CHMP4B和自噬与微核的相关性：白内障形成的意义

摘要

1.简介

自噬是一个进化上保守的过程，细胞降解自己的细胞物质。它参与蛋白质和细胞器降解，并在细胞和全动物的体内平衡和分化中发挥重要作用。自噬有多种类型，如大自噬、微自噬和伴侣介导的自噬（有关全面综述，请参阅[1]). 在自噬过程中，细胞物质被隔离在称为自噬体的双层膜囊泡中。自噬体与内吞囊泡融合形成两性小体，两性小体包含内吞和自噬货物。自噬体和/或两性体随后与溶酶体融合，其中隔离的货物被溶酶体水解酶降解。降解产物通过溶酶体膜渗透传回细胞质，并可被细胞重复利用[1]。自噬在营养饥饿中起着细胞反应的作用，但也负责去除聚集的蛋白质和受损的细胞器，因此在蛋白质和细胞器的质量控制中发挥着重要作用。功能失调的自噬与衰老、神经变性、感染、肿瘤发生、心脏病、肝病、肺病、肌病和白内障形成有关[2]因此，在分子水平上表征这一过程很重要。

运输（ESCRT）机械所需的内体分选复合体是多泡体（MVB）生物发生、HIV-1和其他包膜病毒出芽、大自噬和胞质分裂所必需的[三,4]。ESCRT机械由四个复合体组成：ESCRT-0、ESCRT-I、ESCRT-II和ESCRT-III[三,4]。ESCRT-III对膜断裂事件特别重要[5]。基于电子显微镜研究，ESCRT-III蛋白CHMP4A和CHMP4B能够组装成弯曲并形成圆形阵列的细丝[6]。这些膜相关的ESCRT-III聚合物可以在MVB管腔内描绘和生成小泡，并参与膜断裂过程[6]。ESCRT-III催化膜断裂的能力也适用于其在其他过程中的作用，如胞质分裂和病毒芽变。已发现ESCRT-III组分CHMP4B在胞质分裂过程中的最后脱落步骤中起着非常重要的作用[7–9].

通过脱落完成胞质分裂取决于染色质从细胞间桥的完全清除，滞后染色体或桥接染色体可能会显著延迟[10]。这种缺陷发生在约1%的分裂体细胞中，在转化细胞中发生率更高[11,12]。染色体桥和微核经常发生在遗传毒性事件和染色体不稳定性期间[13]。染色体桥起源于后期，可能是由于姐妹染色单体的分离缺陷，也可能是由于DNA断裂和端粒末端融合的错误修复而形成的双着丝粒染色体[13]。微核在后期起源于落后的无着丝粒染色体或染色单体片段，这些片段是由未修复或错误修复的DNA断裂造成的[13]。有丝分裂末期完成时未能包含在子核中的整条染色体也可能导致微核形成[13]。重要的是，微核也可能来自染色体桥[14]。这些桥中的染色体通常容易断裂成多个片段，这些片段通常在有丝分裂结束时形成微核[14]。然而，目前尚不清楚这一过程是如何调节的，以及涉及哪些分子。

白内障是一种导致视力损害的晶体遗传疾病[15]。在眼球晶状体中，晶状体前表面的上皮细胞在一个过程中分化为纤维细胞，伴随着细胞形状的改变、晶体的表达、细胞器和DNA的降解，从而确保晶状体的透明度。晶状体上皮细胞终末分化为纤维细胞时DNA的降解与细胞分裂无关。晶状体中的DNA降解需要类DNase II酸性DNase（DLAD），而DLAD缺陷小鼠在晶状体分化过程中无法降解DNA。由于未消化的DNA积聚在纤维细胞中，DLAD缺陷小鼠形成白内障[15]。有趣的是，编码CHMP4B蛋白的基因，CHMP4B型，在常染色体显性白内障中发现突变[16]。然而，CHMP4B在晶状体纤维细胞分化过程中功能的分子细节及其与白内障形成的关系尚不清楚。

