结构照明在宽场荧光显微镜中实现三维分辨率加倍

摘要

引言

光显微术，尤其是荧光显微术在生物科学中应用非常广泛，因为它具有研究细胞和生物体三维内部以及通过荧光标记显示特定生物分子的高度特异性等优点。它的主要缺点是空间分辨率适中，基本上受到光波长的限制。

经典的宽视场光学显微镜还有一个缺点，就是它不能收集到关于样品的足够完整的信息，从而实现真正的三维成像——这就是“缺核”问题(1). 原始数据（作为一系列具有不同焦点的二维图像，称为截面）中缺少圆锥问题的表现是，数据的每个截面不仅包含来自样本相应截面的聚焦信息，还包含来自所有其他截面的离焦模糊。目前，从传统显微镜数据进行三维重建必须依赖先验约束，例如荧光染料密度的非负性，以尝试补偿丢失的信息(1).

共焦显微镜(2,三)原则上缓解了这两个问题：通过使用针孔物理阻挡离焦光，它提供了真正的三维成像，同时在轴向和横向上扩展了分辨率，超出了传统极限(2,三). 然而，横向分辨率的提高只有在使用如此小的针孔时才能实现，即大量的聚焦光与不需要的离焦光一起被丢弃(4). 实际上，使用这样一个小针孔很少有好处：考虑到典型生物样品的荧光较弱，以及共焦显微镜中通常使用的探测器的灵敏度较低，对焦信号的有害损失通常超过任何分辨率的好处。因此，共焦显微镜通常使用更宽的针孔操作，产生的横向分辨率与传统显微镜相当。

已经证明，使用空间结构照明光将高分辨率信息频率放大到显微镜的通带中，可以在不损失任何光线的情况下将荧光显微镜的横向分辨率提高一倍(5–8). 结构照明显微镜（SIM）的方法也比共焦显微镜具有更高的有效横向分辨率(5). 迄今为止，这种强大的分辨率增强仅在薄样品上的二维实验中得到证明(5–8). 一种稍微不同的横向结构照明专门用于提供轴向切片，但对横向分辨率没有太大影响(9,10)，纯轴向强度结构被用于编码高分辨率轴向信息(11). 从理论上概述了SIM增强三维分辨率的方法(8,12,13)，但据我们所知，尚未发布任何实验演示。

在本文中，我们展示了一种改进的结构照明显微镜，它可以提供真正的三维成像，而不会出现遗漏问题，在轴向和横向尺寸上的空间分辨率是传统显微镜的两倍。

理论

用点扩散函数（PSF）描述了线性平移变光学系统的分辨率特性H（H）(对)当目标为点源时，系统形成的真实空间模糊图像。观测数据D类(对)是发光物体的卷积（荧光发射的分布）E类(对)使用PSF：

(1)

根据卷积定理，这种卷积的傅立叶变换是逐点乘积：其中，波浪号（～）表示相应实空间量的傅里叶变换，以及是光学传递函数。复杂值O（运行）(k个)描述了空间频率的强度以及相位偏移k个将物体的坐标转换为测量数据。经典的分辨率极限表明，OTF有一个有限的支持，在这个支持之外，它是零。OTF支持倒数空间的可观察区域，定义了显微镜可以检测的空间频率。传统显微镜的OTF支架是一个环形区域(图1，一和b条); 圆环体的“洞”是靠近k个_z（z）轴。（k个_z（z）倒数空间的方向对应于轴向(z（z）)实际空间中的方向。）从真正意义上说，扩展分辨率相当于找到一种方法，从这个可观察区域之外检测信息。这种表面上自我约束的任务是可能的，因为显微镜工作者感兴趣的结构实际上不是发射E类(对)而是物体结构：荧光染料的密度分布S公司(对). 如果物体受到照明强度的刺激我(对)，得出的排放率分布为

(2)

其中，为了清晰起见，所有比例常数，例如吸收截面和量子产率都被抑制了。(等式2描述正常线性荧光；非线性荧光响应及其用于分辨率目的的讨论将推迟到讨论）。中逐点积的傅里叶变换等式2是一个卷积：.如果是空间变化的，那么非平凡（即不是delta函数），卷积运算变得非局部；尤其是卷积可以使观测数据在取决于来自互惠空间的其他部分。这些信息在原则上是可以观察到的，但必须提取出来。

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图1

通过结构照明扩大互惠空间的可观察区域。(a–e)可观测区域(一和b条)传统显微镜，以及使用双光束的结构照明显微镜(c（c）)，三束照明光束合一(d日)或三个(e（电子）)顺序定向。(（f）)三个振幅波矢量对应于三个照明光束方向。所有三个波矢量都具有相同的幅值1/λ. (克–小时)产生的双光束照明强度的空间频率分量(克)和三梁(小时)案例。面板中的虚线轮廓小时表示通过物镜照明可能产生的空间频率集；与面板中可观察区域的比较一强度分量出现在两个振幅波矢量之间的每一对差异频率处。(我,j个):xz（z）(我)以及x年(j个)通过面板中OTF支架的截面b条（如所示白色)，面板c（c）(浅色阴影)，面板d日(深色阴影)、和面板e（电子）(固体). 较暗的区域完全包含较亮的区域。

提取该信息对于一般照明模式来说并不简单，但如果满足一些条件，则会变得简单。首先，照明模式应该是有限个组件的总和，每个组件可以分为轴向和侧向功能，

(3)

哪里对_xy公司表示横向坐标(x,年). 第二，这些横向功能J型_米应为简单谐波（即仅包含单个空间频率）。第三，应满足以下两个条件之一：轴向功能我_米也是纯谐波的，或者，当三维数据作为具有不同焦点的二维图像序列获得时，照明图案相对于显微镜的焦平面而不是相对于对象保持固定。后一种情况是我们将在本文中讨论的，因为它允许对轴向功能进行更广泛的选择我_米.

