特发性肺纤维化中Wnt/β-连环蛋白通路异常激活

研究人群

研究组包括20名先前未经治疗的患者，这些患者的临床、影像学（胸片和高分辨率计算机断层扫描（HRCT））、生理学和支气管肺泡灌洗检查结果均符合IPF的诊断。根据最近定义的标准，外科肺活检的组织学检查揭示了UIP的所有主要特征。1-4五份正常肺样本（肺癌大手术患者未受影响的组织碎片），两份胎儿肺样本（妊娠12周和15周），10份机化性肺炎（OP/BOOP）患者样本，4份非特异性间质性肺炎（NSIP）样本，2例急性间质性肺炎伴弥漫性肺泡损伤（AIP/DAD）和2例脱屑性间质性肺损伤（DIP），根据最新共识标准定义，4作为对照进行分析。所有样品按照标准方案固定在缓冲福尔马林和石蜡包埋中。

免疫组织化学染色和抗体

所有病例均用泛β-连环蛋白单克隆抗体（克隆15B8；西格玛化学公司，密苏里州圣路易斯）进行免疫染色。使用微波炉和0.01 mol/L柠檬酸缓冲液（pH 6.0）进行热诱导抗原回收30分钟。在自动细胞染色系统（GenoMx i6000，Biogenex）中使用敏感的抗生物素-链亲和素过氧化物酶技术（Biogenex，San Ramon，CA）处理所有样品。

为了更好地确定上皮和间充质病变的性质和分化水平，我们使用了识别低分子量细胞角蛋白8/18/19的抗体（克隆5D3，Biogenex）；细支气管基底细胞中表达的细胞角蛋白-5（CK5，克隆XM26；Novocastra，Newcastle，UK）；尿蛋白1，一种识别Clara细胞中CC10抗原的兔抗体（DAKO，Glostrup，丹麦）；识别表面活性蛋白A的SP-A单克隆抗体（克隆PE-10，DAKO）；识别α-平滑肌肌动蛋白的1A4单克隆抗体（DAKO）（无抗原回收）；识别tenascin的TN2单克隆抗体（DAKO）。此外，选择了一组抗体来彻底研究表达核β-连环蛋白的损伤的分子网络特征：单克隆抗体4A4（加州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司），与人类p63的所有已知变种发生广泛反应；p40抗体（癌基因研究产品，马萨诸塞州波士顿），一种多克隆兔抗血清，专门识别缺失反式激活域的截短ΔN-p63亚型；36p53特异性单克隆抗体（克隆DO-1，DAKO）；识别p21的单克隆抗体^{WAF1（加权平均1）}（克隆SX118，DAKO）。关于这些分子在正常肺和IPF/UIP样本中的详细信息之前已经描述过。16,37最后，为了更好地评估IPF/UIP样本中Wnt/β-catenin途径激活的功能，我们在连续切片上用免疫组织化学方法研究了cyclin-D1（克隆DCS-6；Progen Biot.，Heidelberg，Germany）和matrylisin/MMP-7（克隆141-7B2；Chemicon，Temecula，CA）的表达。

免疫染色评价

正常肺组织结构（如存在）用作β-catenin免疫染色的内部对照，只有正常支气管/细支气管段显示明确的膜结合β-catentin表达（线性模式）的制剂才被认为适合解释。核染色定义为空核明显时为阴性，同时有明显的膜免疫染色，而核免疫反应时为阳性。在轻度苏木精复染制剂中，阳性细胞核的颜色从蓝色变为棕色，可以更好地评估细胞核模式。

当细胞表型包括CK5和ΔN-p63表达时，上皮病变被定义为细支气管或支气管-肺泡交界。16只有核染色对p63、ΔN-p63、p53、p21呈阳性^{WAF1（加权平均1）}.

