结果
相间MN分隔的不可逆损失
为了确定为什么MN与PN在同一细胞中具有广泛的功能障碍，我们首先检查了两个报告者的核分区：2×RFP融合到核定位信号（RFP-NLS）和4×GFP融合到细胞核输出信号（GFP-NES）。我们对U2OS细胞进行了延时显微镜观察，结果发现，正如预期的那样，NE形成后，RFP-NLS在U2OS的PN和MN室中累积，而GFP-NES被排除在外(). 然而，尽管PN在整个间期内保持了报告蛋白的正确定位，但大量MN表现出RFP-NLS的快速不可逆丢失，同时未能从染色质中排除GFP-NES(和电影S1). 核和细胞质报告子的定位错误表明核渗透屏障被破坏。因此，我们将此事件称为MN中断。
间期细胞中微核经常不可逆地失去分区（A） U2OS 2×RFP-NLS（RFP-NLS）细胞表达4×GFP-NES（GFP-NES）并用Hoechst标记后的延时成像静像。NEF=NE地层。时间为h:m。比例尺=10μm。（B） 通过延时成像定量间期MN命运。N=122 MN，来自3个实验。（C） U2OS GFP-IBB mCherry-H2B细胞有丝分裂后MN命运的延时成像定量。N=44个完整的MN和165个破坏的MN来自3个实验。Fisher精确检验P>0.05，用于图中的所有数据。（D）固定U2OS细胞中完整（箭头）和破坏（箭头）MN的图像，标记有LSD-1和层粘连B1（LmnB1）抗体（顶部）或视网膜母细胞瘤（Rb）和层粘着A（LmnA）抗体（底部）。比例尺=10μm。（E） MN完整性定量和可溶性核蛋白标记。N=300 MN/来自3个实验的标签。φ=功率因数相关系数。（F） 稳定表达GFP-NLS的异步癌细胞系中MN完整性的量化。N=250 MN/细胞系，来自3个实验。（G） 有丝分裂24小时后非转化细胞系中MN完整性的实验示意图和量化。N=300 MN/来自3个实验的细胞系。（H） 实验示意图（顶部）和U2OS GFP-NLS细胞中完整MN的比例固定在指定的细胞周期阶段。末期（telo）数据来自延时成像分析。对于telo，N=125 MN。3个实验中的300 MN/时间点。另请参见图S1和电影S1.
为了确定MN被破坏的比例，我们通过表达3×GFP的U2OS细胞的延时成像来量化MN的命运，该细胞融合到含有NLS的重要蛋白-β结合域（IBB）和H2B-mCherry。我们发现，在单个间期，超过65%的MN被破坏，只有一小部分能够在有丝分裂前修复NE并重新累积GFP-IBB(). 通过这些实验，我们还能够确定有丝分裂后MN染色质的命运。我们发现，分裂对第二次有丝分裂后产生MN的频率没有显著影响，分裂的MN至少有50%的时间重新加入PN染色质().
为了证实MN的破坏涉及到完全失去分区，我们首先询问了内源性核蛋白视网膜母细胞瘤（Rb）（细胞周期调节器）和LSD-1（组蛋白去甲基化酶）是否也从破坏的MN中丢失。我们发现，MN的LSD-1和Rb标记与NLS报告子的存在密切相关，并且这些蛋白很少出现在受损的MN中(). 因此，这些蛋白质的错误定位是MN破坏的可靠指标。
其次，我们询问被破坏的MN是否可以通过在U2OS细胞中表达包含NLS和NES融合到tdTomato（NES-tdTom-NLS）的穿梭结构并阻断核输出来积极积累核蛋白。NES-tdTom-NLS在PN和完整MN中累积，但在中断MN中不累积(图S1A和S1B)验证核蛋白的积累被消除。这些数据证实，被破坏的MN完全失去了分区。
接下来，我们分析了来自不同组织的癌细胞系中的MN破坏，发现与U2OS细胞中相同比例的完整和破坏的MN(). 然后我们评估了两种非转化细胞系（稳定表达GFP-NLS的永生化上皮细胞系RPE-1）中MN的破坏情况(图S1C)和原代成纤维细胞系IMR90。用LSD-1标记法检测IMR90细胞中MN的完整性。因为这些细胞通常只产生很少的MN，所以我们用诺康唑处理细胞以诱导整个染色体的错误分离(Cimini等人，2001年). 这种治疗也会导致p53依赖性G1期阻滞(Li等人，2010年;汤普森和康普顿，2011年;Crasta等人，2012年). 在这两种细胞系中，我们发现大约50%的MN在有丝分裂24小时后被破坏()表明MN破坏在正常细胞和转化细胞中频繁发生。
接下来，我们询问MN破坏是否是细胞周期特异性的。首先，在诺可达唑中短暂孵育后，通过有丝分裂甩开使细胞同步，并用EdU脉冲标记，以在指定的时间点固定之前识别S期细胞。有丝分裂结束后，延时成像显示几乎所有MN都完好无损，但完整MN的比例在整个间期内稳步下降(). 与随机MN中断一致，延时成像实验显示MN中断发生在整个间期，以至于超过50%的MN中断超过间期持续时间的一半(图S1D).
