特发性肺纤维化中Wnt/β-连环蛋白通路异常激活

摘要

特发性肺纤维化/普通间质性肺炎（IPF/UIP）是特发性间质性肺病中最常见和最严重的形式。1-4从病因和自然史来看，关于该病的许多问题仍未解决，最近的对比意见引发了对其发病机制的热烈讨论。5-13IPF/UIP的炎症理论受到了挑战，并基于以下假设提出了新的模型：组织损伤后间充质和上皮肺成分之间的失调交流是纤维化和组织重塑不可逆过程的关键。7,9,10这种观点的改变似乎特别有趣，因为它可能为旨在对比成纤维细胞增殖和/或诱导成纤维细胞凋亡的新治疗方法提供了理论基础。7,14,15尽管如此，成纤维细胞/肌成纤维细胞在IPF/UIP中的中心地位仍存在争议，尚未得到证实，并且对该疾病发病机制的分子机制知之甚少。关键的论据涉及早期损伤的上皮靶点，以及异常间充质/上皮相互作用的分子特征。在这方面，我们最近观察到，细支气管上皮细胞和支气管-肺泡连接是IPF/UIP中细胞损伤的相关靶点，而异常的细支气管增生（包括增生、化生、细支气管化和蜂窝状）实际上可能代表了该病的实质性特征。16

许多证据表明，对调节肺发育和形态发生的分子途径的研究可能提供有关肺部疾病发病机制的重要信息。8,16肺发育的早期阶段依赖于复杂的分子网络，包括一系列刺激和抑制途径，包括胎儿生长因子,埃格夫,转化生长因子β/激活素,Wnt（重量）,刺猬,霍克斯,SOX公司,萌芽的和其他。17-22可以合理地假设，这些分子途径可以在出生后的生活中部分重现，因为正如在各种肺部疾病中观察到的那样，复杂的肺部结构可以在广泛损伤后精确地重建。

在这项研究中，我们重点关注Wnt信号及其效应物β-catenin，原因有很多。首先，这种相关的信号通路参与哺乳动物的肺发育和器官发生。19-22其次，金属蛋白酶matrylisin/MMP-7是β-catenin反式激活的靶点，最近被发现是肺纤维化的关键调节因子。23-25第三，Wnt通路与一些人类纤维性疾病的发病机制有关。26,27最后，最近有直接证据表明β-catenin信号在上皮-间质转化（EMT）诱导中的作用，EMT是胚胎发育、肿瘤进展和损伤后纤维化组织修复的关键阶段发生的重要过程。28-32

人们普遍认为，Wnt通路的激活或影响β-catenin反式激活功能的异常都可以被证明就地通过β-catenin积累的特异表达模式。特别是，如免疫组织化学所示，β-连环蛋白的细胞质/核积累是证明β-连环素翻译后稳定的可靠方法。33,34在本研究中，我们研究了β-catenin在一系列IPF/UIP样本中的表达模式，以及两个基因产物cyclin-D1和matrilysin/MMP-7，其表达受β-catening控制。23,24,35

材料和方法

结果

正常成人和胎儿肺中β-连环蛋白的细胞内表达模式

如前所述，在胎儿肺中，β-catenin核免疫染色显示在萌芽的肺泡结构中（图1a）▶.21在正常成人肺中，β-catenin的表达严格限制在所有内皮细胞和上皮细胞的细胞膜上，如清晰的线性免疫染色模式所示（图1b）▶在小比例的立方肺泡细胞中，细胞核明显聚集，根据形态学和免疫表型被识别为II型肺泡细胞，其特征是CK8/18/19和SP-a表达，CK5和ΔN-p63缺失（未显示）。