最后一个条件的重要性可以通过首先考虑照明模式在采集期间相对于对象保持固定的替代布置来理解。在这种情况下，等式1–三直接应用并导致测量数据的以下卷积积分：

(4)

在上面的积分中，有底数的坐标对'指样品参考框架，无质点坐标对参考数据集参考框架（尤其是轴向坐标z（z）指试样滑块相对于物镜的物理位移），以及差分坐标，对–对′，指物镜的参考框架。可以看出，点扩散函数H（H）取决于不同的坐标对–对′. 如果我们现在考虑在聚焦过程中保持光模式相对于物镜焦平面的固定，这意味着我_米将不依赖于样本帧的素数坐标z（z）'而是关于对象-人-框架的差分坐标z（z）–z（z）′，与点扩散函数的坐标相同H（H）取决于。因此，每个照明组件的轴向部分乘以点扩散函数，而不是对象S公司，在卷积积分中：

(5)

因此，如果我们允许表示米^第个上述总和的项，其傅里叶变换形式如下

(6)

哪里是的傅里叶变换H I公司_米.

以上是假设J型_米是一个简单的谐波，

(7)

这意味着.替换为等式6，这意味着可以将观察到的数据写入

(8)

对象信息的有限数量副本的总和每一个都在倒数空间中横向移动一段距离第页_米，通过传递函数过滤（和带线）O（运行）_米，并且相移了一个相位ϕ_米总之，每个横向频率分量米照明结构对应于单独的光学传递函数O（运行）_米，由传统检测OTF与轴向照明结构的卷积得出米^第个模式分量，并应用于由横向波矢量在倒易空间中转换的对象信息分量第页_米模式组件的。

如中所示等式8，单个原始数据图像是几个不同信息组件的总和，每个索引对应一个信息组件米。要还原数据，必须分离这些信息组件。这可以通过获取具有不同已知相位值的附加数据集来实现ϕ_米.通过相移改变相位值δϕ_米改变系数在里面等式8从到导致未知信息分量的线性独立组合。因此，每个相移图像在N个未知（其中N个是中频率分量的数量等式8). 如果数据是通过至少N个在不同的阶段，方程的数量至少等于未知数，从而允许N个通过应用简单的N个×N个矩阵。（当然，一组选择不当的相位{ϕ_米}可能导致一个病态甚至奇异的矩阵，但在0–2上自然选择等距相位π区间产生一个条件良好的分离矩阵，该矩阵实际上对相移变量的数据进行离散傅里叶变换。）

在实践中，通常会通过几种方式进一步简化这种情况。物理光强度是一个实际值函数；中的指数等式7因此必须与相反的成对出现第页_米对应于来自互惠空间中对称定位区域的信息。因为傅里叶变换任何实值函数的一(对)（例如对象结构）具有对称性是的复共轭，只需计算每对中的一个信息分量；其他分量中的值遵循对称性。其次，如果设置不同的横向空间频率第页_米照明模式的频率实际上是周期模式的基频和谐波，那么所有空间频率都是基频的倍数：第页_米=米第页此外，如果照明的相移是通过空间平移刚性图案而发生的，则相移δϕ_米也是基本相移的倍数：δξ_米=mδϕ对于具有反射对称性的图案，同样适用于起始相位，ϕ_百万=米ϕ₀因此，对于整个阶段：ϕ_米=米ϕ在这种情况下，我们可以重写等式8作为

(9)

从中可以看到等式9测量数据通过两种方式获得新的（即通常不可观测的）信息：支持每个传递函数O（运行）_米与传统的OTF相比，是轴向延伸的O（运行），通过与轴向函数的卷积; 和翻译米第页将新信息横向移动到O（运行）_米.

因为O（运行）_米和第页_米已知，分离的信息组件可以通过计算向后移动（移动一段距离第页_米)到它们在互易空间中的真实位置，重新组合成单个扩展分辨率数据集，并重新转换到真实空间。该程序将在方法中进行更详细的讨论。

该方法的总有效观测区域由传统OTF卷积的支持给出O（运行）具有总照明结构因此，给定维度中的最大分辨率增加值等于该维度中的最高照明空间频率。由于照明中可以产生的空间频率集与可以观察到的频率集完全一样，受到衍射的限制（如果照明和观察是通过相同的光学系统进行的），照明中的最大可能空间频率等于检测的传统分辨率极限（除了按发射波长和激发波长的比值缩放外）。因此，以这种方式可能的最大分辨率扩展是一个因素每个维度都略多于两个。轴向和横向都是如此。下一节介绍了一种特定的照明模式选择，它允许在适当的曝光次数中获取此加倍分辨率限制内的大多数信息。