为了确定MN破坏频率是否存在细胞周期特异性差异，我们首先通过有丝分裂振荡使U2OS细胞同步化，并将其在羟基脲（HU）或Cdk1抑制剂RO-3306中培养48小时，以分别将其阻滞在S期或G2期。根据FACS分析评估，所用药物的浓度足以引发逮捕（数据未显示）。在停搏过程中对固定细胞的检查显示，S期和G2期停搏中完整MN的比例逐渐下降(图S1E). 我们还分析了G1阻滞的RPE-1 GFP-NLS细胞中的MN，发现完整MN的比例在G1阻滞期间也降低(图S1F). 这些数据证实了MN断裂频率与细胞周期无关，断裂MN的比例随着间期的延长而增加。
最后，我们询问MN染色质的一般特征是否影响其命运。使用MN的初始大小作为染色质数量的代理，我们观察到MN断裂与染色质数量之间没有相关性(图S1G). 我们还发现，在具有着丝粒（全染色体起源）的MN或缺乏着丝粒的MN（断裂染色体起源）中，断裂频率没有差异(图S1H和S1I). 这些数据表明，染色质的数量和着丝粒的存在不是MN命运的重要因素。
MN中断是由NE崩溃造成的
因为大多数MN在有丝分裂出口处都是完整的，所以我们想研究为什么它们在进行间期时会失去分区。我们首先询问，受损MN中的室化丢失是否是NPC丢失的结果。我们用免疫荧光法检测了完整和受损MN中NPC成分的水平，发现mAb414识别的核心核穿孔蛋白在受损和完整MN中的水平相似(图S2A和S2B)这表明NPC蛋白的缺失并不是导致细胞分区丢失的原因。然而，在一些受损的MN中，mAB414标记似乎是杂乱无章的。相反，我们发现在MN受损的情况下，篮核孔蛋白Nup153和TPR的水平降低(图S2C和S2D). 然而，TPR和Nup153的损失不足以解释在核贩运中观察到的缺陷(Frosst等人，2002年;Mackay等人，2009年).
其次，我们询问MN的破坏是否是核膜非有丝分裂性破坏的结果。我们通过U2OS细胞的延时成像监测了MN断裂的动力学，并将其与PN中的间期NE断裂动力学进行了比较，之前已经对其进行了表征(Vargas等人，2012年). 我们发现，MN中断期间GFP-IBB损失的半衰期与PN-NE破裂的半衰时间相似(和电影S2和第3章)这表明MN通过NE的破坏而失去了分区。为了区分这两个过程，我们将其称为PN中的“NE断裂”和MN中的“东北塌陷”。
MN断裂发生于NE塌陷，其特征是染色质侵入内质网小管（A） U2OS GFP-IBB、H2B-mCherry细胞经历PN断裂和修复（上图）和MN断裂（下图）的延时成像静像。星号表示PN NE破裂的部位（顶部），箭头表示MN（底部）。时间为m:s。图中所有比例尺=10μm。（B） PN-NE断裂和MN断裂期间细胞核GFP-IBB分数荧光强度分析。破裂半场时间、平均值和s.e.m如图所示。N=5。（C） U2OS RFP-NLS细胞中完整和破坏的MN图像，表达Sec61B-GFP并标记内质网蛋白钙网蛋白。（D） DAPI染色定义的完整和受损MN核边缘Sec61B-GFP存在的定量。N=300 MN/来自3个实验的类别。φ=功率因数相关系数。（E） U2OS GFP-NLS细胞中完整和破坏的MN图像，表达V5标记的网状蛋白3（V5-Rtn3），并标记有钙网蛋白。装箱区域的X-z和y-z投影分别覆盖5.48μm（顶部）和5.97μm（底部）堆栈。在顶部（完整MN）投影中，为了清晰起见，省略了GFP-NLS。（F） 有丝分裂后8小时和18小时U2OS GFP-NLS细胞完整（左）和中断（右）MN的TEM图像。在完整的MN膜中（箭头）被排除在染色质之外，在断裂的MN ER膜中，染色质内可见。另请参见图S2,电影S2,电影S3、和电影S4.