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图1。

答：胎肺（12周）：β-catenin的核表达在肺泡芽中明显，但在气道细胞中不明显。b：正常肺：细支气管基底细胞和纤毛细胞中β-catenin的离散膜免疫反应。抄送：IPF/UIP：增殖性细支气管病变中β-catenin的异常核聚积。日期：IPF/UIP：异常细支气管基底细胞中β-catenin的核表达。电子邮箱：IPF/UIP（串行段至d日)：cyclin-D1表达细胞。传真：IPF/UIP（串行部分至d日)：基质蛋白酶/MMP-7异常表达。克：IPF/UIP：H&E表现为小的蜂窝状细支气管病变。小时：IPF/UIP（串行段至克)：ΔN-p63核表达证明基底细胞增生。i：IPF/UIP（串行段至克)：CK5表达证明基底细胞增生。记者：IPF/UIP（串行段至克)：基底上皮细胞和管腔上皮细胞中β-catenin的异常细胞内表达。克：IPF/UIP（串行段至克)：cyclin-D1表达增加。我：IPF/UIP（串行段至克)：基质溶素/MMP-7在基底细胞中的异常表达。

IPF/UIP样本中β-连环蛋白的细胞内表达模式

在IPF/UIP患者中，表达核β-catenin的细胞数量显著增加，特别是在肺结构异常重塑明显的区域。

支气管病变

在大多数（20个样本中的18个）增殖性细支气管病变中，有大量上皮细胞表达β-catenin核聚积（图1；c、d和j）▶核β-catenin积聚在这些异常结构中分布不均，主要发生在增生的基底细胞簇中。核β-连环蛋白的存在在表现出蜂窝状改变的细支气管中尤其明显（图1，g和l）▶和/或细支气管化（支气管细胞迁移到肺泡腔的过程）。有趣的是，在相同的位点，p53和p21的核过度表达^waf1可以如前所述进行演示。16通过使用识别ΔN-p63和高分子量细胞角蛋白CK5的抗体在连续切片上证实了所有这些病变的细支气管性质（图1、h和i）▶以及之前证明的表面活性剂A和CC10抗原的缺失。16

肺泡结构

在受损的肺泡结构中发现表达核β-catenin的细胞，通过连续切片的形态学和免疫表型（表面活性剂-A阳性和ΔN-p63阴性）识别为立方型II肺细胞。阳性立方形肺细胞的数量从正常到严重受累肺泡逐渐增加（图2，a和b）▶β-catenin核表达见于所有增大和/或不典型立方细胞。

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图2。

答：IPF/UIP：立方型II肺细胞中β-catenin的核蓄积(箭头)在几乎未受影响的牙槽骨结构中。b：IPF/UIP：立方型II肺细胞中β-catenin的核蓄积(箭头)在严重受损的肺泡结构中。抄送：IPF/UIP：上皮下成纤维细胞病灶中梭形成纤维细胞中β-连环蛋白的核蓄积。日期：IPF/UIP（串行段至c（c）)：上皮下成纤维细胞病灶中纺锤形成纤维细胞中tenascin的强表达。电子邮箱：IPF/UIP：上皮下成纤维细胞病灶梭形细胞中β-catenin的核蓄积。注意β-catenin在支气管基底细胞中的核表达(箭头)。传真：OP/BOOP：管腔内Masson体梭形细胞和巨噬细胞（Mc）中未观察到核β-catenin表达。注意增生的II型肺细胞中有强烈的核免疫染色(箭头)。克：DAD：肺泡肺细胞中有明显的核β-catenin表达。间质成纤维细胞(箭头)巨噬细胞（Mc）缺乏明显的免疫反应性。小时：NSIP：支气管细胞膜β-catenin的表达。i：NSIP：基质蛋白酶/MMP-7在细支气管细胞中的罕见表达。记者：NSIP：核β-catenin在许多肺泡肺细胞中的表达。

成纤维细胞病灶

在20个样本中的16个样本中，在形成成纤维细胞灶的梭形细胞中观察到β-catenin的核表达，在这些样本中，可以清楚地识别这些病变，并在连续切片上进行免疫组织化学分析（图2，c和e）▶这些病灶的特征是肌纤维母细胞，在连续切片上表现为强烈的α-平滑肌肌动蛋白和tenascin免疫反应（图2d）▶，通常位于壁内，位于异常细支气管段下方，形成严格相关的病变（图2e）▶这种模式与OP/BOOP中的肺泡内炎性息肉（Masson体）不同（图2f）▶AIP/DAD间质成纤维细胞（图2g）▶样本用作对照，其中只有少数（不到10%）梭形细胞表达核β-catenin。