三光束照明

在前面描述的二维结构照明显微镜中(5)，样品被两束光照射，干涉形成正弦光强模式1+cos(第页·x)，它只有三个傅里叶分量(图1克)（即仅三个术语，米={-1，0，+1}，英寸等式3–9). 如果在三维显微镜中应用相同的照明模式，则产生的可观察区域将由传统三维OTF的三个移位副本组成(图1c（c）). 该区域的横向分辨率是正常的两倍，但与传统的OTF一样，也存在相同的锥体缺失问题，使得三维重建变得困难。解决此问题的一种方法是使用较粗的照明图案，即较短的图案波矢量第页这将导致三个OTF组件相互靠近，并重叠彼此缺失的锥体(9,10). 然而，这种做法牺牲了横向解决。通过使用改进的照明结构，可以避免在填充缺失信息和保持分辨率之间的折衷。在本文使用的三维结构照明显微镜中，用三束相互相干的激发光照射荧光样品(图1（f）). 一般来说，平面波与波矢的相干叠加k个_j个产生总光强度

(10)

它由每个两两差分向量的一个空间分量组成k个_q个–k个_j个在任意两个平面波传播矢量之间。因此，三束照明光束之间的干涉产生了一个包含七个傅里叶分量的三维激发强度图案，三个照明波矢量之间的每个差矢量上都有一个(图1小时). 通过这种照明模式变得可访问的可观察区域是七点照明结构的卷积图1小时使用传统的OTF支持图1，一和b条，导致区域如所示图1d日该区域填充了缺失的锥体，同时保持了两个横向分辨率扩展的全因子，同时使轴向分辨率加倍。它只在一个方向上扩展横向分辨率，但当然可以在照明图案旋转到其他方向的情况下重复该过程。图1e（电子）显示了使用三个图案方向的可观察区域。而单个图案方向的可观察区域在边带的缺失锥体处有“凹坑”(图1d日)，一旦使用多个图案方向，这些酒窝将被有效填充(图1e（电子）).

只有五个横向空间频率(k个_x值）发生在图1小时其中两个由成对的强度分量共享。因此只有五个传递函数O（运行）_米(k个)，使用米={−2，−1,0,1,2}，有助于图1d日.每个O（运行）_米由传统OTF与轴向函数的卷积形成对应于通过图1小时在相应的k个_x位置。其中三个配置文件，和每个函数都由一个delta函数组成k个_z（z）=0，但剩下的两个配置文件和每个包含两个delta函数（位于哪里β是每个侧光束方向与光轴之间的角度）。因此，三个传递函数中的每一个O（运行）₋₂,O（运行）₀、和O（运行）₂与传统的OTF相同图1一; 这三个波段也出现在图1c（c）.剩余的传递函数O（运行）₋₁和O（运行）₁另一方面，每一个都由传统OTF的两个副本组成，偏移距离为±k个_z1型高于和低于k个_z（z）=0平面(图1d日).

在上述讨论中图1，假设照明是完全相干的。实际上，在照明灯光中引入轻微的空间不相干是很有吸引力的。这样做的一个原因是，有助于抑制由尘埃粒子散射等引起的杂散干涉条纹，否则可能会产生伪影；另一个原因是将干涉效应限制在焦平面周围的有限轴向范围内。在本文中的实验中，三束照明光束是使用衍射光栅从空间上稍微不相干的光束中产生的。不相干导致了中传递函数的轻微修改图1.照明光来自圆形光源（实际上是多模光纤的端面，见方法）；该光源的三个等距图像，对应于光栅的–1、0和+1衍射级，被投影到物镜的后焦平面（瞳孔）上(图2一). 源在空间上是不相干的：源的每个点都与源的所有其他点有效地相互不相干。因此，瞳孔中三个源图像中任一源图像中的每个点仅与其他两个源图像的对应点相互相干，没有其他点。换句话说，照明由相干点三元组的非相干叠加组成；一个这样的点三元组在图2一。因此，可以通过分别考虑每个这样的点三元组，计算其产生的强度干涉图案，并将该强度图案积分到所有这样的点三元组（即光源的所有点），来计算样品中的总光强度图案。每个点三元组对应于一个梁三元组，如图1（f），并将产生具有七个分量的强度干涉图案，对应于三个光束波矢量之间的所有成对差矢量，如图1小时.由单独震源点产生的相应差分矢量将在轴向上不同(图2b条,箭头)，但只要物镜满足正弦条件，就具有相同的横向分量(14)这要求光线在瞳孔平面内的径向位置与光线振幅空间频率的横向分量成比例。因此，不相干的影响是在图1，克和小时，轴向而非横向有限延伸(图2c（c）). 因此，照明结构保持了等式3和7（即，它是有限数量（五）个组件的总和，每个组件都有一个横向空间频率），因此前面段落中概述的理论仍然适用。非相干仅仅导致传递函数的轻微轴向展宽O（运行）_米侧带的(图2，d日–小时)与相干情况相比(图1，c（c）–e（电子）).