PN的NE破裂在几分钟内修复，而MN的NE塌陷几乎总是不可逆的。为了研究MN中断期间NE结构的改变，我们对表达Sec61B融合GFP（Sec61B-GFP）的细胞进行了延时成像，该细胞定位于内质网和外核膜，通过钙网蛋白标记进行鉴定(). 我们观察到大多数MN（27/29）在断裂后NE和染色质都发生了不可逆的塌陷(图S2E和电影S4). 对固定细胞的分析表明，核边缘Sec61B-GFP的丢失与MN破坏密切相关(). 出乎意料的是，我们注意到Sec61B-GFP在暴露的MN染色质上富集。这不太可能标志着内质网膜的聚集，因为钙网蛋白没有显示出类似的聚集(). Sec61B-V5也观察到类似结果(图S2F)以及INM蛋白LBR和Lap2β（数据未显示）。这些结果表明，MN断裂后染色质相关NE/ER膜的蛋白质组成发生了显著变化。
我们还观察到，在断裂的MN中，内质网膜未能从染色质中正确排除。为了确定这些膜是否代表内质网小管，我们观察了管状内质网蛋白3（Rtn3）标记的定位(Voeltz等人，2006年)，通常不包括在NE和ER表中(Anderson和Hetzer，2007年). V5标记的Rtn3从PN和完整的MN NE中耗尽，后者由钙网蛋白标记(顶部）。然而，V5-Rtn3和钙网蛋白在受损MN的染色质中存在(底部），表明管状内质网与暴露的染色质异常相关。为了证实ER侵入受损的MN染色质，我们用透射电镜（TEM）检查了有丝分裂后8小时或18小时固定的U2OS细胞的MN超微结构。在8小时的样本中，PN和MN都被完整的NE包围(，左）。然而，在18小时时，我们观察到MN被破坏，其中卷曲的核糖体包裹的内质网膜与细胞质染色质相关(（右），与内质网小管侵入受损的MN染色质一致。
为了进一步表征与NE塌陷相关的染色质结构变化，我们分析了受损MN中DAPI染色的大小和强度。我们观察到，受损MN通常比完整MN更小，更浓缩(图S2G和S2F). 我们还观察到，随着染色质致密程度的增加，MN断裂与乙酰-雌酮3-K9（开放染色质的标志）的丢失之间存在着强烈的相关性(图S2I). 综上所述，这些数据表明，MN断裂是由NE塌陷引起的，其特征是染色质致密化，不能将内质网小管排除在染色质块中。
NE塌陷由层粘连紊乱触发
我们实验室的研究表明，PN中的NE断裂与核纹层中的缺陷密切相关(Vargas等人，2012年). 为了确定NE塌陷前MN的层粘连蛋白B1（LmnB1）在完整MN中的定位，我们检查了层粘连蛋白B1（LmnB1）在完整MN中的定位。观察到两种形态：1）类似于PN的LmnB1的连续核边缘，以及2）以层粘连蛋白中一个或多个大孔为特征的不连续LmnB1标记(). 为了确定MN断裂是否与椎板不连续性有关，我们通过延时成像监测了MN中RFP标记的LmnB1。在19/19 MN，我们观察到在NE塌陷之前出现了较大的椎板层间不连续性(电影S5). 在一些病例中，在有丝分裂结束时NE重新形成后不久，这些空洞就很明显了(电影S6). 在间期，我们没有观察到完整MN的椎板孔收缩，这表明这些孔是稳定的，并且不易修复。这些数据表明，在间期的不同阶段，可能会发生由机制尚待确定的层片紊乱，从而触发MN破坏。
完整MN中层粘连蛋白B1的耗竭触发MN中断（A） 固定U2OS GFP-NLS细胞中完整（箭头）和破坏（箭头）MN的层粘连B1（LmnB1）形态图像。图中所有比例尺=10μm。（B） 异步细胞中LmnB1形态的量化。N=300 MN/来自3个实验的类别。所有p值均来自费希尔精确测试。（C） 表达指示的层粘连蛋白B1构建体的异步细胞系中MN完整性的定量。mCh=m樱桃。ND=不可降解。图上的数字表示指示样本的p值。N=300 MN/来自3个实验的细胞系。（D） 非LmnB1缺失的U2OS细胞（顶部）中完整MN的不连续薄层结构照明图像和用指示抗体标记的表达LmnB1 shRNA的U2OS细胞（底部）的PN。（E） 表达mCherry或mCherry-LmnB2的细胞系中MN完整性的量化。N=300 MN/来自3个实验的细胞系。另请参见图S3,电影S5、和电影S6.
