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临床投资杂志。2015年9月1日；125(9): 3461–3476.
2015年8月4日在线发布。 数字对象标识：10.1172/JCI79964
预防性维修识别码：项目经理4588311
PMID：26241060

克鲁珀样因子4对心肌线粒体稳态的转录控制至关重要

廖旭东,1 张荣丽,1 袁璐,1 多梅尼克·A·普罗斯多西莫,1 Panjamaporn桑旺,1 张丽蕾,1 周光锦,1 普尼特·阿南德,2 凌来,三 特蕾莎·C·利昂,三 藤冈久志,4,5 方烨,5 玛丽亚娜·罗斯卡,6 查尔斯·霍珀,5 P.克里斯蒂安·舒尔茨,7 E.戴尔·阿贝尔,8 乔纳森·斯坦勒,2 丹尼尔·凯利,三和穆克什·K·贾恩1
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摘要

线粒体稳态对组织健康至关重要，线粒体功能障碍会导致包括心力衰竭在内的多种疾病。在这里，我们已经证明转录因子克鲁珀样因子4（KLF4）控制线粒体的生物发生、代谢功能、动力学和自噬清除。心肌特异性成年小鼠Klf4公司随着年龄增长或压力超负荷反应，该缺陷会导致心脏功能障碍，其特征是心肌ATP水平降低，ROS升高，线粒体形状、大小、超微结构和排列发生显著变化。对从KLF4缺乏心脏分离的线粒体的评估表明，呼吸速率降低可能是由于电子传递链复合物I的缺陷所致Klf4公司缺失导致出生后过早死亡，线粒体生物发生受损，线粒体成熟度改变。我们确定KLF4与雌激素相关受体/PPARγ辅激活子1（ERR/PGC-1）转录调控模块在代谢和线粒体靶点上的最佳功能结合、协同并必需。最后，我们发现KLF4通过转录调节心肌细胞中广泛的自噬基因来调节自噬流量。总之，这些发现确定KLF4是线粒体稳态的节点转录调节器。

介绍

心脏在一生中都需要持续不断的能量来维持收缩功能。尽管心脏的能量需求很高，但其ATP储备相对较低，因此需要持续的能量供应(1). 为了满足这种需求，心肌细胞被赋予了大量线粒体含量，几乎占氧化磷酸化（OXPHOS）产生的ATP的全部（>95%）(2). 线粒体强大的不间断ATP供应对维持心脏功能至关重要，因此线粒体功能的细微变化会对心脏功能产生重大影响也就不足为奇了。事实上，线粒体功能障碍越来越被认为是心脏病发病机制的关键(三). 然而，控制线粒体健康的分子机制尚不完全清楚。

线粒体是动态细胞器，其集体质量和形态通过线粒体生物发生、动力学（分裂/融合）和自噬清除（线粒体自噬）来调节。与能量需求增加相关的发育和生理状态（例如，出生后心脏成熟和运动）通过生物发生导致线粒体数量显著增加(4,5). 此外，线粒体动力学通过重复的融合和裂变循环帮助维持线粒体的内环境平衡，在这些循环中，线粒体内容物被混合，受损分子被稀释或被健康分子补偿，作为一种互补形式(6). 最后，线粒体的质量是通过有丝分裂来维持的，有丝分裂是一种特殊的自噬形式，有缺陷的线粒体被选择性地从细胞网络中分离出来，并受到溶酶体降解的影响(7). 越来越多的证据表明，心脏线粒体生命周期任何阶段的扰动都会损害心脏功能(5,8–10).

过去几十年的研究支持核受体超家族的一个子集在调节心脏代谢和线粒体稳态中发挥重要作用，包括PPAR家族(Ppara公司,帕德,Pparg公司)，雌激素相关受体（ERR）家族(埃斯拉,埃斯勒布,Esrrg公司)和PPARγ辅活化子1家族（例如。，第1a部分和第1b部分也称为PGC-1α和PGC-1β）。目前的研究范式表明，ERR/PGC-1分子模块调节广泛的基因，这些基因涉及心脏能量代谢、线粒体生物发生、动力学和OXPHOS(11–15). 这些效应被认为是通过直接转录控制关键靶点或通过诱导效应物（如PPARα）间接发生的，PPARα是心脏脂肪酸氧化的主要调节因子（FAO）(16). 然而，PGC-1信号在自噬中的作用仍有争议(17,18). 迄今为止，对自噬的研究主要集中在细胞质事件上，而对这一过程的转录控制知之甚少(19).

