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生物化学杂志。2011年4月8日；286(14): 12024–12032.
2011年2月12日在线发布。 数字对象标识：10.1074/jbc。M10.168625型
预防性维修识别码：项目经理3069405
PMID：21317430

蜗牛1和扭体在调控中的功能配合ZEB1号机组上皮细胞向间充质细胞转化过程中的表达*保存图片、插图等的外部文件。对象名称为sbox.jpg

纳塔莉亚·戴夫,†中，1 桑德拉·瓜伊塔·埃斯特鲁拉斯,‡,2 苏珊娜·古塔拉,‡,三 弗里亚斯法院,‡ 曼纽尔·贝尔特兰,‡ 桑德拉·佩罗,‡和安东尼奥·加西亚·德·埃雷罗斯‡§,4
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

蜗牛1和Zeb1是上皮-间质转化（EMT）过程中诱导的E-钙粘蛋白转录阻遏物。在本文中，我们分析了EMT期间控制Zeb1表达的因素。在用TGF-β处理的NMuMG细胞中，在加入Zeb1上调前需要6-8小时的细胞因子后1小时，可诱导蜗牛1 RNA和蛋白质。Zeb1号机组基因表达是由RNA水平增加以及蛋白质稳定性增强引起的，并且明显依赖于蜗牛1，因为这种蛋白质的耗竭阻止了Zeb1蛋白和RNA的上调。除Snail1外，Twist转录因子的缺失会延缓TGF-β对Zeb1的刺激，或降低其他细胞模型中Zeb1表达，这表明Zeb1也需要该因子。因此，Snail1和Twist在Zeb1的诱导中协同作用：为了使ZEB1号机组mRNA。出乎意料的是，Snail1和Twist的表达在不同程度上表现出了相互依赖性；虽然Twist缺失可延缓TGF-β对Snail1的上调，但Snail1对Twist蛋白的快速增加和随后的上调是必要的扭转1细胞因子诱导的mRNA。除了对Twist的这种影响外，Snail1还诱导Ets1的核移位，这是Zeb1表达所需的另一个因素。Twist和Ets1都绑定到ZEB1号机组启动子虽然与不同的元件相互作用：虽然Ets1与近端启动子相互作用，但Twist与转录起始位点上游的700-bp序列相互作用。这些结果表明，Snail1在多个水平上控制Zeb1的表达，并与Twist在ZEB1号机组基因转录诱导。

关键词：细胞-细胞相互作用，上皮细胞，转录，转录因子，转录抑制因子，EMT，蜗牛1，TGF-β，Twist，Zeb1

介绍

上皮细胞向间充质细胞转化（EMT）5定义了细胞失去上皮特性并获得间充质细胞典型特性的过程。这种转变需要细胞形状的复杂变化，这些变化伴随着基因表达的重新编程而发生(1). EMT的主要特征是由于转录抑制导致粘附连接蛋白E-cadherin的下调。上皮细胞中Snail1的过度表达导致完全EMT，并通过与E-cadherin启动子的结合下调E-cadherin1(2,三); 此外，上调蜗牛1当EMT被诱导时，在许多细胞系统中观察到RNA(4). 除蜗牛1外，其他细胞因子，如与蜗牛1相关的鼻涕虫（蜗牛2）(5)，碱性螺旋-环-螺旋蛋白E12/E47(6)，或Zeb家族的两个成员，Zeb1/δEF-1和Zeb2/Sip1(7–9)，能够抑制E-钙粘蛋白(CDH1型)启动子活性和RNA水平。奇怪的是，所有这些因素都绑定到CDH1型基因：三个电子盒，其核心5′-CACCTG-3′序列位于近端启动子。不同的结果表明，其中一些基因的表达是相互依赖的；例如，研究表明，Snail1的过度表达会增加ZEB1号机组信使核糖核酸(10). 根据RNA干扰实验获得的结果，最近提出了Zeb1在EMT期间E-cadherin基因最终抑制中的相关作用(4). 在本文中，我们研究了两种EMT系统中控制Zeb1表达的机制：用TGF-β处理的NMuMG细胞和Snail1异位表达后的RWP-1细胞。