中断后，LmnB1经常失去外周定位并出现塌陷(,电影S5,第6页)与我们之前观察到的NE相似。对固定细胞的分析表明，塌陷的椎板层形态与破坏的MN密切相关().
先前的工作表明，LmnB1的损失会导致叶片中形成孔洞(Vergnes等人，2004年)并显著增加NE断裂的频率(Vargas等人，2012年). 为了确定LmnB1水平是否同样影响MN破坏，我们耗尽U2OS细胞中的LmnB1并观察MN完整性。与对照组相比，我们观察到LmnB1缺失细胞中被破坏的MN的比例显著增加(和S3A系列). 在耗尽LmnB2或LmnA/C时未观察到这种影响(图S3A-S3C)并通过转染LmnB1 siRNA进一步降低LmnB1水平而增强(图S3D和S3E). 非降解LmnB1的表达将MN干扰降低到对照水平(,S3D和S3E)，表明MN破坏是LmnB1耗竭的一个特异性。我们还通过超分辨显微镜分析了完整MN中的LmnB1组织，发现其特征是叶片上有类似于LmnB1缺失PN的大孔(). 我们没有在MN中检测到磷酸化的层粘连蛋白，这表明层粘连的破坏与有丝分裂激酶的活性无关（数据未显示）。这些数据表明，MN的NE崩塌与LmnB1耗竭有关。
为了确定层粘连蛋白的过度表达是否足以抑制MN的破坏，我们在U2OS细胞中表达Lmn B2(图S3H和S3I). 使用LmnB2是因为它在维持核结构方面与LmnB1具有重叠功能(Coffinier等人，2010年)但与LmnB1不同，在过度表达时不会引起大规模结构改变(舒马赫等人，2006年). 我们观察到，与对照细胞相比，表达LmnB2的细胞中完整MN显著增加(). 因此，我们的数据表明，MN破坏是由于椎板结构紊乱所致，特别是LmnB1水平降低，增加椎板B水平可以防止破坏。
MN破坏导致广泛的微核功能障碍
隔室化是蛋白质在细胞核中正确定位和集中的先决条件，而细胞核是调节基因组功能的基础。因此，我们评估了MN破坏对核功能的影响，并询问它是否可以解释先前在MN中发现的缺陷。我们首先通过用活性RNAPolII（RNAPolII-pphospho-S2）抗体标记细胞来评估转录，该抗体是延长RNAPolIII的特异性抗体(Ni等人，2004年). 我们观察到RNAPolIIpS2存在于大多数完整的MN中，但几乎所有受损的MN都不存在(). 我们还通过寡核苷酸-dT荧光检测了核mRNA含量就地杂交发现成熟的mRNA存在于完整的MN和PN中，但在破坏的MN中不存在(图S4A). 这些数据表明，中断与转录完全丢失密切相关。
MN破坏导致mRNA转录、DNA复制和DNA损伤修复和传感的丢失（A） 用活性RNA聚合酶标记抗RNAPolIIpS2固定并标记的异步U2OS GFP-NLS细胞图像。在整个图中，完整和破裂的MN分别用箭头和箭头表示。所有比例尺=10μm。（B） MN完整性量化和RNAPolIIpS2标记。对于本图中的所有量化，n=300 MN/来自3个实验的类别。P值来自Fisher精确检验，φ=图中所有图形的相关系数。（C）有丝分裂后24小时用EdU标记的MN的实验示意图和图像。（D） EdU阳性PN细胞中MN完整性的量化和EdU标记。（E）非同步细胞中标记DSB的抗γ-H2AX抗体标记MN的图像。（F） MN完整性定量和γ-H2AX标记。（G） 用阿霉素（doxo）处理G1细胞1h并用抗γ-H2AX标记的实验示意图和图像。（H） 在多索培养1小时后，PN和完整且受损的MN中含有一个以上γ-H2AX病灶或一个扩大的γ-H2AX病灶的比例。P和φ值仅比较完整和中断的MN。另请参见图S4.
