b） IL-7R染色体区域的SYBR绿色qPCR。FoxP3 IP与IgG倍体富集率由实时PCR评估的重复ChIP试验测定。

不同CD4对异基因混合淋巴细胞反应（MLR）的抑制作用⁺T细胞亚群

尽管CD127的低表达与FoxP3的表达相关，但一些研究质疑FoxP3是否始终是人类T调节细胞的标记物。因此，我们检测了CD4的能力⁺CD25型⁺CD127型^lo/−T细胞和其他亚群抑制异基因MLR。根据CD127、CD25和CD4表达将PBMC分为四个亚群。首先，我们检测了单个亚群对异基因APC的反应能力。如图所示图6如前所述，CD4⁺CD25型^你好当用同种异体抗原刺激时，T细胞亚群无反应，这与这些细胞是FoxP3的事实一致⁺组成“经典”T调节细胞亚群。类似地，CD127^lo/−子集，CD25⁺或CD25⁻CD4细胞⁺T细胞或大量CD4⁺CD127型^lo/−T细胞在异基因MLR中有反应，这表明与CD4类似⁺CD25型^你好T细胞，这些细胞是无能的(37). 相反，CD4⁺CD127型⁺T细胞亚群对同种异体抗原反应正常，与文献一致，表明这些细胞代表原始和记忆性T细胞亚组(32,34,40). 当用抗CD3和抗CD28刺激细胞时，也观察到了类似的结果（未发表的数据），这表明与“经典”T reg细胞亚群一样，表达FoxP3的细胞是无能的。接下来，将不同亚群添加到异基因MLR中，并比较其抑制T细胞增殖的能力。CD4⁺CD127型^lo/−CD25型⁺T细胞亚群对MLR的抑制作用与CD4相同或更好⁺CD25型^你好T细胞(图7). 这很重要，因为该亚群代表至少三倍以上的CD4⁺包括CD25中间亚群和阴性亚群的T细胞。因此，CD127不仅仅是CD4的另一个标记⁺CD25型^你好T调节细胞，但允许识别和分离更具包容性的抑制性T细胞亚群。事实上，抑制活性与CD25无关，因为CD4⁺CD127型^lo/−CD25型⁺和CD4⁺CD127型^lo/−CD25型⁻T细胞亚群抑制MLR，尽管在多项研究中CD4⁺CD127型^lo/−CD25型⁺T细胞比CD4更有效地抑制反应⁺CD127型^低/−CD25型⁻T细胞亚群，尤其是在较低的T调节细胞：T应答者比率下。这些结果与FoxP3表达的百分比和水平较低一致⁺T细胞亚群中的细胞。CD127都不是⁺细胞可重复抑制MLR(n个= 9). 这些结果表明CD127是一个足够的标志物来定义CD4⁺T细胞亚群。为了直接证明这一点，PBMC仅根据CD4和CD127的表达进行分类，并在异基因MLR中进行检测。CD4⁺CD127型^lo/−T细胞亚群无反应(图6)和CD4一样有效地抑制MLR⁺CD127型^lo/−CD25型⁺或CD4⁺CD25型^你好T细胞(图7 b).

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图6。

孤立T细胞亚群的增殖反应。根据CD4、CD127和CD25的表达对软毛样本进行分类。将30000个分选好的细胞与同种异体抗CD3耗尽、辐照的第三方PBMC作为刺激物进行培养。T细胞在37°C和5%CO中培养7天₂.孵育结束前16 h，1μCi^三向每个孔中添加H-胸苷。采集平板并分析数据。数据代表了九个单独的实验。

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图7。

单个T细胞亚群抑制异基因MLR。根据CD4、CD127和CD25的表达对软毛样本进行分类。30000个分选细胞与100000个自体PBMC联合作为应答者，100000个异基因抗CD3耗尽的辐照第三方PBMC作为刺激剂。将T细胞在37°C、5%CO中孵育7天₂.孵育结束前16 h，1μCi^三向每个孔中添加H-胸苷。采集平板并分析数据。对CD4的七个不同亚群进行分类的九个单独实验的数据代表⁺细胞显示（a）CD127⁺CD25型⁺，CD127⁺CD25型⁻，CD127^lo/−CD25型⁺，CD127^lo/−CD25型⁻和（b）CD127^lo/−，CD25^你好，CD127⁺每个井中有100000个响应者，与单独的已分类细胞相比，已分类细胞的数量以1:1的比率（30000:100000）、1:1/2（15000个已分类细胞）、1:1/4（7500个已分类电池）、1:1/16（1875个已分类的细胞）增加。结果以每分钟计数（CPM）表示。