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图2

光学传递函数O（运行）_米以及不相干的影响。(一)三个照明光束的位置(紫色圆点)在物镜的后焦平面上。每个光束内的每个点仅与其他光束中的每个光束的对应点（源自光源的同一点）相互相干；黄色的点表示一个这样的相干点三元组。(b条)光振幅的空间频率分量。对于满足正弦条件的物镜，瞳孔平面直接映射到横向空间频率(虚线从一到b条). 相互相干的振幅分量之间的差矢量(琥珀色箭头在里面b条)因此，对于不同的震源点，其横向范围相同，但轴向范围不同。(c（c）)光照强度的空间频率分量；这个米=0、±1和±2分量分别以红色、绿色和蓝色显示。非零-米分量，从每个相干点对中获得贡献(琥珀色箭头，对应于中的b条)，轴向加宽为线段，但横向仍保持三角形功能。原始数据(d日和克)是五个信息带的总和，对应于五个横向照明强度频率。一旦观察到五幅具有不同图案相位的图像，就可以分离出条纹(e（电子）和小时; 只有米= 0 (红色), 1 (绿色)、和2(蓝色)显示了条带），并通过计算移回其正确的横向位置(（f）). 通过与照明强度（相应颜色）的相应频率分量卷积，每个频带都被展宽；例如，order 1组件由两部分组成(e（电子）,绿色). 观察到的原始数据(克)和分隔带(小时)对于点源对象来说，与理论预期非常吻合。

方法

仪器

这种方法已经在几个具有类似照明系统的原型显微镜上实现(图3一). 波长为488 nm或532 nm的激光被旋转全息扩散器（加利福尼亚州托伦斯的物理光学）在空间上扰乱，以消除空间相干，并耦合到多模光纤（纤芯尺寸100μm、 NA 0.12），选择扰码度以大致填充光纤的模式空间。光纤的输入是模式的快速时变叠加，在输出处产生快速时变散斑图案；在典型的曝光时间内，散斑图案平均为近似恒定的强度，在光纤输出处产生模拟的空间非相干（和非偏振）光源。为了增加置乱的完整性（对独立散斑图案的空间进行平均），在曝光期间对一段光纤进行机械振动。光纤发出的光被准直并指向熔融石英线性透射相位光栅，该光栅将光束衍射成大量级。中间瞳孔平面中的光束块丢弃了除0级和±1级以外的所有衍射级；这三个命令加在一起接收到光栅上约70%的功率。光栅设计为0级强度为±1级强度的70–80%；选择这种不相等的强度比是为了略微增强最高频率的信息成分(米=±2，蓝色在里面图2). 三束光束重新聚焦，以便每束光束在物镜的后焦平面上形成光纤端面的图像。衍射级为+1和-1的光束聚焦在后焦平面孔径的相对边缘附近，0级聚焦在其中心(图2一). 每个纤维图像的直径通常在瞳孔直径的5%到10%之间。物镜（100×PlanApo 1.4 NA）重新准直光束，使其在物镜的焦平面上相互交叉，在焦平面上干涉形成具有轴向和横向结构的照明强度图案(图3b条). 物镜焦平面中的照明强度图案可以等效地被认为是光栅的缩小图像。样品发出的荧光由同一物镜收集，并由二向色镜偏转至冷却的电荷耦合器件相机；散射激发光被相机前面的发射滤波器（分别用于532和488 nm激发的580–630和500–530 nm带通）抑制。通过电容式位置传感器闭环控制下的压电转换器，将样品架相对于物镜轴向平移，获得三维数据集。通过旋转和横向平移光栅来控制照明图案的方向和相位。为此，光栅安装在压电转换器上，而压电转换器又安装在电动旋转台上。压电转换器使用定制的电容式距离传感器进行闭环控制，该传感器由光栅支架一侧的一个凸电极和围绕光栅支架的一个空心圆柱形对电极组成，每个对电极两侧都有一个保护电极。对电极牢固地连接在光学工作台上，并用作固定参考，因此可以以纳米精度和再现性控制光栅在其图案波矢量方向上的位置，而不会对旋转台轴承的精度或稳定性提出任何异常要求。样品空间中相应的图案控制精度甚至比这更高，从样品平面到光栅平面的放大倍数为（通常为～100）。

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图3

(一)结构照明设备的简化图。来自多模光纤的扰频激光被准直到线性相位光栅上。衍射级数–1、0和+1重新聚焦到物镜的后焦平面。光束经物镜重新准直后，在样品的焦平面上相交，在焦平面上干涉并产生具有横向和轴向结构的强度图案(b条). 图案的有限轴向范围与其空间频率的轴向展宽有关(图2c（c）). 通过电荷耦合装置观察样品的发射光(电荷耦合器件)通过二向色镜的照相机(DM公司).