为了确定MN破坏对DNA复制的影响，我们通过有丝分裂振荡使细胞同步化，并在EdU的存在下将其释放到间期。24小时后，我们发现在EdU阳性PN的细胞中，几乎所有被破坏的MN都完全缺乏EdU标记(). 相比之下，大多数完整的MN都含有EdU，尽管约20%缺乏EdU标签。完整MN的复制缺陷与之前的研究一致，该研究表明MN早期复制因子招募延迟(Crasta等人，2012年). 然而，我们的数据表明，MN的破坏与DNA复制的完全停止密切相关。
最后，我们询问DNA损伤修复是否在受损的MN中受损。为了评估DNA损伤的程度，我们寻找γ-H2AX的病灶，γ-H2AX是一种在双链DNA断裂（DSB）位点发现的修饰组蛋白(Ciccia和Elledge，2010年). 我们在大约60%的受损MN中发现多个病灶或单个大病灶的γ-H2AX累积，但在完整MN中很少发现(). γ-H2AX病灶的出现可以通过层粘连蛋白B2的过度表达来预防(图S4B)，证实了MN破坏与DNA损伤积累之间的强烈相关性。我们还分析了细胞周期中MN破坏积累的DNA损伤，发现与G1期相比，S期和G2期γ-H2AX标记的MN破坏的比例显著高于G1期(图S4C). 在完整的MN中未观察到变化（数据未显示）。用裂解酶3标记细胞表明γ-H2AX阳性MN与凋亡细胞无关(图S4D). 这些数据表明DNA损伤积累与MN破坏密切相关。
破坏的MN中的γ-H2AX信号可能代表破坏后发生的新的DNA损伤，也可能代表完整MN中发生的DNA损伤修复失败。为了区分这些可能性，我们用多柔比星（一种DSB诱导剂）处理G1细胞，并量化γ-H2AX病灶。阿霉素导致100%的PN和大多数完整的MN出现多个γ-H2AX病灶，但破坏的MN基本上没有病灶()表明受损的MN既不能感知新的DNA损伤，也不能修复现有的损伤。
DNA损伤不会导致MN破坏
缺乏具有累积γ-H2AX的完整MN，以及受损MN无法获得DNA损伤标记，表明DNA损伤和MN破坏可能同时发生。先前的研究表明DNA损伤会影响核组织(Misteli和Soutoglou，2009年)因此，我们想知道DNA损伤是否会导致MN中断。我们首先研究了诱导DSB对MN中断的影响。G1细胞主要含有完整的MN，用二甲基亚砜或阿霉素处理1小时。然后冲洗药物，让细胞恢复20小时。我们发现，尽管DNA损伤在阿霉素处理的细胞核中持续释放后至少20小时()，二甲基亚砜或阿霉素处理的细胞中被破坏的MN的比例相同()表明DSB的形成和DNA损伤修复蛋白的招募并没有增加MN破坏频率。
DNA损伤不会导致MN破坏（A） U2OS细胞在DMSO或阿霉素（doxo）中孵育1小时后，用抗γ-H2AX标记20小时的实验示意图和图像。所有比例尺=10μm。箭头和箭头分别表示完整和中断的MN。（B） 按（A）处理的细胞中MN完整性的量化。P值>0.05，通过Fisher精确测试确定。N＝300 MN/来自3个实验的条件。（C） 同步化细胞在指定浓度下用HU处理20小时的实验示意图和图像，用γ-H2AX抗体固定并标记。（D） HU孵育20小时后用多个γ-H2AX病灶定量完整MN。上图中的P值是指通过费希尔精确测试确定的指示样品。N=250 MN/来自3个实验的浓度。（E） 在HU中培养20小时的细胞中MN完整性的量化N=250 MN/来自3个实验的浓度。P值>0.05（χ）2分析。
为了证实这一发现，我们通过培养不同浓度HU的G1细胞，研究了复制应激对MN破坏的影响(Petermann等人，2010年). 我们检测了24小时孵育后受损MN的比例，发现尽管PN中γ-H2AX病灶数量增加()和完整的MN()随着HU浓度的增加，破坏MN的比例没有显著差异(). 因此，断裂似乎是MN中DNA损伤累积的原因，而不是结果。
非小细胞肺癌中MN的破坏