实验程序

细胞培养和转染

小鼠乳腺上皮NMuMG细胞常规培养在添加了10%胎牛血清（生物工业）、10μg/ml胰岛素（西格玛）、100单位/ml青霉素和50μg/ml链霉素的Dulbecco改良Eagle's培养基（Invitrogen）中。其他细胞系（RWP-1、SW-480、MiaPaca-2和SW-620）在DMEM加10%FBS中生长。如前所示(2,10)，前两个细胞系表达E-cadherin，而MiaPaca-2和SW-620是间充质细胞，表达Zeb1和Snail1。以前曾报道过RWP1-Snail1和SW-480-Snail1细胞的生成(11,12); Snail1转染后，这两种细胞株失去E-cadherin表达并上调间充质细胞标记物。当需要时，用TNFα（PrepoTech）处理细胞（40 n米)在DMEM中放置4小时，或在指定的时间内使用TGF-β（5 ng/ml）。对于Twist1-、Ets1-或Snail1-缺失细胞群的生成，来自5个MISSION®短发夹RNA（shRNA）的DNA分别或以这两种基因的组合形式对应于人类或小鼠版本（参见补充表S1)或非靶向控制载体（Sigma）转染到RWP-1 Snail1、SW-620、MiaPaca-2或NMuMG细胞。根据制造商的说明（Invitrogen），用脂质体乙胺+试剂转染所示细胞系，并用嘌呤霉素（4μg/ml）选择5天，或用G418（0.8 mg/ml）选择14天，从而生成稳定的细胞池。在转染特定合成siRNAs的NMuMG细胞中，Snail1或Twist被下调（参见补充表S1). 在针对不同序列的独立实验中，总是使用两种干扰RNA（shRNA或siRNA）进行RNA干扰，结果非常相似。干扰实验所用序列的详细信息如下所示补充表S1.

蛋白质表达分析

细胞在冷裂解缓冲液1（20 m）中进行裂解米肝素，pH 7.5，25%甘油，420米米氯化钠，1%Triton X-100，1.5 m米氯化镁2，和0.2 EDTA），含有蛋白酶抑制剂（10μg/ml抑肽酶，2 m米Pefablock、10μg/ml胃蛋白酶抑制素和10μg/mlleupeptin）。或者，用软裂解缓冲液2（20 m）制备细胞裂解物米肝素-KOH，pH 7.8，1.5 m米氯化镁2，10米米氯化钾，0.5米米DTT）分离细胞质和核酸部分。用微量移液管仔细重悬细胞，并通过DAPI染色和在显微镜下观察来验证细胞核的完整性。300×离心后克10min后，上清液被认为是细胞溶质部分。将颗粒重新悬浮在缓冲器3（20 m）中米肝素-KOH，pH 7.8，25%甘油，420米米氯化钠，1.5米米氯化镁2，0.2米米乙二胺四乙酸（EDTA），0.5米米DTT），通过20号注射器10次，并在15000×克15min后得到核酸部分。使用以下主要抗体通过Western blot分析蛋白质：小鼠单克隆抗蜗牛(13)，山羊多克隆抗Zeb1（来自Santa Cruz，E-20），兔多克隆抗Twist和抗层粘连蛋白B1（来自Abcam），兔多克隆抗Ets1（来自Santa Cruz），小鼠单克隆抗HA（罗氏应用科学）；小鼠单克隆抗多聚（ADP-核糖）聚合酶1（J.Yélamos博士的礼物，IMIM-Hospital del Mar）或山羊多克隆抗丙酮酸激酶（Chemicon）。

RNA分析

转录物通过逆转录耦合PCR（RT-PCR）进行分析，使用0.25–0.5μg总RNAZEB1号机组,蜗牛1，和次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶之前已有报道(11).扭转1使用与ATG序列+416/+435和+568/+549相对应的两个寡核苷酸分析表达。如前所述，使用SYBR Green（Roche Diagnostics）通过实时RT-PCR测定转录表达水平(11). 用于半定量分析的相同引物用于扭转1.miR-200用1μg总RNA和引物5′-TCGAACTCCCAGAGACG-3′（正向）和5′-AGACCTGCAAGTGTGGAGCTT-3′（反向）对人类样本的转录物进行RT-PCR分析；作为阴性对照，用5′-GGCCCTGCGTCACCGTCACCT-3′（正向）和5′-CTCCCTTACAAGGAGT-3′（反向）扩增基因组扩增子(14). 用寡核苷酸5′-AGTGCCCTGGGTTCTGATAC-3′（正向）和5′-CTAGGCGGACTTAGCCCT-3′（反向）分析小鼠样品；在这种情况下，使用相同的引物扩增基因组阴性对照，而不进行反转录。山松醇或次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶作为负荷对照。