为了干扰最大对比度，样品中的照明光束必须秒-相对偏振，这对应于光栅衍射的光束垂直于衍射平面线偏振。这种偏振状态通过与光栅共同旋转的线栅线性偏振器（Moxtek、Orem、UT）在所有方向上保持。对于与二向色反射镜不平行或不垂直的图案方向，标准二向色镜的大延迟通常会显著改变光束的偏振状态；我们通常使用在传输中操作的定制多波段二向色涂层（Chroma Technology，Rockingham，VT），其在激光波长下的延迟足够小，对图案对比度的影响可以忽略不计。涂层沉积在3.2 mm厚的光学平面基板上，以保持反射成像光束的波前质量。安装后用干涉仪检查这些镜子的平面度。

为了获得理想的成像效果，光栅面应位于成像平面上，即与相机完全共轭。为了优化该参数，将照明模式的傅里叶分量绘制为以下函数z（z）通过测量在每个焦距设置下，单个荧光珠随着图案相移而整体发射的变化。在这些测量的指导下，对光栅级的轴向位置进行了调整，以形成最大模式调制平面（参见图3b条)与焦平面一致（定义为具有珠子图像峰值强度的平面）。这个参数只需要对齐一次（对于特定的物镜和波长），尽管如果在折射率不匹配的样品中进行深度成像，它可能会受到球差的影响。

当照明侧光束穿过目标瞳孔边缘附近时，可获得最佳分辨率。因此，为了优化不同的目标（具有不同的瞳孔直径）和波长（光栅处具有不同的衍射角），需要改变光栅或光栅平面和样品平面之间的放大倍数。我们通过在可互换的运动基板上安装中间透镜（或透镜和镜子的组合），实现了后一种方法，以便在特定波长和目标的预对准配置之间快速切换。预对准包括前一段中描述的聚焦步骤。针对一个波长优化的配置通常也允许在较短的波长下操作（尽管与针对较短波长优化的系统相比，分辨率略低）。另一种解决方案是使用变焦光学元件。

重建

一旦确定了参数，不同的信息组件通过广义维纳滤波器进行组合，

(11)

哪里是对真实样本信息的估计总和取三个图案方向d日和五个组件订单米在每个方向，第页_d日是图案方向的图案波矢量（即方向和反周期）d日,w个²是维纳参数（取为常数并经经验调整），以及A类(k个)是一个切趾函数（通常是一个三维三角形函数，它在近似扩展OTF支持的扁球体表面从原点的单位线性减少到零）。

等式11以以下方式实现（有些非直观）：每个未移位的信息组件分别乘以一个过滤函数然后用零填充过滤后的结果（为向量移位信息提供空间第页_d日，或等效地减小真实空间像素大小以适应增加的分辨率），变换到真实空间，乘以复数相位梯度（表示频率空间偏移米第页_d日)，并加在一起，以产生最终的重建。在该计算中，传递函数值由旋转平均测量值计算得出O（运行）_米通过插值。像素大小的缩小通常是通过两倍的系数横向完成的；较大的因素，以及轴向和横向复位，可以用来产生更平滑的重建。

这种运算顺序比直接的一次乘法产生的结果要好得多通过通过以下方式转移产品米第页_d日，根据公式11，并重新传输到实际空间。原因与边缘瑕疵有关。因为移位向量米第页_d日通常不落在离散频率空间的积分像素上，位移被实现为相应相位梯度的乘法在真实空间中。乘以（f）(对)通过离散傅里叶变换，在频率空间中对应于卷积（f）(k个)，它是一个离散的delta函数δ(k个−米第页_d日)如果米第页_d日落在一个频率空间像素上，而不是一个普通的sinc函数。该函数的卷积有效地“抹黑”了k个_x,k个_年、和k个_z（z）方向。这种涂抹本身并不一定是一个问题，但如果涂抹的信息在后续处理过程中被放大，则会变得有害。在上述简单方法中，产品除以维纳滤波器分母在它被向量移动之后米第页_d日三维传递函数O（运行）_{m′（米）}在原点处出现强烈的峰值（实际上在连续极限中是奇异的O（运行）₀)除以维纳分母可以提高远离原点和模式频率的空间频率米第页_d日相对于接近这些点的空间频率。提高这些频率会大大放大通过移位操作涂抹到这些区域的任何信息，而这种放大的涂抹会导致重建中出现伪影。另一方面，在这里使用的处理顺序中，在执行移位之前，样本信息除以维纳分母，这样就不会放大模糊信息。

只有非负的信息成分米显式计算；负片-米与正极相关的组件-米通过复杂共轭对称的对应项，只需在实际空间中丢弃最终重建的虚部即可提供。

数据集的重建（包括数据传输和参数拟合）包括72个400×400像素的轴向截面（每个截面在五个相位和三个图案方向上），生成800×800×72体素重建，需要138秒才能在带有两个双核2.2 GHz Opteron处理器的计算机上完成。在一个特性良好且可重复的系统上，通过消除许多参数拟合，可以显著缩短处理时间。

结果

测量的三维OTF数据集示例如所示图2，克和小时.面板克显示k个_x-k个_z（z）在具有照明图案的固定、任意相位的点源样本上获取的原始三维数据的旋转平均三维傅立叶变换的视图。数据表示所有不同信息组件的贡献总和，如下所述等式8并在中进行了图解说明图2d日照明模式五个不同阶段的类似数据允许分离五个信息成分(图2小时). 如果相移、聚焦步骤和照明强度具有足够的再现性，则分离可以接近完美，而其他信息组件对每个信息组件的污染可以忽略不计。通过比较可以看出图2，e（电子）和小时每个信息分量的定性形状与理论预测完全一致，包括空间不相干导致的展宽。