学科。

共对16例长期T1D患者进行了研究。患者（年龄范围16-56岁，平均年龄34岁，病程>5年）从芭芭拉·戴维斯儿童糖尿病中心招募。T1D的诊断主要是通过儿童期存在生化自身抗体或伴有酮症的高血糖表现。所有糖尿病受试者均无严重肾病或神经病变。作为对照，还测试了10名无糖尿病家族史的受试者（年龄范围20-50岁，平均年龄29岁）。根据机构审查委员会批准的方案，在知情同意的情况下，根据需要在科罗拉多大学健康科学中心或加州大学旧金山分校获取血样。

CD4的分类⁺流式细胞术和功能研究的T细胞亚群。

人类T细胞是从白斑病患者（太平洋血液中心）中分离出来的。在某些情况下，使用RosetteSep人CD3缺失鸡尾酒（StemCell Technologies，Inc.）进行阴性选择。100–120 × 10⁶将PBMC洗涤一次，计数，并在100×10的分选缓冲液（PBS+0.1%BSA+1mM EDTA）中重悬⁶每毫升15毫升锥形管中。在添加1μl/100万细胞体积的PerCP结合抗CD4、1μl/1万细胞PE结合抗CD127和0.7μl/万细胞APC结合抗CD25抗体后，轻轻混合细胞悬浮液并在4°C下培养30分钟。将冷FACS分选缓冲液添加至15 ml的体积，并将T细胞造粒并在20×10的条件下重新悬浮⁶使用FACSAria（Becton Dickinson）对每毫升标记的T细胞进行分类。各种T细胞亚群的分类门设置为仅包括那些显示CD4特异性荧光的事件，这些事件也在散点图的最低密度区域内。这相当于11.4%至33.9%（平均20.87%）(n个=CD4总事件数的22）⁺T细胞。基于CD4门，根据CD127和/或CD25表达（CD4⁺CD127型^+/−CD25型^+/−和CD4⁺CD127型^+/−独立于CD25和CD25^你好传统T调节细胞）。将细胞收集到100%人AB血清（Cambrex）中，并用培养基（RPMI 1640/5%人血清）清洗一次，直到它们准备好进行抑制试验。分选的T调节细胞为95–98%的CD4⁺CD25型^你好典型产量为5–12×10⁵每种T细胞，而CD4⁺CD127型⁻CD25型⁺细胞的典型产量为0.9–1.2×10⁶纯度为98%。

CD4的分离⁺CD25型^你好和CD4⁺CD25型⁻基因芯片阵列的单元。

人CD4⁺使用RosetteSep Human CD4从白血病患者（斯坦福大学血液中心）中通过阴性选择分离T细胞⁺T细胞鸡尾酒会（StemCell Technologies，Inc.）。0.75–1.25 × 10⁸CD4细胞⁺T细胞（FACS纯度>90%）清洗一次，计数，然后在10×10的FACS染色缓冲液（PBS+0.1%BSA）中重新悬浮⁶每毫升50毫升锥形管中。在加入1/90体积的Cy-5缀合的抗CD4（BD Biosciences）和1/100体积的FITC缀合的抗CD25（DakoCytomation）抗体后，将细胞悬浮液轻轻混合并在冰上孵育45分钟。将冷FACS染色缓冲液加入到50毫升的体积中，将T细胞沉淀并在20×10⁶每毫升标记的T细胞在冰上培养45分钟，然后在DakoCytomation MoFlo高速细胞分选机上进行流动分选。分类门被设置为只包括那些CD25-特异性荧光（CD4）水平最高的事件⁺CD25型^你好细胞）或最低水平（CD4⁺CD25型^否定细胞）也在散点图的最低密度区域内。这相当于CD4事件总数的0.8%至1.4%⁺每个子集的T细胞。

RNA分离。

使用RNA RT-PCR Miniprep试剂盒（Stratagene）中的总RNA分离方案从T调节细胞中分离出总RNA，并进行以下修改：在150μl裂解缓冲液中裂解100000个细胞。为了消化DNA，添加2 U DNA酶/μg核酸和苯酚/CHCl_三（Sigma-Aldrich）用于纯化总RNA，然后进行乙醇沉淀。使用纳米滴ND 100（纳米滴技术）测量总RNA的数量。每种RNA样本100 ng用于通过两轮扩增方案进行靶标记。通过使用6 pMol的T7引物和3μg/μl的随机引物，从Affymetrix真核小样本制备中修改了该方案。