类克鲁珀因子（KLFs）属于锌指转录因子家族。我们小组和其他研究人员的研究已确定该家族成员是细胞代谢和肌肉功能的关键调节器(20–22). 例如，先前的研究已经确定KLF4对心脏适应压力至关重要，但其分子基础尚不清楚(23,24). 在这里，我们提供的证据表明，KLF4调节线粒体生命周期的所有主要方面，从代谢功能到生物发生、动力学和自噬清除。总之，本研究确定KLF4是心脏线粒体健康转录控制的核心。

结果

心脏Klf4缺乏会随着应激而损害心肌功能和能量学。

我们小组以前的研究表明，心脏特异性出生后缺失Klf4公司基因使小鼠对经主动脉缩窄（TAC）引起的压力过载后的心力衰竭和死亡高度敏感(24). 然而，这种对压力敏感的基础仍然未知。为了研究心脏功能的急剧下降，我们在8至10周龄时进行了TACMyh6-Cre Klf4公司+/+（指定A-Cre代表成人Cre）和Myh6-Cre Klf4公司飞行/飞行（成人心脏KO指定为A-cKO）小鼠，并通过系列超声心动图评估心脏功能。与之前报道的TAC后的高死亡率一致(24)，A-cKO小鼠在TAC后3天左心室缩短分数显著降低50%(图1A). 此时点采集的组织样本显示，与A-Cre组相比，A-cKO小鼠的肺重量增加，表明肺水肿，心脏肥大标记物的诱导增强，尽管由于肥大的压力超载时间有限（3天），心脏重量相似(图1A). 广泛的生化和组织学分析没有发现KLF4缺陷心脏的心肌结构、纤维化、血管系统或缺氧有任何改变。遥测心电图记录显示A-cKO小鼠没有基线异常，但在TAC诱导的心力衰竭小鼠中观察到心动过缓的证据(补充图1；本文的在线补充材料；数字对象标识：10.1172/JCI79964DS1).

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KLF4对心脏压力过载的生物能量和功能适应是必需的。

(一个)左室功能、心脏重量（HW）、肺重量（LW）和心脏中肥厚标记基因的表达。BW，体重。(B类)微阵列分析。热图显示了A-Cre和A-cKO小鼠之间假手术组的边际差异，但TAC组的显著差异。对TAC组中差异表达的基因（超过1.5倍的变化，A-cKO与A-Core小鼠）进行基因富集分析。ES，浓缩分数。(C类)一些心脏代谢和线粒体基因的qPCR分析。n个=假手术组为4，n个=7，对于A-Cre TAC组，n个=5，对于A-cKO TAC组。(D类)心肌ATP水平。(E类)通过DHE染色评估心肌ROS水平。比例尺：20μm。(F类)通过透射电镜（TEM）评估心肌超微结构，显示TAC后线粒体损伤。比例尺：2μm。代表性图片(n个=3）。在假手术和TAC手术后3天进行测量。#P（P）假手术组间<0.05*P（P）TAC组和Student组之间<0.05t吨Bonferroni校正测试。

为了深入了解潜在的分子机制，我们在TAC或假手术后3天对A-Cre和A-cKO小鼠的LV样本进行了无偏见的微阵列分析。基因表达谱显示KLF4依赖的代谢特征，尤其是TAC后线粒体基因表达(图1B). 我们通过定量RT-PCR（qPCR）分析确认了这一特征，如图1CKLF4调节FAO、OXPHOS、线粒体生物发生、动力学和自噬的转录调控相关的广泛基因的表达。

与基因表达谱一致，我们观察到TAC后a-cKO心肌ATP水平显著降低，同时ROS过度生成(图1、D和E)表明线粒体功能障碍。透射电镜研究显示，TAC后A-cKO心肌线粒体损伤的显著证据，包括线粒体紊乱、变性、断裂、伸长和异质性增加(图1F和补充图2). 此外，A-cKO组心肌糖原的片状沉积略有增加，这可能反映了受损组织中线粒体代谢降低(补充图3).