为了证明分辨率性能，使用三维结构照明方法对标称直径为121nm的红色荧光微球平面簇进行了成像，并与三维常规宽场数据进行了比较(图4). 如轴向所示(xz（z）)视图(图4d日)结构照明方法确实能够抑制焦平面上方和下方的离焦模糊，这是传统显微镜数据中的主要元素(图4c（c）). 同时，焦点x年视图(图4，一和b条)说明了横向分辨率的显著提高。（在比较这些面板时，应记住，传统数据没有从SIM处理中固有的线性滤波中受益。线性滤波由于缺核问题不适合三维常规显微镜数据。二维SIM与原始和线性滤波的比较传统数据已在别处发布(22)）两个微球在125 nm的间隔处成对分解，与传统显微镜的绝对分辨率极限进行比较，在该红色观察波长下为～207 nm(λ_{相对长度单位}=605±25纳米）。

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图4

标称直径为0.12的红色荧光微球簇μm、 用成像(一和c（c）)传统显微镜，以及(b条和d日)结构照明显微镜。(一和b条)单焦点x,年说明横向分辨率提高的章节。(c（c）和d日)单个x,z（z）部分，位于年面板中水平线指示的位置一，说明如何去除焦平面上方和下方的离焦模糊。(e（电子）)三维SIM观察到的单个绿色荧光珠在半最大值（FWHM）时的表观横向和轴向全宽直方图。

为了量化分辨率，在使用λ_{相对长度单位}=520±17.5 nm和λ_交易所=488 nm，使用100×1.4 NA PlanApo物镜，侧光以瞳孔半径的92%为中心。为了进行准确测量，与正常操作相比，该数据集的横向和轴向像素尺寸在处理过程中减少了两倍。对100个微球进行测量，在图4e（电子），横向和轴向的平均半高宽分别为103.9 nm和279.5 nm，标准偏差分别为1.5 nm和2.9 nm。为了进行比较，具有这些参数的三维SIM的理论频率空间分辨率极限为～（92 nm）⁻¹和（265nm）⁻¹在横向和轴向上，115-nm实心球体的真实半高宽分别为nm=99.6 nm。

图5和补充材料，数据S1,电影S1显示了具有复杂三维结构的生物样品的结构化照明重建，即HL60细胞中的肌动蛋白细胞骨架，该细胞已被诱导分化为中性粒细胞样状态。将细胞暴露于低浓度的细菌肽甲酰-甲亚砜基-亮氨酸-苯丙氨酸中，该肽是中性粒细胞的趋化靶点；这刺激细胞皱缩成复杂的三维形状。中的图像图5是通过整个细胞体积的最大强度投影。如图所示，该方法产生了真正的三维重建，基本上没有离焦模糊。

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图5

通过三维结构照明重建HL-60细胞肌动蛋白细胞骨架的最大强度投影，如顶视图所示(一)和侧视图(b条). 该重建的视频可在期刊网站上找到(电影S1).

作为生物分辨率测试，我们对HeLa细胞中的微管细胞骨架进行了成像(图6,电影S2). 单个微管可以在整个细胞体积中跟随。两个平行的微管在125 nm的距离处分离良好(图6b条,插入)而在由相同数据生成的传统显微镜图像中完全无法解析(图6一,插入). 为了估计生物样品的分辨率，随机选择了20根微管，测量了它们的轴向和横向半宽度；平均FWHM横向为120nm，轴向为309nm。

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图6

HeLa细胞中的微管细胞骨架。使用传统显微镜进行轴向最大强度投影(一)和结构照明显微镜(b条)，通过244-mm厚的数据子集（两部分）。(插图)两个间距为125nm的平行微管(箭头)在结构光照重建中分辨率很高，但在常规显微镜中分辨率很低。中插图的图像对比度一已进行调整，以便比较。(c（c）)通过结构化照明重建投影的交叉立体视图。每个体素的数据值控制渲染中该体素的亮度和不透明度。该重建的视频可在期刊网站上获得(电影S2).

图7显示了一个传统方法无法解决的具有生物学意义的结构的例子：联会复合体（SC），它在减数分裂I期间介导同源染色体的配对和重组(23). 玉米减数分裂细胞分别用红色和绿色免疫荧光标记AFD1和ASY1蛋白。这两种蛋白质都与SC的轴向/侧向元件相关，SC在配对前沿每条染色体（姐妹染色单体组）形成一个轴，配对和突触完成后，在中央元件的两侧排列成两条平行的链（侧向元件）(图7b条). 在玉米中，横向元素之间的中心到中心距离通过电子显微镜测量为~140 nm(24). 根据我们的制备方案，ASY1抗体的表位在突触后无法用于抗体结合，因此SC突触部分的侧面元件仅标记为红色，而SC的非突触部分标记为红色和绿色。分别以红色和绿色采集、重建和合并三维结构化照明数据集(图7一). 所示细胞核处于减数分裂的合子晚期，此时突触几乎完成。在突触区域，这两个侧面元素可以清楚地分离，并通过细胞核追踪(图7一,c（c）、和e（电子）)，这在传统显微镜下是不可能的(图7d日和(19)). 在我们的重建中，横向元件之间的明显中心距为~170–180 nm，与基于电子显微照片的公布值合理一致。（鉴于我们较为温和的制备方案和侧元件内特定蛋白质组分的标记，不一定会达成完美一致。）非静止区域的轴向元件提供了一种内部控制：它们清楚地重建为单链，也在红色通道中，确定地确立了突触区域中的双重外观代表了真正的结构(图7，一和c（c）). 演示此重建的三维特性的视频(电影S3)以及AFD1和ASY1通道的单独渲染(图S1)，可在期刊网站上找到。