启动子分析和活性分析的载体

人类DNA片段位于ZEB1号机组使用HT-29 M6基因组DNA和与序列−1029/−1012（相对于ATG）（正寡核苷酸）和+6/−11（反义）相对应的寡核苷酸扩增编码序列。该片段克隆于pGL3（Promega）的MluI/HindIII位点。在确定转录起始位点后，该启动子被命名为−1004/+29。通过用MluI和BstZI切割−1004/+29，填充并结扎，获得−147/+29启动子片段。

通过将启动子片段插入pGL3质粒和pRTK-Luc（Promega）中转染所示细胞系，对启动子活性进行分析，以使转染效率正常化。萤火虫（Luc）和雷尼利亚如前所述，48小时后测定荧光素酶活性(11). Luc活性始终通过雷尼利亚荧光素酶活性。系统地包括了三种硅酸盐，并至少重复了三次实验。使用SPSS软件版本14进行统计分析。对<0.05的值在每个病例中都被认为是显著的。

染色质免疫沉淀（ChIP）分析

ChIP分析基本上按照所述进行(11). 15 × 106细胞用1%甲醛交联，裂解物在SL缓冲液（50 m米Tris，pH值8，2 m米EDTA、0.1%Nonide P-40、10%甘油）并离心。丢弃上清液，将颗粒重新悬浮在SDS裂解缓冲液中（1%SDS，10 m米EDTA，50米米pH 8）在室温下搅拌10分钟。对细胞裂解物进行声波处理，以产生200至1500 bp的DNA片段。用IP缓冲液（0.001%SDS，1.1%Triton X-100，16.7 m）将100μl SDS-溶解缓冲液提取物（总计1 ml）稀释1/10米Tris，pH值8，2 m米乙二胺四乙酸二钠，1.2米米EDTA，167米米氯化钠）。以Twist或Ets1特异性抗体或小鼠IgG（Dako）作为对照进行免疫沉淀。用洗脱缓冲液（100 m）处理样品米纳2一氧化碳三，1%十二烷基硫酸钠），并在65°C下培养过夜，以逆转甲醛交联。样品用蛋白酶K和核糖核酸酶消化，并使用GFX PCR DNA和凝胶带纯化试剂盒（Amersham Biosciences）纯化DNA。ZEB1号机组启动子区域通过PCR扩增检测，使用两对对应于−832/−809和−714/−693，以及−173/−150和−48/−28的特异性引物，始终与转录起始位点相关。

结果

NMuMG细胞已被用作TGF-β诱导EMT的模型(15). 蜗牛1蛋白质和RNA(图1A类)在向这些细胞中添加TGF-β后迅速诱导。添加细胞因子后1 h检测到蜗牛1蛋白，并在随后的24 h内保持上调。蜗牛1与蛋白质水平相比，RNA表现出类似的动力学，但存在一些差异：在较早的时间点（蛋白质为1小时而非6小时）观察到最大刺激，24小时后观察到mRNA水平升高(图1A类,中间的和右侧面板).Zeb1号机组mRNA和蛋白在后期增加；6小时前未检测到任何变化，72小时后蛋白质和RNA仍然增加(图1A类). 为了确定Snail1在Zeb1激活中的相关性，我们使用特定的shRNAs阻断了Snail1的上调。如所示图1B类，蜗牛1缺失显著阻止了Zeb1 RNA和蛋白质的合成。小鼠蜗牛1 siRNA也获得了类似的结果蜗牛1和Zeb1号机组RNA在12小时时分别上调70%和65%（未显示）。这些结果表明，Snail1上调是TGF-β依赖性Zeb1表达所必需的。