在这里，我们提供了证据表明CHMP4B与染色体桥和微核相关，并且自噬体和溶酶体在CHMP4B-阳性微核周围积聚。这表明CHMP4B可以介导核外染色质的自噬体降解。我们还表明，CHMP4B中的白内障相关突变消除了其对微核的补充。这就增加了一种可能性，即核外染色质的自噬体降解受损可以解释CHMP4B功能缺失时白内障的形成。

2.材料和方法

3.结果

3.1. CHMP4B定位于互连细胞中的各种类型的细胞间桥

先前的研究表明，在HeLa细胞的胞质分裂过程中，CHMP4B定位于靠近中心体的细胞间桥[7,8,17]。CHMP4B敏感且高度特异的抗体的可用性使我们能够通过共焦显微镜对该蛋白的定位进行更详细的研究。CHMP4B在相互连接的HeLa细胞中定位于各种类型的细胞间桥。这发生在一小部分细胞中（5.1±2.3%），但在所有进行的一系列实验中是一致的(n个= 25) (图1（a）). 在其他细胞类型中也观察到这种染色模式，如Hep2、MCF-7和U2O，其频率相似（Hep2细胞为3.2±1.8%，MCF-7细胞为3.7±1.9%，U2O细胞为4.2±1.2%）（图1（b）–1（d）). 我们的免疫荧光分析显示CHMP4B定位于薄（图1（a）,1（e）、和1（f）)或厚(图1（g）)桥接并显示出一个长的丝状定位模式，该模式似乎连接细胞并从靠近细胞核的地方发出。通常，CHMP4B积聚在各桥梁起点的大型结构中（图1（a）和1（克）). 这种染色模式独立于Aurora B染色，表明这些细胞间桥代表了不完全或缺陷胞质分裂的后续事件（图1（e）–1（克）). 为了检查这种染色模式是否只适用于CHMP4B，我们还测试了其他ESCRT-III成分的定位，如CHMP3。我们观察到CHMP3也在细胞间桥内形成丝状结构（参见补充材料中的补充图1（a）和1（b），网址为http://dx.doi.org/10.1155/2014/974393). 上述数据表明，ESCRT-III组分CHMP4B和CHMP3，除了在胞质分裂过程中在中心体的典型染色模式外，在连接分裂细胞的各种类型的细胞间桥中表现出额外的染色模式。

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图1

CHMP4B定位于互连细胞中的各种类型的细胞间桥。（a） 用CHMP4B、a-tubulin和Hoechst染色的HeLa细胞的共焦显微照片。CHMP4B定位于连接细胞的细胞间桥（箭头所示）。比例尺：10 μm.（b）–（d）用CHMP4B和Hoechst染色的Hep2、MCF-7和U2O细胞的共焦显微照片。CHMP4B定位于上述所有细胞系中细胞之间的桥（箭头）。比例尺：10 μm.（e）用CHMP4B、Aurora B和Hoechst染色的HeLa细胞的共焦显微照片。CHMP4B在胞质分裂期间定位于细胞间桥（箭头所示）。比例尺：10 μm.（f）-（g）用CHMP4B、Aurora B和Hoechst染色的HeLa细胞的共焦显微照片。CHMP4B定位为薄（比例尺：5 μm） （f）和厚度（比例尺：10 μm） （g）独立于极光B定位的桥（箭头）。

3.2. CHMP4B而非CHMP3与染色体桥和微核中的DNA相关

在我们的免疫荧光研究中，我们注意到DNA有时被困在细胞间桥中并形成染色体桥。为了测试CHMP4B与染色体桥的可能联系，我们用CHMP4A和Hoechst或DAPI进行染色，我们发现CHMP4B与染色体桥中的DNA强烈共定位（图2（a）–2（d）). 有趣的是，我们观察到CHMP4B也与微核共定位（图2（d）和2（e）). 这些结构通常在桥的入口处堆积，这表明它们可能来自染色体桥(图2（d）). CHMP4A/B的重要消耗导致微核数量增加（补充图2）。令人惊讶的是，我们观察到ESCRT-III组分CHMP3与染色体桥或微核无关（补充图1（c）和1（d））。上述数据表明，ESCRT-III组分CHMP4B而非CHMP3与染色体桥和微核中发现的DNA共定位。

