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.2007年1月30日;104(5):1488-93.
doi:10.1073/pnas.0609836104。 Epub 2007年1月22日。

小鼠肝脏的大规模磷酸化分析

附属公司

小鼠肝脏的大规模磷酸化分析

朱迪特·维伦等。 美国国家科学院程序. .

摘要

蛋白质磷酸化是一个复杂的信号和调节事件网络,几乎影响每个细胞过程。我们对该网络整体性质的理解仍然有限,主要是因为在磷酸化物种的分离和高通量测序方面存在一系列技术挑战。在本研究中,我们证明串联磷酸肽富集方法、高效质谱和优化的数据库搜索/数据过滤策略的组合是测量磷酸蛋白质组的有力工具。利用我们的集成分析平台,我们报告了从小鼠肝脏2328个蛋白质中鉴定出5635个非冗余磷酸化位点。从这个位点列表中,我们提取了特定Ser/Thr激酶的新的和已知的基序,包括“偶极”基序。我们还发现C末端磷酸化比任何其他位置都更频繁,这些位点的潜在激酶分布是独特的。最后,我们确定了可能参与有序磷酸化的双磷酸化基序。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
用于大规模鉴定和表征小鼠肝脏磷酸化位点的策略。(A类)样品制备。组织匀浆和溶解后进行胰蛋白酶消化。对色氨酸肽(10 mg)进行两步磷酸肽富集。SCX色谱对早期洗脱组分进行了大量富集。随后每一组分的IMAC都提供了额外的选择性捕获。此外,通过免疫亲和纯化将80 mg胰蛋白酶肽富集为pTyr肽。(B类)SCX/IMAC实验的数据处理。使用Sequest对包含正向(目标)和反向(诱饵)序列的小鼠蛋白质数据库(DB)搜索15个分析的MS/MS光谱,以进行FP计算。重要的是,目标/诱饵数据库搜索策略还提供了一种建立适当正交过滤标准的方法(质量偏差、酶特异性、pH 2.65下的溶液电荷状态和Sequest评分)。在8529个磷酸肽的最终过滤列表中,只发现了两个逆序肽(0.02%FP率)。总共确定了5250个非冗余位点。Ascore算法(26)用于确定每个站点正确定位的概率。最后,用Motif-X算法从数据集中提取磷酸化基序(34)。
图2。
图2。
磷酸肽在15个SCX组分中的分布及其性质。(A类)磷酸肽分布。所示为每一组分识别的磷酸肽数据。(B类)每个肽的磷酸化位点。所示为含有一个、两个或三个磷酸化位点的每个组分中磷酸肽的百分比。(C类)净溶液电荷状态(pH 2.65)。所示为计算出的溶液电荷状态介于−1和+6之间的每个组分中磷酸肽的百分比。SCX色谱主要根据净溶液电荷状态进行分离,每个磷酸基团从肽中减去一个净电荷。
图3。
图3。
磷酸化位点的位置分布。(A类)本研究中蛋白质序列位置的位点检测频率。蛋白质序列被分成1%的箱子并按频率绘制。虚线显示中值。观察到C末端(蛋白质长度的98-100%)磷酸化的强烈趋势。(B类)磷化氢的位点分布也有同样的趋势。ELM数据库,一个包含文献网站的精选资源。(C类)根据磷酸化位点在蛋白质中的位置将其分为三类最常见的基序。所有定位位点都被分为三个普通激酶基序之一或“其他”(参见方法),并测定了它们在蛋白质末端的分布。N端,在前10 aa内;C端子,在最后10 aa内;在所有剩余残渣中。C末端位点的分布与N末端或中心位点的分布不同。
图4。
图4。
本地化站点的分类(P(P)<0.01)分为最常见的激酶识别序列类别:酸性、碱性、前向和“其他”(A类)比较本研究中检测到的位点的序列类别分布与来自同一组蛋白质的所有Ser和Thr残基的对照组。(B类)对于属于不同GO注释细胞定位类别的蛋白质,观察到不同的磷酸化模式。(C类)三种功能性GO类别的一般磷酸化激酶分类模式的例子。
图5。
图5。
使用Motif-X算法的磷酸化特异性基序(34)。数据集包括Ascore值≥19的所有站点(n个= 3,439). 完整的图案集如所示SI表4. (A类E类)磷酸化残基(S或T)居中的单磷酸化基序的一些示例的序列标识。(A类)定向图案。(B类)分别代表CaM激酶和Akt激酶底物的基本基序。(C类)在整个鼠标数据库中,我们的630个数据集中出现了56个酸性基序。(D类)前向基序以Thr为中心,对磷酸的额外前体残基C末端有强烈偏好。(E类)pTyr基序。(F类)双磷酸化基序的示例。远离中心残基位置的二级磷酸化位点也被磷酸化。(F类)在+4处使用附加pSer进行Prodirected。(G公司)碱性上游和酸性下游。(H(H))带有两个pSer残基的酸性基序。这一类别是双磷酸化肽的最高代表。()pThr定向基序。

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引用人

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