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TGF-β在NMuMG细胞中诱导Zeb1需要表达Snail1。 面板A，NMuMG细胞与TGF-β（5 ng/ml）孵育指定时间；制备蛋白提取物或分离RNA，并用Western blot或qRT-PCR进行分析。左边面板展示了三个实验中具有代表性的Western blot；这个中央控制面板，三次实验结果的密度分析结果的平均±S.D。值是指在1小时（Snail1）或6小时（Zeb1）时获得的值。这个右侧面板表示三个独立实验的平均±S.D。面板B，NMuMG细胞，转染shRNA特异性蜗牛1（mshRNA，参见补充“方法”)或用TGF-β孵育扰乱对照，并用Western blot或RT-PCR分析指示基因的表达。该图显示了三个实验的代表性Western blot或平均±S.D(B类).面板C，NMuMG细胞转染pcDNA3-Zeb1和pcDNA3-Snail1-HA或空质粒。在加入CHX之前，细胞也与TGF-β孵育24小时。细胞培养基中添加CHX以阻止蛋白质合成，在指定时间后制备蛋白质提取物并进行Western blot分析。65%抑制Zeb1号机组用鼠抗蜗牛1的siRNA代替图中的shRNA，在12小时时获得RNA诱导。

Zeb1蛋白和RNA的上调表现出数量差异。例如，尽管Zeb1蛋白被TGF-β显著刺激（24小时时约为20倍，参见图1A类)，RNA诱导较为温和（仅增加3.5倍）。因此，我们检查了Zeb1蛋白表达是否被控制在额外的水平。首先，分析Zeb1蛋白的稳定性。如所示图1C类与对照NMuMG细胞相比，环己酰亚胺（CHX）处理细胞中外源性表达的Zeb1在TGF-β处理细胞中的衰减要慢得多。添加CHX三小时后，对照细胞中几乎没有Zeb1残留，而TGF-β处理细胞中该蛋白的水平几乎没有受到影响。与对照细胞相比，在与Snail1共转染的细胞中观察到类似较慢的下调(图1C类). 正如所料，由于蜗牛1是一种高度不稳定的蛋白质，其蛋白质水平在添加CHX后迅速下调。因此，这些结果表明，蜗牛1上调Zeb1不仅是因为RNA水平提高，而且还因为蛋白质稳定性增加。

作为TGF-β的替代品，并在另一个细胞系统中验证我们的结论，在RWP-1或SW-480细胞中稳定的Snail1异位转染也可诱导EMT。如报告所示(11,12)，在这些细胞系中，Snail1引起了表型的显著变化，也刺激了ZEB1号机组RNA水平(图2A类)（另见参考。10). A类似Zeb1号机组在NMuMG细胞中异位表达Snail1后，表达上调(图2A类). 相反，消除蜗牛1内源性表达Snail1和Zeb1的两种细胞系MiaPaca-2和SW-620细胞中的RNA下调ZEB1号机组核糖核酸(图2B类)，这种效应伴随着获得更紧密的表型（未显示）。使用另一种针对人类蜗牛1的shRNA证实了这些结果，该shRNA下调ZEB1号机组在MiaPaca-2和SW-620中，RNA水平分别约为45%和55%（未显示）。

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蜗牛1控件Zeb1号机组mRNA水平。 面板A和B类，RNA是从稳定转染Snail1-HA或感染表达人逆转录病毒的所示细胞系中制备的蜗牛1shRNA(hshRNA1)或加扰对照shRNA。通过qRT-PCR测定指示基因的表达。数值表示为蜗牛1对对照细胞的折叠刺激（用空质粒转染）(A类)或相对于感染对照shRNA的细胞的表达百分比(B类). 另一人Zeb1表达受到45%和55%的抑制蜗牛1shRNA(hshRNA2)分别位于MiaPaca-2和SW-620。面板C，1004/+29的活动ZEB1号机组在转染稳定表达Snail1-HA或用TGF-β处理48小时的所示细胞系后，确定启动子。系统地包括三种硅酸盐，并重复至少三次实验。该图显示了3-5个实验的平均±S.D。表达Snail1的细胞获得的值与相应的对照组不同对在RWP1细胞和对SW-480和NMuMG细胞<0.05；NMuMG和TGF-β处理的NMuMG-细胞之间的差异也存在统计学差异(对< 0.05).面板D和E类，RNA是从RWP1、RWP1-Snail1中制备的(D类)或用TGF-β处理1或24小时的NMuMG细胞(E类). 当被指示时，Snail1的表达在NMuMG细胞中使用特定的siRNA被抑制(msiRNA). miR-200的表达按照“实验程序”所示进行测定。作为对照，验证未扩增DNA。分析山松醇进行RNA检测以确定使用了等量的RNA。