讨论

在这项工作中，我们提供了以前未被认识到的IPF/UIP中Wnt/β-catenin信号通路参与的证据，如β-catentin在不同参与位点的广泛核积累所证明的。我们使用免疫组织化学方法揭示了β-连环蛋白的亚细胞定位，从膜位置到细胞核。这种形态学方法能够高灵敏度地检测β-catenin的细胞内再分布和核积累，并被广泛用于证明Wnt通路在人类发育和病理中的激活状态。21,33,34,40-42为了进一步支持β-连环蛋白核免疫反应的功能意义，我们研究了就地Wnt/β-catenin途径的两个靶基因cyclin-D1和matrilysin的表达，表明这两个分子在同一参与位点显著过度表达核β-catening。

最后，我们搜索了影响β-catenin基因的突变，表明β-catentin基因的异常可能与观察到的Wnt通路的激活无关，尽管我们的技术可能遗漏了小部分细胞中发生的突变。需要进一步研究IPF/UIP样本中影响Wnt/β-catenin级联相关复杂分子阵列的其他遗传和/或表达异常，包括APC、Axin和GSK3β，以及Wnt配体和卷曲的受体。43事实上，根据我们的数据，尚不可能确定Wnt/β-catenin激活是该疾病的病因还是继发性。然而，本研究中研究的所有其他间质性肺疾病均无类似特征，这强烈表明了IPF/UIP中Wnt/β-catenin异常激活的致病相关性。

在本研究中，在IPF/UIP样本中的三个不同受累部位可以显示核β-连环蛋白的积聚：1）细支气管增生性病变，2）肺泡结构受损，以及3）成纤维细胞病灶。支气管增生性病变，包括基底细胞增生、鳞状化生、蜂窝状和细支气管化，在IPF/UIP中很常见，并且是该病公认的特殊特征。1-4,16根据我们的研究，Wnt通路的异常激活在这些病变中特别明显并延伸，在大多数情况下涉及基底细胞室。这个观察很有趣，因为基底细胞被认为是支气管和细支气管结构的更新成分。此外，这些发现是独特的，因为在正常肺样本和本文用相同方法研究的IPF/UIP以外的各种间质性疾病中，细支气管仅显示膜性β-连环蛋白免疫反应性。另一方面，在立方增生性肺泡细胞中观察到的β-catenin核表达可被视为对肺泡损伤的生理反应的一部分，因为II型肺泡细胞在肺泡增殖/再生发生的各种条件下表现出这种模式，包括胎儿发育，21以及各种肺部疾病，如AIP/DAD和OP/BOOP，如本研究所示。

核β-连环蛋白定位于形成IPF/UIP壁内成纤维细胞病灶（纤维增生斑块）的梭形细胞中，与AIP/DAD组织性肺炎和间质肌成纤维细胞的泡内Masson小体不同。这一发现是相关的，因为Wnt通路的异常激活实际上可以提供必要的自分泌生存信号，以诱导IPF/UIP壁内成纤维细胞病灶特有的对凋亡的抵抗。7,44-46在这方面，值得注意的是，由于基因突变导致的β-连环蛋白核聚积是侵袭性纤维瘤病（硬纤维瘤）发病机制的一个中心特征，硬纤维瘤是一类与IPF/UIP成纤维细胞病灶具有某些形态学和表型特征的间叶病变，包括Wnt通路的异常激活，如本研究所示。47,48最近的一项实验研究进一步支持了我们的假设，其中β-catenin稳定化能够失调间充质细胞的增殖、运动和侵袭性，从而导致转基因小鼠的增殖性成纤维细胞损伤。49