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图2

CHMP4B定位于染色体桥和微核。（a） ，（b）用CHMP4B、Aurora b和Hoechst染色的HeLa细胞的共焦显微照片。CHMP4B与染色体桥相关（箭头）（比例尺：10 μm） （a）同样以更高的放大倍数显示（箭头）（比例尺：10 μm） （b）。（c） ，（d）用CHMP4B和Hoechst染色的HeLa细胞的共焦显微照片。CHMP4B附着在染色体桥上（箭头）（比例尺：5 μm） （c）与染色体桥中的DNA共定位（箭头）（比例尺：10 μm） （d）。（e） 用CHMP4B和Hoechst染色的HeLa细胞的共焦显微照片。CHMP4B定位于微核（箭头所示）。比例尺：10 μ米。

3.3. CHMP4B与组蛋白H2B和内核膜蛋白层蛋白A的共免疫沉淀

为了进一步研究CHMP4B与DNA的相关性，我们对CHMP4B和各种染色质相关蛋白（如组蛋白2B和层粘连蛋白A）进行了双重染色。我们如预期的那样观察到，CHMP4A在微核处与组蛋白2B和层粘着蛋白A共定位（图3（a）和3（b）)尽管在某些情况下，它似乎与拉明A没有共同定位(图3（c）). CHMP4B也在Lamin A阳性染色体桥处强烈积累(图3（d）).

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图3

CHMP4B与组蛋白2B和Lamin A共同免疫沉淀。（A）用CHMP4B、组蛋白2B和DAPI染色的HeLa细胞的共焦显微照片。CHMP4B与组蛋白2B在微核中共定位（箭头所示）。微核的放大倍数如插图所示。比例尺：10 μm.（b）–（d）用CHMP4B、Lamin A和DAPI染色的HeLa细胞的共焦显微照片。CHMP4B在某些情况下与微核中的拉明蛋白A共定位（箭头）（b），而在一些情况下与拉明蛋白不共定位（如箭头所示）（c），并定位于拉明蛋白染色的染色体桥（箭头所示（d）。比例尺：10 μm.（e）用CHMP4B抗体对HeLa细胞裂解物进行免疫沉淀（IP）。免疫沉淀蛋白通过Western blotting检测，使用抗H2B、抗Lamin A和抗CHMP4B抗体。

为了研究CHMP4B和染色质之间是否存在物理联系，我们在CHMP4A和组蛋白2B或层蛋白a之间进行了免疫沉淀实验。这些实验清楚地表明，CHMP4B与组蛋白2B和层蛋白a有物理联系(图3（e）). 综上所述，CHMP4B与染色质紧密结合。

3.4. Lamp1和LC3定位于微核附近

在常染色体显性白内障中发现CHMP4B突变[16]。白内障的形成与晶状体上皮细胞中细胞器和DNA的缺陷降解有关[15]。由于晶状体上皮细胞中的DNA降解被认为是由溶酶体机制介导的[19]，我们检测了CHMP4B阳性微核是否与溶酶体和自噬标记物相关。为此，我们用CHMP4B和晚期内体/溶酶体标记Lamp1对HeLa细胞进行共染色(图4（a）)以及自噬标记LC3(图4（b）). 我们观察到这两个标记均位于CHMP4B阳性微核附近，表明CHMP4A阳性微核可能通过HeLa细胞中的溶酶体机制降解（图4（a）和4（b）). 由于这种情况符合眼睛晶状体细胞分化过程中DNA降解的拟议机制，从而保护它们免受白内障的形成，我们用CHMP4B染色人类晶状体上皮细胞HLE B-3以测试其定位。我们发现CHMP4B确实定位于微核以及晶状体细胞中的细胞间桥（图4（c）和4（d）). 此外，还观察到溶酶体/自噬标记物Lamp1和LC3定位于人类上皮性晶状体细胞HLE B-3微核附近，进一步支持了我们在HeLa细胞中的发现（图4（e）和4（f）).