我们还确定了Snail1是否依赖于Zeb1号机组mRNA是由于转录增加所致。为此目的，我们分离出与人类启动子相对应的1-kb DNA片段。转录起始位点是通过扩增SW-620细胞的5′cDNA末端（RACE）和RNA来确定的，对应于相对于ATG的A位于−23的腺苷(补充图S1). 因此，该构建体对应于转录起始位点的−1004/+29。

该启动子片段在蜗牛1阳性间充质细胞（SW-620，MiaPaca 2）中的活性高于上皮细胞（SW-480，RWP-1）（数据未显示），模拟了ZEB1号机组成绩单。稳定蜗牛1转染上调了该蛋白的活性ZEB1号机组RWP-1、SW-480或NMUMG细胞中的启动子(图2C类); 用TGF-β处理NMuMG细胞48小时后，观察到类似的增加。在大多数细胞系中，启动子活性刺激（2–2.5倍）低于ZEB1号机组RNA（3.5–4.5倍，比较面板A和C类). 因此，这些结果表明ZEB1号机组RNA上调仅部分涉及转录增加。

据报道，Zeb1的表达受miR-200型家庭(14,16,17). 因此，我们分析了NMuMG细胞中的TGF-β或RWP-1细胞中的蜗牛1是否下调了这种miRNA的表达。如所示图2,D类和E类这两种因子都下调了该RNA的水平。TGF-β引起的miR-200的下调被蜗牛1的缺失所阻止(图2E类)，进一步强调了该因子在Zeb1控制中的作用。

Twist转录激活物的表达也与EMT有关(18)尽管Twist抑制E-cadherin表达的确切机制尚不清楚。我们使用RNA干扰来确定Twist在Zeb1表达中的相关性。如所示图3A类扭曲下调影响Zeb1的表达。尽管扭转1RNA下调仅在RWP-1-钉子1细胞中部分表达，足以降低ZEB1号机组通过定量RT-PCR测定80%的mRNA水平(图3A类). 另一个也获得了类似的结果扭转1抑制shRNAZEB1号机组表达率为55%。Zeb1下调扭转1在另外两个组成性表达Zeb1、SW-620和MiaPaca-2的细胞系中也检测到shRNA。用扭转1shRNA促进了ZEB1号机组与转染了无关shRNA的对照细胞相关的RNA(图3B类).

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Twist和Snail1在Zeb1表达中合作。5微克扭转1将hshRNA1或非靶向对照载体转染到RWP-1 Snail1(面板A)、SW-620或MiaPaca-2细胞(面板B). 用嘌呤霉素（2.5μg/ml）筛选转染细胞群，并通过定量分析(A类)或半定量RT-PCR(B类). 另一个也获得了类似的结果扭转1shRNA(hshRNA2)在RWP-1蜗牛1细胞中ZEB1号机组表达率为55%。面板C，用含有Twist或Snail1 cDNA的表达质粒转染RWP-1细胞；用G418筛选细胞群体，并通过RT-PCR分析所示基因的表达。面板D，用所示cDNA和pGL3瞬时转染RWP-1细胞-ZEB1号机组发起人。48小时后测定荧光素酶活性。图中显示结果的平均±S.D(D类)或进行三个代表性实验(A、 B类、和C类).

RWP-1细胞也转染了一个表达质粒，用于扭转1cDNA。的级别ZEB1号机组该cDNA的表达仅略微增加了RNA(图3C类). 转基因蜗牛1导致更高的上调ZEB1号机组这两个基因的同时表达增强了这种增加，表明Snail1和Twist在Zeb1表达上协同作用(图3C类). “蜗牛1”和“扭曲”对ZEB1号机组当两者在RWP-1细胞中瞬时表达时，可以观察到启动子活性，表明这两个因子协同增加ZEB1号机组转录(图3D类).