KLF4缺乏损害线粒体功能。

鉴于基因表达和线粒体形态的这些深刻变化(图1、C和F)接下来，我们评估了KLF4缺乏心脏线粒体的呼吸(补充表1). 这些研究侧重于基线时从年轻对照组和KLF4缺乏心脏分离出的线粒体，因为压力过载会导致严重的线粒体损伤，从而阻碍分离代表体内线粒体群体的线粒体样本。更重要的是，在基线检测到的线粒体缺陷更有可能解决线粒体功能障碍和心力衰竭之间的因果关系。

新分离的A-cKO心脏线粒体显示脂肪酸底物和丙酮酸降低了呼吸速率(图2A). 由于脂肪酸和丙酮酸的线粒体氧化在乙酰辅酶a水平融合，我们的数据表明KLF4缺乏导致Krebs循环或电子传递链（ETC）水平的常见下游缺陷。事实上，直接ETC呼吸研究显示a-cKO组复合I功能降低了25%(图2B)与丙酮酸氧化速率的降低相当。因此，复合物I功能缺陷可能是基线时线粒体OXPHOS功能降低的原因。与线粒体功能降低一致，我们观察到KLF4缺乏心肌中AMPKα磷酸化水平升高，这是AMP-高/ATP低阶段的一个指标，表明细胞能量不足(图2C). 在急性KLF4沉默的新生大鼠心室肌细胞（NRVMs）中观察到类似的线粒体呼吸减少(图2D)相反，KLF4的瞬时过表达增强了NRVM的线粒体呼吸(图2E)强烈表明KLF4对线粒体功能具有细胞内作用。总之，这些结果支持KLF4在线粒体OXPHOS功能和心肌能量学中的关键作用。

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KLF4缺乏损害线粒体功能和心肌生物能量学。

(一个)用脂肪酸和丙酮酸底物进行线粒体呼吸测定。苹果酸被用作NADH供体。(B类)ETC复合物活性测定。提供的数据来自5个独立实验。(C类)AMPKα磷酸化的Western blotting分析。p-AMPKα，p-Thr172。(D类和E类)用NRVM进行细胞呼吸测定(D类)急性腺病毒击倒或(E类)KLF4过度表达。提供葡萄糖（25 mmol/l）和丙酮酸（1 mmol/l）作为底物。OCR，耗氧率；Sh-EV，shRNA靶向空载体；Sh-KLF4，shRNA靶向Klf4公司；催化裂化装置，对-三氟甲氧基苯腙；腐烂、鱼藤酮；AA，抗霉素A；腺病毒空载体；Ad-KLF4，腺病毒KLF4。最大呼吸速率等于FCCP诱导的耗氧速率。n个= 3. *P（P）<0.05，学生的t吨测试。

KLF4缺乏会随着年龄的增长而损害心肌功能。

鉴于孤立线粒体呼吸研究中发现的基础缺陷，年轻的A-cKO小鼠在基础条件下表现出正常的心脏功能，这一发现有些令人惊讶。我们假设，随着时间的推移，这种基础缺陷可能会变得更加明显，并影响心脏功能（即在老年小鼠中），因为它是对TAC等急性应激的反应。我们对一组动物进行了为期9至12个月的连续超声心动图检查。6个月龄时，短缩分数略有减少，9个月龄后显著减少(图3A). 这些动物也表现出生存率下降，1岁时死亡率接近100%(图3B). 重要的是，与TAC后的心脏一样，KLF4缺乏的老年心脏表现出线粒体碎片增多、紊乱和变性，表明随着时间的推移线粒体损伤加剧(图3C和补充图4). 总的来说，这些数据表明，KLF4缺乏导致的线粒体缺陷是显著的，并且表现为对病理（压力过载）或生理应激（老化）的反应。

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老年KLF4缺乏心脏的心脏功能障碍和受损线粒体的积聚。

(一个)A-cKO小鼠的心脏功能随着年龄的增长而下降。n个= 4. *P（P）<0.05，学生的t吨Bonferroni校正测试。(B类)缩短A-cKO小鼠的寿命。n个A-cKO组=18，n个=每个对照组（A-Cre和Klf4公司飞行/飞行). 通过对数秩检验、A-cKO与A-Cre和Klf4公司飞行/飞行. (C类)9月龄小鼠心脏线粒体超微结构。代表性图片来自3对老鼠。方框区域以高倍显示。在高倍图像中，白色箭头表示线粒体健康，黑色箭头表示线粒体受损，变性（苍白）和碎裂（小而圆）。比例尺：2μm（低倍图像）；0.5μm（高倍图像）。

KLF4对出生后心脏线粒体的生物发生和动力学至关重要。

由于KLF4缺乏心肌中调节线粒体生物发生和动力学的基因发生改变(图1E)接下来，我们试图确定KLF4是否也调节心脏中的线粒体生物发生和动力学。据报道，这些过程在成年心肌中非常罕见，但对出生后的心脏适应至关重要(5,14,25). 因此，我们选择研究围产期心脏发育，因为这一时期线粒体生物发生和动力学发生了显著变化。

