α-突触核蛋白（α-Syn）是突触前蛋白[25]与正常大脑功能有关[11]帕金森氏病（PD）[32]. α-Syn作为伴侣蛋白发挥作用，部分基于其与14-3-3蛋白的同源性[30]结合并调节许多细胞蛋白的活性。我们的实验室发现α-Syn和TH之间存在功能性相互作用[31,33]，受14-3-3调控的主要多巴胺生物合成酶。而已知14-3-3结合并刺激TH活性[18]，我们发现α-Syn与TH结合，通过减少TH磷酸化抑制其活性[31,33]，可能作为14-3-3拮抗剂调节3,4-二羟基-L-苯丙氨酸（DOPA）的生成。
TH的短期调控依赖于TH调控域中seryl残基Ser19、Ser31和Ser40的磷酸化[5,14]. 我们以前证明过表达α-Syn的多巴胺能细胞中TH磷酸化显著降低[31,33]. 调节14-3-3与TH结合的丝氨酸是磷酸化-Ser19（PSer19），该位点在整个大脑的多巴胺能神经元中高度磷酸化[36]. 为了评估α-Syn对体内TH的影响，在缺乏内源性α-Syns的情况下，我们获得了ASKO小鼠[1]并使用既定方法生成野生型人类α-Syn慢病毒[16]. 在此，我们分享我们的新发现，当α-Syn聚集时，多巴胺能神经元中Total-TH的免疫反应性（ir）似乎降低。然而，使用特征良好的磷酸化-TH抗体很容易标记TH神经元[15,21,23,36,37]. 虽然需要进一步的分析来确定随着α-Syn的聚集，总TH ir减少的机制，但这些数据为α-Syn在体内多巴胺合成中的抑制作用提供了第一个证据。
我们使用雄性ASKO小鼠（菌株B6:129X1-Snca，Tm1ROSL/J；Jackson Labs）在体内研究了α-Syn对TH的影响[1]重23–30g，12小时光/暗循环，可随意进食和饮水。根据匹兹堡大学动物护理和使用委员会批准的NIH协议指南处理小鼠。
慢病毒是使用人类免疫缺陷病毒修饰的载体系统产生的，用于转导非分裂细胞[27]，由Didier Trono教授（瑞士日内瓦大学）提供。质粒包括pCMVΔR8.91（包装）、pHR’CMVGFP（转移）和pVSVG（病毒包膜）。将pcDNA3.1（匹兹堡大学刘永健赠送）中的野生型人α-Syn消化KpnI/XbaI，然后在KpnI/ApaI结扎（钝端）后插入到KpnI/EcoRV的pcDNA3中。用HinDIII（钝端）和XhoI消化α-Syn-pcDNA，并连接到pHR’CMVGFP。对于联合转染，HEK293T细胞接种于9×106每10厘米板的细胞数。第二天，用OptiMEM（Gibco Invitrogen，Foster City，CA）代替培养基，然后使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）进行三次转染。72小时后从培养基中纯化慢病毒颗粒[16]. 标题范围为~1×108− 1 × 1010TU/ml。在HEK293T细胞中用溴化六甲菊酯（H-9268，Sigma-Aldrich）接种6-20 ul病毒后，证实了其转导效率，其在与α-Syn抗体反应的免疫印迹上产生了剂量依赖性的α-Syn-增加（610786，BD-Transformation Labs）（未显示）。病毒是根据EHS和匹兹堡大学rDNA研究机构生物安全委员会指南处理的。
对于体内转导，在双侧将α-Syn或GFP慢病毒传递到嗅球之前，用氯胺酮80 mg/kg和赛拉嗪12 mg/kg（Sigma-Aldrich）麻醉小鼠。坐标为：±Bregma（AP+4.28，ML±0.375，DV-2.75至-1.75）。小鼠被固定在立体定向框架内，在提取针头时接受输液泵（Stoelting，Wood Dale，IL）输送的溶液（每次注射1.0μl，0.2μl/min）。在第3.5、7、14和21天，通过麻醉过量处死小鼠（N=33；22α-Syn转导，注射4 PBS和7 GFP转导）。选择这些时间点是为了确保在翻转的神经元池中有足够的α-Syn转导。所有时间点都产生了类似的结果。提取大脑，纵向分割，一个半球在4°C的4%甲醛中固定，然后在15–30%蔗糖-PBS中冷冻保护。另一个半球冷冻用于生化免疫印迹，使用既定方法制备[22,31,33,39,41]，并根据制造商（Li-Cor、Lincoln、NB）使用Odyssey红外成像进行量化。