TGF-β处理后，还分析了NMuMG细胞中的扭曲表达。在添加细胞因子1小时后，观察到Twist蛋白上调(图4A类). 然而扭转1RNA仅在24小时后检测到，72小时时观察到最大激活(图4B类). Twist蛋白水平的早期刺激和RNA表达的晚期激活都依赖于蜗牛1，因为它们在蜗牛1shRNA-转染细胞(图4,A类和B类). 如前所示（参见图1)，蜗牛1 shRNA阻止TGF-β引起的Zeb1蛋白上调。这个扭转1shRNA也影响Zeb1蛋白的表达，尽管程度低于蜗牛1shRNA，因为在这些细胞中观察到了Zeb1的诱导，尽管时间晚于对照细胞（24小时而不是8小时）(图4A类).

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Snail1和Twist相互调节它们在NMuMG细胞中的表达。 面板A和B类、NMuMG细胞表达干扰或shRNAs特异性蜗牛1或扭转1与TGF-β孵育指定时间；制备蛋白质提取物或分离RNA并用Western blot分析(工作分解结构)(A类)或qRT-PCR(B类).面板C和D类,扭转1核糖核酸(C类)和蛋白质(D类)在转染Snail1-HA或对照质粒的RWP-1或HT-29 M6细胞中进行分析。在面板E如有必要，NMuMG细胞经TGF-β处理24小时，或向体外表达Snail1的RWP1细胞或对照质粒补充CHX以阻断蛋白质合成。在指定时间后制备蛋白质提取物，并通过Western blot进行分析。图中显示了具有代表性的结果(A类和D类)或平均±范围(B类,C类、和E类)进行了两次实验。

我们分析了Snail1是否影响其他细胞系统中Twist的表达。如中所示图4C类，蜗牛1转染未改变扭转1RWP-1细胞或HT-29 M6细胞中的RNA水平。的其他激活器扭转1基因表达，如TNFα(19)mRNA水平增加约5倍（未显示）。然而，正如图4D类。Snail1上调Twist蛋白和RNA之间的不一致性表明，Snal1通过转录后机制增加Twist表达。因此，与相应的对照组相比，TGF-β处理的NMuMG或RWP-1-甲状旁腺细胞在CHX添加后扭转下调的速度要慢得多(图4E类). 因此，蜗牛1增加了扭曲蛋白的稳定性。

奇怪的是，我们的结果表明，“扭曲”也会影响“蜗牛1”的级别，尽管在“扭曲”表达上，“扭曲1”的影响程度比“蜗牛”低。如所示图4A类，消融TGF-β诱导的扭转迟缓蜗牛1蛋白上调。增加蜗牛1RNA水平也较低且延迟(图4B类). 然而，当Twist被转染到RWP-1或NMUMG细胞（数据未显示）时，我们没有检测到增强的Snail1蛋白或RNA，这表明Twist是激活Snail1表达所必需的，但不足以诱导其表达。

我们进一步分析了导致ZEB1号机组由Snail1和Twist转录。ChIP实验表明，Twist与ZEB1号机组发起人。Twist抗体共同免疫沉淀了一个位于转录起始位点上游700 bp的扩增子，而不是另一个对应于近端启动子的扩增子(图5A类). 这种相互作用是RWP-1蜗牛1特有的，在对照RWP-1细胞中未观察到。在SW-620和MiaPaca-2细胞中也检测到与相同元素的结合(图5A类). 相反，Snail1没有与此序列关联（未显示）。因此，这些ChIP分析表明，Snail1增加了与位于ZEB1号机组发起人。

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Twist和Ets1与Zeb1启动子中的不同元件相互作用。 面板A和E类、扭曲分析(A类)或其他1(E类)绑定到中指示的元素ZEB1号机组启动子由ChIP按照“实验程序”进行面板B如前所述，在SW-620、RWP-1对照或转染蜗牛1的RWP-1中测定−1004/+29或−147/+29 DNA片段的启动子活性。Snail1转染细胞和Snail1细胞之间的差异具有统计学意义对−1004/+29启动子和对−147/+29启动子<0.05。两个启动子的活性差异也很显著(对<0.05）。面板C、SW-620或RWP-1蜗牛1细胞转染，对照组为ETS1型-特异性shRNA（hshRNA1）。另一种方法也获得了类似的效果ETS1型SW-620细胞中的shRNA（hshRNA2）导致ETS1型RNA水平。选择后，获得RNAETS1型和ZEB1号机组通过qRT-PCR测定。面板D用TGF-β处理指定时间的NMuMG或RWP-1对照，制备细胞核和细胞组分，并用Snail1转染。在细胞核中测定指示蛋白质的水平(NMuMG公司)或核和细胞溶质部分（RWP1细胞）。聚ADP-核糖聚合酶(PARP项目)-1和拉明B被用作核分数的对照；丙酮酸激酶(派克)，用于细胞溶质部分。此图中的结果与代表性结果相对应(面板C)或三个实验的平均±S.D。