如上所述，β-catenin在异常核聚积模式中的分布涉及相邻隔室，主要集中在支气管-肺泡连接处。我们认为，这种特殊的带状分布可以解释UIP的一些典型组织学特征，如时间和空间异质性以及蜂窝状结构错位。1我们认为，这些数据与一种致病模型相一致，在该模型中，斑驳的外观，从早期病变到以IPF/UIP病变为特征的广泛纤维化和重塑，是由于异常β-catenin激活对生理组织修复机制的逐渐干扰而产生的，从正在进行的损伤和修复过程的病灶开始，如Wnt信号浓度梯度。Wnt靶基因的放松调控表达可能会对不同的气道成分（即细支气管和肺泡）产生不同的影响，最终导致肺泡损失和细支气管增殖。因此，在不同的系统和细胞类型中，Wnt通路的激活能够通过调节细胞周期蛋白D1和c的可用性来触发或抑制生存和死亡-myc公司，这两种蛋白质在细胞增殖和凋亡中发挥作用。50,51在这个模型中，肺泡细胞可能特别容易受到Wnt信号紊乱的影响，因为不同的分化和死亡诱导信号，包括p53、p21^waf1p63的反式激活亚型在损伤后修复肺泡中同时表达。16岁，52岁至55岁另一方面，通过截短的显性负性ΔN-p63亚型的组成性表达，可以保护支气管基底细胞免受凋亡的影响，从而产生强大的抗凋亡信号。16,56

Wnt通路激活在IPF/UIP中的致病作用进一步得到了就地β-catenin/LEF-1信号传导的另一个重要下游靶基因金属蛋白酶基质蛋白酶（MMP-7）异常表达的证明。最近的微阵列基因表达分析也证实了IPF/UIP中基质溶素表达的异常增加。25实验研究也提供了进一步的支持，因为苦参素基因敲除小鼠可以防止博莱霉素诱导的肺纤维化。25基质蛋白酶在细支气管增生性病变和肺重塑中的作用可归因于这种金属蛋白酶的特殊多功能作用，包括诱导上皮细胞迁移、凋亡和化生转化。57,58

在此背景下要讨论的最后一个相关主题是EMT可能参与IPF/UIP的发病机制。这些有趣的现象，已知发生在胚胎发生和癌症进展中，使细胞能够从其来源的上皮组织中解离并自由迁移。29此外，有明确的实验证据表明，成纤维细胞可以通过上皮细胞向间充质细胞的转化直接从组织纤维化中的上皮细胞衍生而来。30,32有趣的是，如实验EMT所示，β-连环蛋白信号在诱导上皮细胞的间充质表型中发挥相关作用，28,31因此有可能认为，在IPF/UIP的细支气管病变中观察到的β-catenin异常核化可能参与EMT相关过程，增加基底细胞运动（例如，通过改变金属蛋白酶的表达），从而促进细支气管化和组织重塑。该模型的另一个有趣的可能性是，IPF/UIP中的部分异常成纤维细胞可能直接来源于正在进行的损伤/修复过程中的上皮基底细胞前体，从而形成纤维母细胞边缘和异常细支气管段严格相关的特殊病变（如图2、c和e所示▶). 有趣的是，EMT可以由细胞因子（转化生长因子-β1、成纤维细胞生长因子-2、胰岛素样生长因子、白细胞介素-8）通过实验诱导，细胞因子的表达可以通过具有β-连环蛋白信号的复杂调节环来调节，并且可能参与肺纤维化的发病机制。28,59-64

总之，尽管本研究中无法确定导致IPF/UIP中Wnt通路异常激活的确切分子机制，但我们的研究结果有助于破译该疾病发病机制的分子机制，也可能有助于寻找新的药理策略来对抗不可逆的肺重塑。事实上，目前的研究主要集中在对Wnt途径发挥调节和抑制作用的分子上。65-67这些分子可能是Wnt通路紊乱的癌症以及IPF/UIP的潜在候选新治疗策略，IPF/UI是一种传统治疗方法无法令人满意的致命疾病。

脚注

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