分子分析：β-连环蛋白基因测序

三个具有代表性的IPF/UIP样品用于分子分析。使用DNeasy Tissue试剂盒（加利福尼亚州查茨沃斯市齐根）从10μm石蜡切片中提取DNA。对于序列分析，β的外显子3-连环蛋白使用应用生物系统合成器（加利福尼亚州福斯特市）合成的引物，通过聚合酶链反应扩增该基因。引物序列（ATTTGATGGTGGAGAGATGGC和CCAGCTGTTCTTGAG TGAAGG）如前所述。38在含有50 ng DNA、每个引物5 pmol、2μmol/l dNTPs、1.5 mmol/l MgCl的10μl标准反应混合物中进行聚合酶链反应₂，0.5 U塔克DNA聚合酶（普罗米加，威斯康星州麦迪逊）。为了进行序列分析，使用QIAEX凝胶提取试剂盒（Qiagen）对50μl聚合酶链反应进行凝胶纯化。使用Applied Biosystem Dye Terminator Cycle-Sequencing kit（加州福斯特市Perkin Elmer）进行序列反应，并在Applied Biosystem 373型自动DNA测序仪（Perkin Elmer）上进行分析。四个毛瘤样本β-连环蛋白突变被纳入阳性对照。39

正常成人和胎儿肺中β-儿茶素的细胞内表达模式

如前所述，在胎儿肺中，β-catenin核免疫染色显示在萌芽的肺泡结构中（图1a）▶.21在正常成人肺中，β-catenin的表达严格限制在所有内皮细胞和上皮细胞的细胞膜上，如清晰的线性免疫染色模式所示（图1b）▶在小比例的立方肺泡细胞中，细胞核明显聚集，根据形态学和免疫表型被识别为II型肺泡细胞，其特征是CK8/18/19和SP-a表达，CK5和ΔN-p63缺失（未显示）。

IPF/UIP样本中β-连环蛋白的细胞内表达模式

在IPF/UIP患者中，表达核β-catenin的细胞数量显著增加，特别是在肺结构异常重塑明显的区域。

细胞周期蛋白D1和基质溶素的表达

通过连续切片的免疫组织化学分析，IPF/UIP样本中可显示大量同时表达细胞周期素D1和基质溶素的细胞（图1；e、f、k和l）▶Matrilysin免疫反应在所有类型的增殖性细支气管病变中均明显，在增生性和非典型基底细胞中表现出特殊的强度（图1、f和l）▶这种模式与正常和病理对照样品明显不同，在正常和病理对照样品中，基质溶素的表达似乎不一致（图2i）▶.

细胞周期蛋白D1和基质溶素都清楚地位于与β-连环蛋白核过度表达相对应的位置，尽管这三种分子在增殖性上皮病变的序列切片上的分布并不相同。事实上，β-catenin核和/或细胞质过度表达在绝大多数细胞中都很明显（图1、d和j）▶，而基质溶素和细胞周期蛋白D1仅在一定比例的细胞中表达（图1；e、f、k和l）▶这一发现的原因尚不清楚，但可能归因于未定义的分化信号。与此观点一致的是，基质溶素和ΔN-p63在支气管病变较浅部位的细胞中停止表达（图1、h和l）▶.

β-连环素在其他间质性肺炎中的细胞内表达模式

在所有OP/BOOP、AIP/DAD、NSIP和DIP分析的病例中，细支气管病变极为罕见，免疫组织化学分析未发现β-catenin异常表达（图2h）▶因此，在细支气管上皮中未观察到基质溶素过度表达（图2i）▶另一方面，在发生广泛肺泡损伤和修复的肺泡疾病患者（如AIP/DAD、OP/BOOP和NSIP）的样本中，表达核β-catenin的肺泡肺细胞比例显著（图2j）▶.

β-连环蛋白基因序列分析

扩增区测序后，在三个IPF/UIP样本中未发现突变迹象。在同一实验中，作为已知阳性对照分析的所有四个毛母细胞瘤样本在β-连环蛋白基因。