蜗牛1作用于ZEB1号机组发起人。尽管与−1004/+29启动子相比，蜗牛1的激活程度较小，但它也刺激了−147/+29 DNA片段的活性(图5B类)这表明，Snail1也刺激另一个转录激活物与该启动子中更近端的元件结合。

据报道，Zeb1表达需要Ets1(20). 为了确定Ets1是否控制Zeb1表达，ETS1型RWP1-Snail1和SW-620细胞中RNA水平下调。降低ETS1型RNA水平伴随着类似的下调ZEB1号机组核糖核酸(图5C类). 在NMuMG细胞中，TGF-β处理后细胞核部分的Ets1蛋白水平上调(图5D类)，尽管总水平没有改变（未显示）。6小时后检测到上调，与Zeb1号机组RNA和NF-κB和β-catenin这两个转录因子在这一部分的表达增强，这两个因子参与间充质基因的转录(21). RWP-1细胞中蜗牛1的异位表达也刺激了Ets1从胞浆向细胞核的移位；与RWP1对照细胞相比，RWP-1 Snail1细胞的核部分中Ets1蛋白水平上调(图5D类).

最后，我们分析了Ets1与ZEB1号机组发起人。ChIP分析表明Ets1也与该启动子结合。然而，与Twist相反，Ets1优先与近端启动子相互作用，而不是与远端元件相互作用。如图所示(图5E类)与−832/−693扩增子相比，Ets1抗体免疫沉淀的效率更高。在SW-620细胞中或在RWP-1细胞中的Snail1转染后检测到与该序列结合的Ets1，这表明Snail1增加了Ets1向细胞核的易位，并与ZEB1号机组发起人。

讨论

Zeb1是EMT中负责间充质细胞E-cadherin基因沉默的关键蛋白。在本报告中，我们研究了其在广泛研究的TGF-β处理的NMuMG细胞EMT模型中的调节，以及在蜗牛1转染后经历EMT的RWP1细胞中的调节。正如我们报道的那样，这些细胞模型中的Zeb1激活是一个复杂的过程，涉及RNA的增加和蛋白质的稳定。RNA上调是转录增加和RNA稳定的结果，因为TGF-β也降低miR-200家族miRNA的表达。这些由上皮细胞特异表达的非编码RNA与ZEB1号机组3′-UTR并下调ZEB1号机组信使核糖核酸(16,17).

除了影响miR-200型表达，Zeb1的表达是由Snail1和Twist转录因子的协同作用通过转录控制的。Twist是一种基本的螺旋-环-螺旋蛋白，在原肠胚形成、中胚层形成和神经嵴迁移中起重要作用，并可作为转录阻遏物或激活物发挥作用(22). Twist的表达与乳腺癌细胞向肺的灌注和转移模型中侵袭性的获得有关(18). 此外，Twist的异位表达或HIF-1α对该因子的诱导，促进了以E-cadherin表达减少和间充质基因激活为特征的EMT(23). 然而，迄今为止，Twist抑制E-cadherin的确切机制尚未明确。尽管Twist绑定到CDH1型已报告启动人(24)，对于其他一些作者来说，这种关联仍有争议(18,25,26). 最近的结果表明，Twist绑定到CDH1型与Bmi1复合物中的启动子，需要PRC2相互作用(27)这表明Twist需要其他阻遏物对该启动子的先前作用。无论如何，我们在本文中演示了Twist也参与了CDH1型阻遏物Zeb1，与Snail1协同作用。Twist可能在两个水平上作用于E-cadherin，直接通过Bmi1结合，并诱导潜在的CDH1型阻遏物Zeb1。