将冷冻切片机（Microm HM550，Waldorf，Germany）切片（8–30μm）解冻安装在载玻片上或收集在−20°C冷冻保护剂中。厚型材采用自由浮动加工。在10%山羊血清、5%牛血清白蛋白、0.1%甘氨酸、0.3%Triton-X-100、1x PBS中阻断切片，然后在4°C下在三种一级抗体中阻断切片15小时，然后在二级抗体中连续孵育，RT1小时。TH抗体包括：（1）鸡多克隆（TH-S，1:250，Aves Labs，Tigard，OR）针对N端和C端的两个肽，但不重叠TH磷酸化位点，（2）针对PC12细胞纯化的TH的小鼠单克隆抗体（MAB318，1:100，Chemicon；Temecula，CA）（表位在N端之外）；（3） 兔多克隆抗体（AB152，1:100，Chemicon；Temecula，CA）抗大鼠嗜铬细胞瘤变性TH，（4）兔多克隆疫苗（P40101-0，1:500，Pel-Freeze，Rogers，AK）抗SDS变性纯化重组大鼠或牛TH；（5） 绵羊多克隆（AB1542，1:1000，Chemicon）抗大鼠嗜铬细胞瘤天然TH。其他抗体包括磷酸化特异性TH抗体：兔抗PSer19（AB5425，1:1000，Chemicon）、兔抗PSer31（AB5423，1:100，Chemiconic）、兔抗PSer40（AB5423,1:100，Chemicon）；或Aves Labs为我们定制的鸡PSer19和PSer40 TH多克隆抗体。用鸡抗GFP抗体（AB1690，1:500，Chemicon）对GFP转导的神经元进行免疫标记。二级抗体包括亲和力纯化的抗体：驴抗羊Alexa-546（1:700；Invitrogen/分子探针；加利福尼亚州福斯特市）、山羊抗鸡Alexa-488（1:700，Invitrogin/分子探针）、山羊抗兔Alexa-647（1:700：Invitrogen/分子探针，或CY3-结合羊抗鸡（#103-165-155，1:700，Jackson ImmunoResearch）。当使用Vectashide Hardset（加利福尼亚州伯林盖姆Vector Labs）将细胞核安装在载玻片上时，对其进行DAPI染色。
三色激光共焦显微镜（Olympus IX81），用于检测DAPI的紫外波长、绿色（Alexa-488）、红色（Alexa-546和CY-3）和远红色（Alexa-647）。通过Fluoview10（Olympus）采集图像并量化数据，所有条件下的所有设置都相同。强度曲线的数据在Excel（Microsoft）中累积，并使用GraphPad（Instat，San Diego）进行评估，统计显著性设置为0.05。
通过蛋白酶K（PK，Invitrogen）处理测定蛋白质聚集[8,28]在室温下风干20分钟的解冻切片上，用Pap-Pen（Polysciences，Warrington，PA）圈住，然后在1 x PBS中重新润湿。在0.1 M-Tris-HCL缓冲液中用2.5μg/ml PK消化组织，0.005 mM EDTA，pH7.5，15–30分钟，室温。然后按上述方法对切片进行免疫染色。对于硫黄素-S，我们使用漂浮切片（30μm），首先进行免疫标记，然后与1%水溶性硫黄素S（圣路易斯Sigma-Aldrich）反应30分钟RT，然后进行乙醇洗涤。在评估之前，所有切片都在4°C下进行了光保护。
DAPI染色显示，α-Syn转基因小鼠嗅球形态正常(). 正如所料，许多肾小球周围神经元(，箭头）为多巴胺能，经Total-TH免疫反应（ir）证实(). 因为我们使用的慢病毒颗粒是用水泡性口腔炎病毒糖蛋白（VSV-G）包膜蛋白包装的，我们预计大多数嗅觉神经元都会被转导。然而，令我们惊讶的是，α-Syn的表达几乎只在转导后7天的多巴胺能神经元中观察到(). 这种相对选择性取向的原因尚不清楚，然而，如高倍图像所示，α-Syn-ir与TH共定位(，箭头）。正如预期的那样，未经转化的嗅球缺乏α-Syn-ir().