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图4

Lamp1和LC3位于HeLa和HLEB-3细胞微核附近。（a） 用CHMP4B、Lamp1和DAPI染色的HeLa细胞的共焦显微照片。Lamp1阳性溶酶体位于CHMP4B阳性微核附近（箭头所示）。比例尺：10 μm.用CHMP4B、Lamp1和DAPI染色的微核放大倍数如插图所示。（b） 用CHMP4B、LC3和DAPI染色的HeLa细胞的共焦显微照片。CHMP4B阳性微核与LC3相邻（箭头所示）。比例尺：10 μm.插图中显示了用CHMP4B、DAPI和LC3染色的微核的放大。（c） -（d）用CHMP4B、Lamin A和DAPI染色的HLEB-3细胞的共焦显微照片。CHMP4B存在于细胞间桥（c）和微核（d）上。比例尺：10 μm.（e）-（f）用Lamp1、LC3和DAPI染色的HLEB-3细胞的共焦显微照片。Lamp1阳性和LC3阳性结构位于微核附近（箭头所示）。比例尺：10 μ米。

3.5. 白内障中发现的CHMP4B突变使其定位于染色体桥和微核

为了进一步研究CHMP4B在白内障形成中的功能作用，我们询问野生型和白内障突变型CHMP4B与染色质的结合能力是否存在差异。为此，我们用FLAG-CHMP4B全长结构转染HeLa细胞，并用DNA染色体桥和微核（图5（a）,5（b）、和5（e）). 我们使用FLAG-CHMP4B全长构建物重复了该实验，该构建物包含在白内障患者中发现的突变D129V（图5（c）,5（d）、和5（e）). 我们发现，平均在五个单独的实验中，84.9%的野生型FLAG-CHMP4B转染细胞在转染蛋白和染色体桥或微核之间表现出强烈的共定位，而在突变结构中，该比例显著降低至43.3%(图5（e）). 这些结果表明，在白内障中发现的CHMP4B突变蛋白与染色质有缺陷的关联。

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图5

白内障中发现的CHMP4B突变体对染色体桥和微核的定位降低。（a） -（b）全长转染FLAG-CHMP4B并用FLAG表位M2抗体和Hoechst染色的HeLa细胞的共焦显微照片。FLAG-CHMP4B全长与染色体桥和微核（a）-（b）（箭头）密切相关。比例尺：10 μm和5 μm.（c）-（d）全长转染FLAG-D129V-CHMP4B并用FLAG表位M2抗体和Hoechst染色的HeLa细胞的共焦显微照片。FLAG-D129V-CHMP4B全长与染色体桥和微核无明显关联（箭头所示）。比例尺：10 μm.（e）用FLAG-CHMP4B全长野生型与FLAG-CHMP4B-D129V全长突变体转染细胞中与DNA共定位的%CHMP4A定量的图示。误差条显示平均值±SD。FLAG-CHMP4B全长：5个独立实验，n个=651个单元格。FLAG-CHMP4B-D129V全长：5个独立实验，n个=570个单元格。P（P）全长FLAG构造的值：0.048。这个P（P）数值来源于独立样本的比较平均值吨-测试（SPSS，v.16.0）。

4.讨论

ESCRT-III亚单位CHMP4B通过参与支持细胞间桥收缩和最终脱落的螺旋丝的形成，在胞质分裂期间的最终脱落步骤中发挥关键作用[7–9]。在这里，我们展示了CHMP4B在不同细胞系中的染色体桥和微核的新定位模式。这种定位，加上我们发现溶酶体和自噬体聚集在微核周围，表明CHMP4B可能介导核外染色质的溶酶体降解。