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图7

玉米减数分裂后期合子期减数分裂细胞核中的联会复合体（SC）。固定的减数分裂细胞被免疫荧光标记为轴向/侧向成分AFD1（红色荧光，此处显示为洋红)和ASY1(绿色)联会复合体的。在使用的固定条件下，当突触完成时，抗体无法获得ASY1表位；因此，突触区只发出红色荧光，而非突触区发出绿色和红色荧光。在完全突触的染色体中，侧链排列成两条平行的链，相隔约170nm。(一)通过三维结构照明重建整个细胞核的最大强度投影（数据集厚度，8μm） ●●●●。该图像的AFD1和ASY1频道的单独效果图可在期刊网站上获得(图S1). (b条)玉米粗线期母细胞的银染染色体铺展制剂的透射电子显微照片，显示了由成对染色体包围的SC的三个元素。(乐，横向元件；总工程师，中心元素；中国，染色质。）(c（c）)蓝盒区放大，最大强度投影到1.5μ样品厚度的m，显示了从未成对SC到成对SC的过渡(箭头). (d日和e（电子）)用常规显微镜成像的样本白盒区域的放大倍数(d日)或结构照明显微镜(e（电子）). 面板d日和e（电子）仅显示三个轴向截面的最大强度投影，代表样品厚度375nm，以避免常规图像中不必要的模糊。突触区的侧成分，常规显微镜无法解析(d日)结构照明显微镜能够很好地分辨(一,c（c）、和e（电子）)可以清楚地看到两股线相互缠绕(e（电子），与相比b条). 该重建的视频可在期刊网站上找到(电影S3).

讨论

这里实现的结构照明显微镜使用的照明模式仅在两个横向方向中的一个方向上构造；为了提供三维分辨率扩展，在一系列单独的方向上依次应用图案。一种替代方法是使用在两个横向维度上都包含结构的照明图案，例如通过使用二维衍射光栅，从而消除了对图案旋转的需要。然而，需要分离的信息组件的数量也会相应增加，因此分离所需的原始数据图像的数量也将相应增加：二维照明模式通常通过x和年阶段。这两种方法所需的图像总数相当。我们选择了顺序方法，因为它允许选择极化以获得最大的图案对比度，因为对于单个方向来说，有一个明确的定义秒-极化方向。二维图案对应于照明光束的非平面排列，而不是所有的都是秒-相互极化，因此无法产生最大的干涉对比度。一维和二维照明模式的优缺点的详细比较将分别出版。

三维结构光显微术的应用领域与共焦显微术重叠，但这两种技术具有不同的互补优势。结构照明显微镜提供了更高的有效横向分辨率，因为它将大部分激发光集中在非常高的照明角度，这对于将高分辨率信息编码到观测数据中是最有效的，而共焦显微镜将其照明光均匀地分布在所有可用的角度上，形成聚焦光束。然而，对于非常厚且紧凑的荧光样品，共焦显微镜有一个优点，即它的针孔从物理上消除了离焦光。结构照明显微镜在计算上非常有效地去除离焦光，因为它不受缺焦问题的影响，但计算去除会留下相关的散粒噪声。因此，共焦显微镜可能更适合于非常厚和致密的样品，因为传统显微镜图像中的对焦信息会被离焦光淹没，而结构照明显微镜在较薄或较稀疏样品的情况下可能更优越。交叉点的厚度取决于每个试样的特性。中的数据图5和​和66证明10–15-μm厚度范围，包括大多数单细胞标本，很好地处于结构照明显微镜的优势范围内。

这里描述的重建算法是完全线性的（一旦参数确定），并且不使用样本的先验知识。线性意味着有一个有效的PSF用于最终重建；因此，给定特征的渲染方式与周围环境无关（请参见图4d日，其中重建中的所有珠子都具有相同的形状，无论它们位于集群中还是孤立的）。迭代反褶积算法(1)它应用了先验约束，例如荧光团密度的非负性，是三维显微镜中常用的工具，在良好的条件下可以提供超出常规限制的有效分辨率(25). 这些方法也可以应用于SIM数据，并有望提供类似的好处，但代价是使给定结构的重建依赖于其周围环境。在本文中，我们避免了所有约束条件的使用，以消除SIM对新的高分辨率信息进行实际测量与基于约束反褶积对测量信息进行外推之间的任何混淆。