我们证明了Zeb1的表达依赖于Twist。此结果也可能与EMT以外的系统有关。例如，在小鼠中，Twist抑制肌源性分化(28)，Zeb1也促进了这一效果(29). 确定Twist对该过程的影响是否也依赖于Zeb1诱导，这将是一件有趣的事情。

我们的结果也为间充质基因激活所涉及的信号通路提供了一个新的视角，例如ZEB1号机组。如所示图6，调节是多重的，因为Zeb1在转录和转录后都受到控制。在后者，Snail1和TGF-β：1）降低miR-200水平，从而稳定ZEB1号机组RNA和2）稳定Zeb1蛋白。因此，与相应的对照组相比，经TGF-β处理的NMuMG细胞或转染Snail1的RWP-1细胞中该蛋白的半衰期更高（参见图1). Zeb1降解所需的泛素连接酶以及由蜗牛1和TGF-β控制的泛素连接酶尚不清楚。此外，ZEB1号机组EMT也刺激基因转录，这种效应取决于两个转录因子Twist和Ets1的活性。蜗牛1以不同的方式刺激这两种因子的活性，因为它提高了Twist蛋白水平，而它使Ets1易位到细胞核。因此，这两种蛋白质与ZEB1号机组启动子增加。

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蜗牛1和TGF-β对Zeb1表达的不同调节水平的方案。TGF-β上调蜗牛1的表达，增加了作用于不同水平的Zeb1蛋白：1）它减少了miRNA200的表达，从而破坏了Zeb1号机组RNA；2） 通过抑制参与Zeb1降解的未知泛素连接酶的功能，刺激Zeb1蛋白的稳定性；和3）激活Zeb1号机组基因转录。这种刺激是由两个转录因子Twist和Ets1的激活介导的，它们结合在Zeb1号机组发起人。蜗牛1也会上调调节Zeb1号机组在几个水平上的转录，因为它促进Ets1向细胞核的移位，增加Twist蛋白的稳定性，并且是刺激扭转1由TGF-β引起的RNA。此外，TGFβ对蜗牛1的全面上调也需要Twist表达（由虚线).

Zeb1表达的这种多重上调可能会产生几个后果。其中之一是，不同机制在Zeb1上调中的确切作用可能是细胞依赖性的。因此，在一些细胞中，这种影响可能主要是转录，而在其他细胞中，miRNA的下调可能占主导地位。

我们的结果还表明，蜗牛1对基因表达的影响不仅依赖于上调的RNA水平，还依赖于增强的蛋白质稳定性。因此，蛋白质和RNA不一定相关。例如，Snail1能够稳定Twist蛋白，但不足以诱导扭转1RNA，尽管它是由NMuMG细胞中TGF-β引起的RNA上调所必需的。因此，我们的结果为EMT中这些转录因子的控制增加了新的复杂性，这一调控主要是通过分析RNA水平来研究的。因为RNA和蛋白质水平并不总是相关的，所以RNA水平的测定可能低估了转录因子在EMT中的作用。例如，最近的一份报告表明，蜗牛1蛋白的稳定性受缺氧调节(30)，独立于RNA上调。

此外，我们的结果表明，Snail1和Twist并没有显示出完全的等级关系，而是相互依赖的(图6). 消除蜗牛1会显著影响Twist蛋白水平，但Twist耗竭也会延缓TGF-β对蜗牛1的诱导。这些结果可能解释了在不同的细胞系统中获得的不同结果，其中Twist被放置在Snail1的上游和下游。无论如何，将控制EMT的蛋白质视为网络中的元素比不在线性信号通路中更为充分。

确认

我们感谢Gabriel Gil博士提供了Twist表达质粒。

*这项工作部分得到了Ciencia y Tecnologia部长的拨款SAF2006-00339、Asociación Española contra el Cáncer基金会和TV3基金会的拨款（081731）（发给a.G.H.）、Carlos III-Fondos FEDER研究所（RTICCC，C03710，RD06/0020/0040）的支持，和Generalitat de Catalunya Grant 2009SGR867。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为sbox.jpg本文的在线版本（可在http://www.jbc.org)包含补充的“方法”，图S1和表S1.

5使用的缩写如下：

电子病历
上皮-间充质转化
瑞士法郎
环己酰亚胺
qRT（定量放射治疗）
定量逆转录酶。

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文章来自生物化学杂志由以下人员提供美国生物化学和分子生物学学会