作为第一步，我们研究了围生期心肌KLF4的表达，发现KLF4型出生后在人类和啮齿类动物心脏中显著诱导PPARGC1A公司(图4A)编码PGC-1α，PGC-1是一种调节线粒体生物发生和动力学的转录辅激活子(5,14,26). 自从我的6-Cre我们使用的floxed基因等位基因在2周龄时仅缺失70%-80%，因此不适合研究围产期心脏发育(27)，我们选择了2.8 kb的Cre系列胶转蛋白启动子（也称为Sm22），在E9.5时有效删除心脏中的floxed基因等位基因(28) (标记-核心（以下简称E-Core）在小鼠出生后关键发育期产生心肌KLF4缺乏症(Tagln-Core Klf4公司飞行/飞行小鼠，以下称为E-cKO小鼠），用于线粒体生物发生。

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心肌KLF4是出生后线粒体生物发生和心脏成熟所必需的。

(一个)的表达式KLF4型和PPARGC1A公司在人类和老鼠的心中。将产前数据用作对照。n个=每个数据点4。(B类)心脏大小和重量。(C类)心脏收缩力，通过超声心动图评估。(B类和C类)n个4周龄时为5-7岁。(D类)心肌超微结构。显示了具有代表性的图像(n个=每组3人）。比例尺：1μm。(E类)通过qPCR评估的心脏线粒体基因组DNA。线粒体基因组拷贝（mtDNA）归一化为核DNA含量。n个每种基因型=10。Dots显示5对引物的qPCR结果(mt-Nd1号,mt-Nd4号,mt-Co1型,二氧化硫（mt-Co2）、和mt-Atp6型). (F类)线粒体基因组编码的基因的表达。恩杜夫布5作为对照。(G公司)线粒体和核编码基因的蛋白质水平。每条车道代表一种动物。(H（H）)急性击倒或(我)NRVMs中KLF4的过度表达影响线粒体编码基因的表达。考克斯5b作为对照。(J型)心脏KLF4缺乏损害调节线粒体动力学的基因表达。心脏样本：n个= 10. NRVM样本：n个= 3. 对2周龄的动物进行DNA/RNA/蛋白质分析*P（P）<0.05，学生的t吨使用Bonferroni校正进行测试。

与之前的观察结果一致(29)E-cKO小鼠出生后2周内死亡率约为50%（数据未显示）。引人注目的是，存活的E-cKO动物在4周大时表现出严重的心脏功能障碍，其特征是心脏肥大和左心室扩张，收缩功能下降(图4、B和C). 虽然我们使用的Cre已知在平滑肌细胞中表达(28)，未观察到对心肌血管密度、纤维化或低氧诱导基因表达的影响，表明血管功能完好无损(补充图5，A–C). 此外，研究表明KLF4在发育过程中不在平滑肌细胞中表达(29). 然而，我们观察到一组代谢和线粒体基因显著减少，与成人KLF4缺乏症相似(补充图5D). 因此，我们假设在E-cKO动物中观察到的心脏表型和过早死亡是由于心脏对出生后发育应激的适应不良所致。

对E-cKO小鼠LV组织的电镜评估显示心肌线粒体体积密度降低，线粒体紊乱、变性、断裂、伸长和异质性增加：1周时差异显著，2周时差异更显著(图4D和补充图6). 与观察到的线粒体密度下降一致，qPCR证实线粒体基因组DNA含量下降了约30%(图4E)在mRNA和蛋白质水平上，多个线粒体编码基因也减少(图4，F和G). 在急性KLF4沉默和过度表达的NRVM中，KLF4水平和线粒体编码基因表达之间的相关性被重新描述，表明细胞的自主效应(图4、H和I). 我们还观察到KLF4依赖于参与线粒体动力学的许多靶基因(图4J)这一发现与E-cKO心脏中存在的小（碎片）和长（巨大）线粒体一致(图4D和补充图6). 与上述线粒体异常一致，E-cKO组心肌糖原含量略有增加(补充图7). 总之，这些结果支持KLF4在出生后心脏线粒体生物发生、动力学和成熟中的关键作用。

KLF4是ERR/PGC-1转录模块所必需的。

心脏代谢和线粒体功能的转录调控主要位于上述核受体领域。有趣的是，我们注意到KLF4缺乏小鼠对生理（出生后适应）和病理（压力过载）应激的心脏表型与第1a部分,P参数1b、和埃斯拉单个或复合KO小鼠心脏线粒体功能障碍、出生后线粒体生物发生受损和动力学(5,11,13,14,30). 因此，我们假设KLF4可能与ERR/PGC-1信号通路相互作用。