为了确定MN破坏是否仅限于培养细胞，或者是否也发生在实体肿瘤中，我们观察了核完整性的直接标志物LSD-1的定位()以及γ-H2AX，这是人类非小细胞肺癌（NSCLC）肿瘤石蜡切片中受损MN功能丧失的标志物。NSCLC肿瘤的特征是染色体高度不稳定(Nakamura等人，2003年;Birkbak等人，2011年)因此，和可能具有较高的MN频率。使用两个标准鉴定MN：第一，染色质块必须完全包含在石蜡切片z平面内，第二，染色质团必须与较大的PN存在于同一细胞内。后者是用E-cadherin抗体标记细胞连接来确定的。使用LSD-1和γ-H2AX标记，我们鉴定了NSCLC肿瘤中的两个MN群体。第一组的LSD-1水平较高，没有γ-H2AX标记，表明MN完整(，顶部）。第二组没有LSD-1标记，γ-H2AX水平较高，表明MN受到破坏，积累了DNA损伤(，底部）。对γ-H2AX阳性MN的进一步检查表明，它们也缺乏TPR和乙酰-雌酮3K9(图S5A和S5B)、和存在于非凋亡细胞中(图S5C)表明它们代表真正的分裂MN。
非小细胞肺癌肿瘤中存在MN中断（A） 非小细胞肺癌（NSCLC）肿瘤石蜡切片的免疫荧光显示完整（箭头）和破坏（箭头）MN。切片标记有E-cadherin、γ-H2AX和LSD-1抗体。比例尺=10μm。图像是4μm（顶部）和5.5μm（底部）z堆栈的最大强度投影。（B和C）腺癌和鳞癌肿瘤的免疫荧光。用E-cadherin和γ-H2AX抗体标记切片，并用DAPI和Sypro-Ruby染色。下部面板是装箱区域的放大图像。通过伪彩色合并DAPI/Sypro Ruby图像生成Pseduo-hemoxylin和eosin染色（H&E）图像。（C）中的箭头表示其他中断的MN。比例尺=50μm。（D） MN中断模型。滞后染色体在有丝分裂退出时形成MN。此时MN的NE可能已经异常。在间期的某个时刻，叶片的解体触发NE塌陷和MN蛋白质的丢失。NE塌落后，MN染色质变得致密并被管状ER渗透。该染色质要么正常分离，要么在下次有丝分裂时再次成为MN。另请参见图S5.
2/3的肺腺癌和1/1的鳞状细胞癌中检测到MN的破坏。假染色DAPI和Sypro-Ruby染色分别与苏木精和伊红染色相似，证实两种类型的肿瘤细胞中均存在MN的破坏(). 综上所述，这些数据表明发生了MN中断体内在实体肿瘤中。
讨论
历史上，MN被认为是染色体不稳定的被动指标。然而，越来越多的证据表明，分离成MN对可能导致染色体不稳定的染色质具有重要的负面影响(Hoffelder等人，2004年;Terradas等人，2009年,2012;Xu等人，2011年;Crasta等人，2012年). 在本研究中，我们证明了同步的广泛MN功能障碍和大规模DNA损伤是由培养细胞和实体肿瘤中MN的不可逆NE崩溃引起的。我们发现，在间期，细胞群中的大多数MN在不可逆NE崩溃后失去了分区。NE完整性的丧失会阻止基本的核功能，包括复制、转录和DNA损伤识别和修复。在MN的NE塌陷之前，层粘连组织中的缺陷与层粘连B1水平的降低特别相关。断裂MN的特征是染色质和相关内质网膜及INM蛋白的构象发生较大变化，可能抑制NE修复(). 重要的是，不仅在培养的癌细胞中，而且在人类肿瘤、永生化上皮细胞和原代成纤维细胞中都发现了MN的破坏。因此，NE崩溃和随后MN功能的中断似乎是MN形成的一般后果。
MN中断机制
我们的数据揭示了之前未检测到的导致NE不稳定的MN层中的结构缺陷。然而，尚不清楚是什么导致MN层特别形成不连续性。我们在有丝分裂后对MN中LmnB1的成像提供了证据，证明孔洞几乎可以与NE形成同时出现。这一时间与NE形成的缺陷相一致，而不是未能在间期维持或导入层粘连相关蛋白，尽管后者可能导致空穴生长。NE形成是一个高度协调的多步骤过程，薄板装配是最后的步骤之一(Burke和Ellenberg，2002年). 因此，NE组装早期的任何问题都可能会对叶片的紊乱产生下游影响。因此，确定MN中叶片紊乱的机制可以提供有关NE形成是如何调节的重要信息。