如上所述，可以认为结构照明是由两个或多个相互相干的光束的干涉产生的。产生这种光束的主要方法有两种：通过掩模、光栅或其他图案化器件的衍射光束分裂(5,6,8–10)，或通过反射光束分裂(7,26,28). 每种方法都有优点和缺点。反射光束分裂对于多色应用具有优势，因为照明光束在瞳孔平面中的位置可以独立于其波长，而衍射光束分裂时，光束到瞳孔中心的距离通常与其波长成正比，因此一次只能对一个波长进行严格优化。（通过优化最长波长，仍然可以获取多波长数据集，而在较短波长信道上只会有较小的性能损失（请参阅图7).) 另一方面，反射光束分裂有一个严重的缺点，因为它通常会导致光束在空间上分离，并由单独的光学元件（镜子等）处理；任何此类组件的任何纳米级漂移都会直接转化为数据中的相位误差。相比之下，在衍射光束分裂的情况下，所有光束通常以基本上相同的通径几何形状穿过相同的光学元件，从而将元件漂移的灵敏度降低了几个数量级。此外，反射光束分裂通常需要为每个图案方向设置单独的反射镜组，随着图案方向数量的增加，反射镜组变得越来越庞大；因此，到目前为止，该方法只针对一个(26,28)或两个(7)模式方向不足以实现各向同性分辨率，并且可以在分辨率和各向异性之间进行权衡(7).

由于活体显微镜是当前最令人兴奋的领域，因此考虑三维SIM在活体样品中的应用程度非常重要。假设使用水浸物镜来避免不必要的像差，则该原理与活体样品完全兼容。除了通常由光漂白和光毒性设定的总暴露限制外，唯一的附加限制与运动有关。当前算法将样本视为不变的三维结构，因此，如果在数据采集期间样本内发生实质性运动，则可能会产生伪影。如本文所实现的，三维SIM在每个轴向截面上使用15个原始图像，并将轴向截面间隔通常为125 nm，以提供相对于其轴向分辨率<300 nm的奈奎斯特采样。这相当于120次曝光μ数据体厚度m；因此，厚三维样本的数据集可能需要>1000个原始图像。即使有了高速摄像头和快速模式生成硬件，这些数据集也可能需要几秒钟或几分钟的时间来获取，在这段时间内，许多生物系统将经历比SIM分辨率大很多倍的内部运动。通过使用采集顺序，可以稍微降低对运动的敏感性，在重新聚焦之前，采集特定焦平面的所有图像（对于所有模式方向以及相位）；在该模式下，必须避免运动的时间框架可以从完整数据集的时间框架减少到记录与模式调制的轴向范围相对应的样品厚度所需的时间（参见图3b条). 对于较薄的样品，运动和光漂白/光毒性这两个限制的严格程度相应降低。在一类薄样品上，SIM分辨率的实时成像应该是非常可行的。在薄极限下，一些结构可以被视为二维结构，包括以全内反射模式观察的任何样品，以及一些结构，如lamellipodia，其自然厚度比常规景深薄。SIM与全内反射模式完全兼容，正如最近在一维中所证明的那样(26). 通过适当的硬件，应该可以通过二维SIM以Hz范围内的帧速率获取此类样本的时序数据。

所述算法假设三维数据包括整个发射对象。如果数据包含来自成像体边缘以外的强光，则可能会出现伪影。我们使用方法中概述的处理顺序和其他预防措施重建了此类数据集，没有出现重大问题，但只要有可能，我们都会在数据集中包含整个感兴趣的对象，最好是上面和下面的几个非焦点部分，以避免此问题。

本文中描述的方法假设照明强度和荧光发射速率之间存在正常的线性关系，并实现了大约两倍的分辨率扩展。众所周知，如果样品能够对照明光作出非线性响应，则二维宽场分辨率可以进一步扩展(22,27,28). 这一概念，即非线性结构照明显微镜，原则上可以应用于此处描述的三维方法，其方式与在二维中使用的方式大致相同，并且可以提高轴向和横向分辨率。主要的限制是，荧光团的光稳定性要求（在两个维度上已经很重要）将随节数的增加而增加。当从二维成像到三维成像时，将可用的光容差划分到各部分上，同样的担忧也可能影响其他在二维中显示出极高分辨率的最新方法，例如PALM/FPALM/STORM(29–31). STED等高度非线性点扫描方法(32)可能不太受这种影响，特别是如果使用多光子激发，光降解可以限制在焦平面附近的小轴向范围内。

传统显微镜的轴向分辨率比横向分辨率差大约三倍（对于高NA物镜）。同样的各向异性也适用于此处所述的三维SIM，它在所有维度上以相同的因子扩展了分辨率。然而，结构化照明概念与I的对立物镜几何结构兼容⁵M、 这样可以获得更高的轴向分辨率(33). 三维SIM卡和I卡的简单组合⁵M、 打电话给我⁵S、 可以在100nm范围内产生几乎各向同性的三维成像分辨率(34).

综上所述，三维结构光显微术可以对荧光标记样品进行多色三维成像重建，横向分辨率接近100 nm，这是传统三维光学显微术无法实现的。同时，它可以提供<300 nm的轴向分辨率，并确定地消除离焦模糊。我们相信它在细胞生物学中发挥着重要作用。

补充材料

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补充材料

致谢

笔记

编辑：恩里科·格拉顿。

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