慢病毒转导的α-Syn基因敲除小鼠肾小球周围嗅神经元中α-Syn与Total-TH共表达立体定向注射α-Syn慢病毒后7天（A）DAPI染色细胞核显示正常的嗅球形态。箭头指向肾小球周围区域。（B）许多肾小球周围神经元被标记为Total-TH，证实了它们的多巴胺能表型。箭头指向肾小球边缘的一组四个TH-ir神经元。（C）许多神经元在转导后表达野生型人α-Syn。箭头指向与B中相同的四个神经元。（D）高倍镜下，融合的Total-TH-ir和α-Syn-ir呈黄色，证实了DA神经元中α-Syn的表达（箭头）。（E）PBS注射ASKO小鼠的非转导（Ntd）嗅球缺乏α-Syn-ir。使用的总-TH抗体为TH-S。大小条，100μm（a–C），25μm（D，E）。
以前，我们注意到α-Syn在体外抑制TH磷酸化和多巴胺合成[31,33]. 正常情况下，功能性α-Syn和TH是可溶蛋白，但都在路易体中积累[20,26,38]. 我们一直假设当α-Syn聚集时TH磷酸化水平会增加[32,33]. 为了开始评估这种可能性，我们在转导后3.5–21天将免疫标记的ASKO嗅球与α-Syn、Total-TH或TH在Ser19、Ser31或Ser40磷酸化的抗体进行三联。由于我们的三种磷酸化-Ser-specific-TH抗体的数据几乎完全相同，因此我们在此仅提供PSer19结果。PBS注射后3.5天，嗅球的Total-TH和TH PSer19信号重叠，没有α-Syn-ir，这与预期相符(). 在用野生型人α-Syn转导的ASKO小鼠中，α-Syn-ir与Total-TH-ir有广泛重叠(). 然而，具有更强α-Syn-ir的细胞的总TH-ir降低(，箭头处的细胞），尽管PSer19染色证实了其多巴胺能表型(). 当我们量化细胞1、2和3的信号强度时，我们注意到Total-TH-ir和α-Syn-ir之间存在显著的负相关，而α-Syn-ir和TH PSer19-ir之间则存在正相关()（N=85个细胞，P<0.0001）。相反，GFP转导并没有降低总TH-ir或增加PSer19-ir，正如在GFP转染多巴胺能神经元呈黄色的合并图像中可以看到的那样(). 在第3.5天和第7天，α-Syn-和GFP转基因小鼠的组织匀浆免疫印迹上的总-TH水平相当()，尽管与GFP转导的对照相比，α-Syn转导的组织中的PSer19水平显著更高(方差分析，P<0.02）。
α-Syn转导而非GFP转导降低多巴胺能神经元的Total-TH免疫反应性（A）ASKO小鼠术后3.5天未转染的肾小球周围多巴胺能神经元没有α-Syn-ir，也没有与TH PSer19-ir重叠的丰富的Total-TH-ir。B）许多α-Syn转导的神经元含有Total-TH-ir，证实了多巴胺能神经元的有效α-Syn-转导。具有强α-Syn-ir的细胞也具有强TH-PSer19-ir，但总TH-ir减少，在合并图像中显示为紫色（箭头处）。（C）细胞1、2和3的强度分布,从细胞1α-Syn-ir低，PSer19-ir低和Total-TH-ir高；细胞2具有中等水平的α-Syn-ir、PSer19-ir和Total-TH-ir；而细胞3具有高α-Syn-ir、高Pser19-ir和低Total-TH-ir。（D）术后14天用CY-3免疫荧光法对GFP转导的神经元进行GFP免疫染色（红色）。环状GFP-ir神经元具有较强的Total-TH-ir（绿色环状细胞）和低水平的PSer19-ir（蓝色环状细胞）。GFP转导的多巴胺能神经元在合并图像中显示为黄色，包括圆形细胞和同一显微视野中的其他细胞。（E）在转导后3.5天和7天（TDX后），α-Syn转导的嗅球组织的Total-TH水平相当，但与GFP转导的组织相比，PSer19升高。Actin用作加载控件。使用的总TH抗体为TH-SA类和B类，AB1542英寸D类和MAB318英寸E类尺寸棒，20μm。