明尼苏达州的东北向崩塌与PN的不同之处在于，它通常是不可修复的。目前几乎不知道NE如何在PN中修复自身，但其机制必须导致ER/NE膜在染色质上重新铺展。这种膜有两种可能的来源，一种是现有的NE，另一种是与染色质相互作用的内质网小管或片，随后形成NE，类似于NE形成过程中发生的情况(Anderson和Hetzer，2008b). 我们的数据表明，内质网小管确实与暴露的染色质接触，但无法重组完整的NE。在NE塌陷的同时，我们还观察到染色质显著致密。虽然我们的数据并没有表明哪一个事件最先发生，或者NE塌陷和染色质致密化是否存在机械联系，但有一种可能性是染色质凝聚阻止了NE修复或新NE的形成。除了细胞周期特异性磷酸酶的协同作用外，该模型与有丝分裂退出期间NE形成的观点一致(Ramadan等人，2007年)，需要染色体去凝聚才能将INM蛋白聚集到染色质表面(Hetzer，2010年). 因此，了解中断的MN与间期内质网小管异常连接的原因，可以为NE的形成和间期NE的修复提供重要的见解。
MN破坏与癌症
染色体畸变与癌症患者预后不良密切相关(Rausch等人，2012年)并被认为发生在致癌早期(Forment等人，2012年). 为了使受损的MN在致癌早期发挥重要作用，它们应该发生在健康细胞中。虽然MN在正常细胞中的频率较低，但估计每1000人口腔细胞中出现0.5至2.5 MN(Holland等人，2008年)，我们确实观察到非转化细胞系中发生了MN破坏，这与之前在这些类型细胞中γ-H2AX阳性MN的报道一致(Terradas等人，2009年;Xu等人，2011年;Crasta等人，2012年). 因此，MN中断可能是癌症发展的重要早期事件。
尽管一些癌症的诊断依赖于非整倍体的鉴定，但目前几乎没有实体肿瘤基因组不稳定性的客观标志物。MN已被广泛用于识别外周血细胞或上皮细胞刮片中的基因组不稳定性(Holland等人，2008年)，但很难在肿瘤切片中进行阳性鉴定。我们能够识别实体肿瘤中受损的MN，这为评估这些组织中的非整倍体提供了一种新的方法。即使在低倍镜下，也可以通过荧光显微镜在5μm厚的NSCLC切片中容易识别出断裂的MN，因为它们具有γ-H2AX的特征性积累（参见). 这与完整MN形成对比，完整MN需要对整个z投影进行分析，并且很难与截止PN区分开来。我们对组织培养细胞的分析表明，在异步固定样本中，中断的MN在MN总种群中所占比例较高且规则。研究MN破坏频率与标准且更耗时的实体肿瘤非整倍体检测相比如何，以及它是否代表一种新的诊断结构特征，将是一件非常有趣的事情。
我们的研究结果表明，MN的NE塌陷是由于层压板B1减少和随后的层压板断裂所致。这种崩溃会导致MN持续损伤，从而影响基因组稳定性。目前尚不清楚为什么这一事件是MN特有的，以及为什么在发育核粒形成期间似乎没有发生类似事件。进一步的分析有望为NE在间期修复机制和有丝分裂后NE的形成提供信息。此外，我们的数据表明异常NE动力学与致癌之间的新联系，这可能被证明是癌症诊断的一个有价值的工具。
实验程序
细胞培养和转染
U2OS、DU145、HeLa和MDA-MB-231细胞在DMEM+10%FBS和10%CO中生长2hTERT-RPE-1细胞在DMEM/F12+10%FBS+0.01 mg/mL潮霉素和5%CO中生长2IMR90细胞在含有谷氨酰胺（Gibco）+15%FBS+非必需氨基酸（Gibco7.5%CO）的DMEM中生长2，3%2根据制造商的说明，使用Lipofectamine 2000转染质粒，使用RNAimax转染siRNAs（两种生命技术）。转染后至少2天对细胞进行分析。有关本研究中使用的稳定细胞系、质粒和siRNA的详细信息，请参阅扩展实验程序。