微核是由癌细胞系中的染色体桥产生的[14]。CHMP4B是第一个定位于这两种结构的非核蛋白，因此将胞质分裂失败与微核联系起来。CHMP4B在这一过程中的作用必须在未来的研究中详细说明，但有趣的是，ESCRT-III以前曾与细胞内蛋白质聚集体的降解有关[20]提示染色质降解的相关机制。

重要的是，在HLEB-3人晶状体上皮细胞系中也观察到CHMP4B的微核定位。在常染色体显性白内障中发现编码CHMP4B蛋白的基因突变[16]这是一种分子机制未知的疾病，尽管已知其与晶状体细胞从上皮细胞向纤维细胞分化过程中细胞器和染色体DNA的不成功降解有关[15,21]。基于小鼠模型的研究，DNase II类酸性DNase（DLAD）被证明是晶状体中染色体DNA降解的原因[19]。已发现DLAD与溶酶体标记Lamp1共定位[19]这表明DNA可能通过溶酶体降解发生降解。我们发现溶酶体和自噬标记Lamp1和LC3位于HeLa和HLEB-3细胞中CHMP4B阳性微核周围，表明微核可能通过溶酶体降解被消化。

有趣的是，与野生型蛋白相比，在白内障患者中发现的CHMP4B D129V突变可以消除其微核定位。这表明CHMP4B可能在介导微核降解中发挥作用。我们推测CHMP4B可能促进溶酶体向微核募集或溶酶体与微核膜融合。由于晶状体细胞分化过程中细胞核的降解与溶酶体机制有关[15,19,21,22]我们认为CHMP4B参与了晶状体细胞分化过程中染色体DNA的溶酶体降解，从而防止白内障的形成。晶状体分化过程中的器官降解独立于典型的自噬机制，因为已发现在ATG5和PIK3C3/VPS34缺陷小鼠中正常发生[23,24]。在我们的实验中，我们观察到自噬体位于微核附近。自噬可能促进微核的小部分降解。这一观察结果与Nakahara等人报告的结果一致，他们发现自噬的表达与自动变速器组3和atg4b在小鼠纤维晶状体细胞分化过程中，基因显著上调[19]。此外，最近的研究表明，人类晶状体表达进行自噬所需的全部基因[25]这些基因在成人晶状体上皮细胞和分化纤维细胞中都有表达。此外，据报道，ATG5非依赖性和PIK3C3/VPS34非依赖性自噬在红细胞分化和神经元发育期间的细胞器自噬消除中发挥作用[26,27]提出非规范自噬也可能参与晶状体分化的可能性。研究还表明，自噬基因FYCO1（FYVE和卷曲线圈域包含1）的突变会导致常染色体隐性遗传先天性人类白内障[28]自噬和有丝分裂在晶状体细胞器降解中起作用[28,29]。最后，Rello-Varona及其同事最近报告说，微核可以进行自噬降解[30]。这些报告和我们目前的数据表明，自噬对人类晶状体细胞的分化很重要。

胞质分裂缺陷也可能导致白内障。有报道表明，犬尿氨酸引起的细胞周期阻滞和磷酸化受损波形蛋白的表达可能在白内障的形成中起作用[31,32]。因此，考虑到CHMP4B在胞质分裂中的作用，我们不能排除晶状体细胞中CHMP4B功能缺陷可能因胞质分裂失败而导致白内障的可能性。

总之，在本研究中，我们证明CHMP4B是染色体桥和微核的一种新的常见成分。我们认为CHMP4B可能参与微核的自噬体降解，这可能与晶状体细胞分化和白内障形成过程中的DNA降解有关。未来的研究有望对这些过程的分子细节有更多的了解。

补充材料

致谢

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