基因芯片阵列和数据分析。

本研究共使用了16个人类HG-U133A基因芯片阵列（Affymetrix）。每个基因芯片杂交10μg片段cRNA在Affymetrix Fluidic工作站450和基因芯片扫描仪GCS2500（Hewlett-Packard公司）上进行处理。用MAS5.0（微阵列套件5.0版；Affymetrix）分析基因表达谱，并用于数据采集和归一化。通过选择四个阵列中的三个阵列中存在的基因来定义存在基因。激活组和对照组的所有现有基因的信号强度由Student’st吨测试。筛选出显著基因，P<0.05。通过比较分析MAS5.0生成“信号对数比”（SLR）和“增加”或“减少”调用，并用于计算组间的折叠变化。我们从16个成对比较中选择了9个，用于特定基因，这些基因在折叠变化>2.0时表现出增加或减少。在第二步中，使用微阵列显著性分析（SAM）分析现有基因的信号强度，并根据Student’st吨测试和折叠变化。最后的重要基因由上述两个步骤组合而成。使用GeneSpring 6.0软件（Silicon Genetics）生成二维层次集群。

实时PCR分析。

根据制造商的说明，使用RNeasy迷你试剂盒（QIAGEN）分离RNA。对于cDNA合成，根据制造商的说明，使用SuperScriptIII逆转录酶和寡核苷酸（dT）12-18（Invitrogen）用cDNA转录试剂转录500 ng总RNA。使用从QIAGEN购买的引物和QuantiTect SYBR绿色PCR试剂盒，使用GeneAmp 7900序列检测系统（Applied Biosystems）实时测量基因表达。给定样本中基因的表达水平表示为2^-ΔΔCt其中ΔΔCT=[ΔCT_{（实验性）}]−[ΔCT_（中等）]和ΔCT=[CT_{（实验性）}]−[电流互感器_{（内务管理）}]. 数据显示并归一化为甘油醛磷酸脱氢酶（GADP）。

抑制试验。

抑制试验在96周的圆形底部微量滴定板中进行。如图所示，添加了来自分类人群相同细胞源的100000个应答PBMC、30000个分类细胞（基于CD25和/或CD127表达的七种不同分类亚型之一）、100000个异基因辐照CD3缺失PBMC。指示的应答器比率是指T调节细胞与应答器之间的比率，其中1个排序：1个应答器是30000个排序的细胞：100000个PBMC应答器细胞。APC由使用StemSep人CD3去除T细胞的异基因PBMC组成⁺根据制造商的建议（StemCell Technologies，Inc.）进行T细胞耗竭，并用40Gy照射。按以下顺序将细胞以50μl/孔的形式铺板：分选细胞、应答器和APC。没有向油井添加额外的刺激；然而，在每个孔中添加了额外的培养基，因此最终体积为200μl/孔。培养井周围的井中装满了PBS，以防止蒸发。T细胞在37°C和5%CO中培养7天₂.孵育结束前16 h，1μCi^三向每个孔中添加H-胸苷。使用Tomtec细胞采集器采集平板^三H-胸腺嘧啶核苷掺入量使用1450 microta Wallac Trilux液体闪烁计数器测定。

抗体染色和FACS分析。

5 × 10⁴每个样本的T细胞用FACS染色缓冲液（PBS+0.1%BSA）清洗一次，然后再悬浮在100μl缓冲液中。添加1μl荧光偶联特异性抗体（1μg/百万T细胞），轻轻旋转T细胞并在冰上培养20分钟。向每个样品中添加500μl染色缓冲液，将T细胞制成颗粒，再悬浮在200μl缓冲液中，并在流式细胞仪上进行分析（Becton Dickinson，FACScalibur）。使用从BD Biosciences或eBioscienes（如有指示）获得的推荐程序进行细胞内染色。

作者感谢Q.Tang、H.Bour-Jordan和A.Abbas对手稿的技术援助和审查。我们还感谢A.Rudensky为FoxP3-GFP小鼠所做的工作。

本研究得到了美国国立卫生研究院第P30 DK63720、U19 DK61934、AI0 48779号拨款的支持；青少年糖尿病研究基金会资助（JDRF 4-2005-1168，JDRF 1-2004-98）；以及来自Becton Dickinson公司的资金。

作者没有相互冲突的利益。