我们使用蛋白酶K（PK）和硫黄素S标记α-Syn和GFP转基因组织在转导后3.5天和21天的组织切片，验证了α-Syn-聚集与总TH-ir降低相关[2,6,12,13,24,28,35]. PK后，对α-Syn、PSer19和Total-TH进行三重标记的组织显示，PK耐药的α-Syn-与PSer19-ir共定位，但Total-TH标记缺失()经Fluoview分析验证（N=50，t=41.75，P<0.0001），表明Total-TH是可溶的并被消化掉。在转导后14天，对硫黄素-S、α-Syn和Total-TH进行三重标记，结果显示，α-Syn-和Thioflavin-S同时染色，证实了细胞中的聚集，Total-TH-ir减少，但可以察觉(，箭头处）。注射部位边缘的未转导神经元保持了强健的Total-TH-ir(，箭头处）非常类似于在所有时间点都有类似的发现。重要的是，如硫黄素S染色所证实的，有时会发生GFP聚集；然而，在这些条件下，总TH-ir没有降低，PSer19-ir也没有增加（未显示）。这表明α-Syn聚集可能对TH磷酸化和总TH-ir的减少有独特的影响。
通过蛋白酶K或硫黄素-S标记证实的α-Syn聚集与TH PSer19免疫反应性相关（A）分离神经元（红色）中的蛋白酶K抗性α-Syn-ir缺乏Total-TH-ir（绿色），但PSer19-ir（蓝色）水平较高，在转导后7天，细胞合并图像中出现紫色。（B）转导后14天，聚集的α-Syn（红色）与Thioflavin-S（绿色）在神经元中共定位。与注射边缘的未转导多巴胺能神经元相比，这些细胞（箭头）中的总-TH-ir减少，而注射边缘的多巴胺能神经细胞缺乏α-Syn并且具有较强的总-TH-ir（箭头）。由于α-Syn-ir和Thioflavin-S信号较强，合并信号呈黄色。使用的总TH抗体为TH-SA、，和P40101-0英寸B类.尺寸棒，25μm。
α-Syn在体外有聚集的倾向[三,9,10]和体内[7,17,29]. 此外，黑质多巴胺能神经元中α-Syn水平随年龄增长而增加[8]，毒素可以进一步增加α-Syn水平，从而增强聚集[24]. α-Syn基因额外拷贝的存在可导致罕见PD家族的病理改变[7,17,29]. 我们以前的数据表明α-Syn抑制TH磷酸化和活性[31,33]，可能与14-3-3对应，以调节DA合成。因为TH Ser19的磷酸化增强了Ser40的磷酸化[4,19,21,40]导致DA合成增加[34]，我们在含有α-Syn聚集体的神经元中发现高水平磷酸化TH()提示TH活性和DA合成可能在细胞中增加[32,33]. 因为我们早期的研究表明，α-Syn还抑制芳香氨基酸脱羧酶（AADC），该酶将多巴胺转化为多巴胺[39]，当可溶性α-Syn水平降至可接受的阈值以下时，可能会发生无限制的DA合成，尽管这有待确认。
累积起来，我们的研究结果表明，将α-Syn增加到促进其聚集的水平可能有能力过度激活TH和AADC，这可能最终导致黑色素细胞随着时间的推移而丢失[32]. 我们的研究结果进一步表明，Total-TH的免疫染色可能低估了含有不溶性α-Syn的细胞中多巴胺能的丢失，如使用五种不同的Total-TH抗体所示。相反，细胞被强烈标记为TH PSer19，这不仅表明α-Syn对TH调节的重要作用，也为确认多巴胺能表型提供了一种新的工具。此外，我们的研究结果揭示了ASKO小鼠慢病毒α-Syn转导作为模型系统的有用性，在该模型系统中进一步阐明α-Syn-对TH调节、多巴胺合成和细胞存活的影响。