对于有丝分裂振荡实验，细胞在100 ng/mL诺卡唑中培养6小时，然后在新鲜培养基中的盖玻片上振荡同步。在10μm的培养基中加入EdU进行脉冲标记，在5μm的介质中进行长期标记实验。羟基脲在2 mM下使用，RO-3306（酶）在10μm下使用。在5μm处使用阿霉素评估受损MN的DNA损伤，在0.5μm处评估DNA损伤后MN的损伤。以0.1 mg/mL的浓度使用莱普霉素B。对于延时成像，细胞在0.1μg/mL Hoechst中37°C孵育15 m，并在成像前添加新鲜培养基。
免疫荧光和FISH
用于免疫荧光的抗体列在扩展实验程序中。对于间接免疫荧光细胞，将其生长在盖玻片上，并在1×PBS中的4%PFA中固定10分钟。盖玻片在PBS中3%BSA+0.1%TritonX-100中封闭，然后在封闭缓冲液中稀释的一级和二级抗体中孵育。盖玻片与DAPI（1μg/mL，PBS中；罗氏）短暂孵育，并安装在Vectashield（Vector Labs）中。为了进行结构照明显微镜（SIM）分析，细胞生长在蔡司高性能盖玻片上，并安装在ProLong Gold（生命科技）上。
人类非小细胞癌切除标本在标准组织石蜡化前在正常缓冲福尔马林中固定12-72小时(Fischer等人，2008年). 从石蜡化组织块上切下5μm切片，并安装在Fisher Plus显微镜载玻片上。石蜡切片在二甲苯和分级乙醇系列中重新水化。通过在0.01M柠檬酸（pH 6）中煮沸15 M进行抗原提取。在抗体稀释液和DAPI中孵育之前，在3%BSA和4%山羊血清（1×PBS+0.1%TritonX-100）中封闭载玻片。如有必要，在DAPI染色之前，将载玻片在Sypro Ruby（Life Technologies）中于4°C培养过夜。节段安装在ProLong Gold上。
对于荧光灯就地杂交，将盖玻片上生长的细胞在4%PFA中固定10 m RT，并进行处理就地使用先前描述的方案进行杂交(http://www.singerlab.org/protocols网站). 将细胞在0.3纳克/μL Alexa-568-polydT（50）探针（定制；Life Technologies）中在37°C下孵育过夜。然后按照上述方法进行间接免疫荧光。
固定样品在蔡司LSM 710扫描共聚焦显微镜上用63×1.4NA浸油或20×0.8NA气动物镜用Zeiss软件（Zeiss）成像。图像是单个共焦截面，除非另有说明。使用ImageJ调整图像的亮度和对比度(Abrámoff等人，2004年)或Photoshop CS3（Adobe）。所有Z堆叠均以0.5μm的间隔进行。SIM是使用蔡司Elyra PS.1超分辨率显微镜和63×1.4NA油浸物镜进行的。使用Zeiss 2012软件（Zeiss）采集并处理图像。
透射电镜
细胞在MatTek 35 mm培养皿上用14 mm微孔培养，固定在2%戊二醛中的0.1 M碳酸钠缓冲液中，pH值7.3，清洗，然后在1%四氧化锇和2%醋酸铀酰中培养。包埋在Durcupan（电子显微镜科学）中后，在超薄切片机（徕卡）上切割薄片（70 nm），并用2%乙酸铀酰和Sato’s铅染色进行后染色。在JEOL 1200ex TEM上检查切片，并在胶片上捕获图像。
延时成像
细胞被镀入8孔μ-玻片室（iBidi），并在蔡司轴镜/横河旋转圆盘共焦显微镜上成像，该显微镜具有63×1.4NA的油物镜或20×0.8NA的空气物镜，温度为37°C和10%CO2。使用AxioVision软件（蔡司）使用EM CCD相机（哈马松）拍摄图像。使用ImageJ和Photoshop对视频进行裁剪并调整亮度和对比度。
图像和蛋白质印迹的量化
使用荧光成像仪（Odyssey；Li-Cor）和ImageJ定量蛋白质印迹带。在比较之前，将谱带的积分密度减去背景并归一化为GAPDH。Prism5（GraphPad）用于生成所有图形并执行统计分析。荧光强度定量和统计的详细解释在扩展的实验程序中。