我们研究了细胞色素c（c）(周期)，PPARα(Ppara公司)，丙酮酸脱氢酶激酶，同工酶4(预测值k4)作为ERR/PGC-1模块的经典直接目标(12,31,32). 启动子分析显示，多个共识KLF结合元件（CA/GCCC，KLF反应元件的指定KRE）靠近核受体反应元件（NRRE）(图5A和补充图8). ChIP和启动子报告研究证实KLF4直接结合并诱导所有3个启动子(图5A和补充图8，A和B). KLF4与ERR/PGC-1共转染导致靶启动子的协同诱导(图5B和补充图8、C和D). 相反，KLF4的敲低减弱了ERR/PGC-1介导的启动子反式激活(图5C). 接下来，我们试图确定启动子转录激活是否需要KLF4与KRE的直接结合。因为1766 bp小鼠上有4个KRE位点和1个NRRE位点周期本研究中使用的启动子，我们首先进行5′端序列截断以定位关键的KRE位点，发现当截断包括NRRE附近时，反式激活协同作用显著减弱(图5D). 进一步的启动子序列比对分析表明，NRRE侧翼的2个KRE位点从啮齿类动物到人类都是保守的，并且这2个保守的KRE位点中的一个或两个突变显著减弱了KLF4和ERR/PGC-1模块之间的反式激活协同作用，提示KLF4与启动子直接结合是实现最佳转录所必需的(图5E). 类似启动子截断分析Ppara公司启动子证明，KLF4-ERR/PGC-1协同作用需要位于2个NRRE位点之间的9个KRE位点的簇(补充图8E); 而NRRE现场第4页启动子似乎介导大多数启动子功能(补充图8F). 鉴于此Ppara公司是心脏FAO的主要调节因子，我们检测了KLF4对NRVM中FAO的影响。KLF4过表达增加了FAO基因的表达和FAO率，而敲除减弱了由WY16463（PPARα的合成配体）介导的诱导(补充图9). 相反，KLF4对糖酵解作用最小，但可能通过调节线粒体功能影响葡萄糖氧化(补充图10).

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KLF4与ERR/PGC-1转录模块结合并协同调节靶基因转录。

(一个)招募KLF4加入内源性周期启动子和启动子报告子的活化。黑色矩形表示KRE，白色矩形表示NRRE。箭头表示ChIP分析中的PCR区域。(B类和C类)KLF4与ERR/PGC-1复合物在靶向启动子上的协同合作性。(D类)启动子截断分析。(E类)中的位点突变周期发起人。(F类)KLF4与PGC-1α/PGC-1β/ERRα之间的蛋白质相互作用。(G公司)凝胶过滤色谱分析。(H（H）)KLF4增加ERRα向内源性的募集周期NRVM中的启动子。n个= 3. *P（P）<0.05，学生的t吨使用Bonferroni校正进行测试。

接下来，我们试图确定观察到的转录协同作用的分子基础。免疫共沉淀分析表明，KLF4与ERRα相互作用，在较小程度上与PGC-1α相互作用并且与PGC-2β相互作用最小(图5F). KLF4和ERRα、PGC-1α和KLF4以及ERRα和PGC-1α之间的相互作用进一步表明存在KLF4/ERR/PGC-1三分子复合物。为了验证这一想法，我们进行了凝胶过滤色谱分析，发现所有3个分子都在相同的组分中洗脱，支持三分子复合物的存在(图5G). 最后，KLF4增加了ERRα向内源性周期发起人(图5H).

为了获得进一步的机制性见解，我们通过使用一系列截短的KLF4和ERRα蛋白的联合免疫沉淀分析，绘制了介导KLF4-ERRα相互作用的蛋白质域。本研究表明，KLF4的锌指结构域（ZnF）介导与ERRα的相互作用，因为携带ZnF结构域（aa 384–479）的所有KLF4突变体，但不包括ZnF缺失突变体，都能够降低ERRα(图6，A–C). 此外，ERRα的激活功能-2同源区（AF-2）对与PGC-1α的相互作用也至关重要(33)，用于与KLF4交互(图6，D–F). 值得注意的是，尽管KLF4的ZnF结构域足以介导其与ERRα的蛋白-蛋白相互作用，但KLF4/ERRα/PGC-1α复合物的转录活性需要全长KLF4(图6G).

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KLF4和ERR/PGC-1模块之间的相互作用和合作。

(一个)全长和截短的KLF4蛋白。TAD，交易激活域；TRD，反阻遏结构域。(B类和C类)全长ERRα（FLAG-tagged）和不同形式截短KLF4（HA-taged）之间的蛋白质相互作用。(D类)全长和截短ERRα蛋白。DBD，DNA-结合域；LBD，配体结合域。(E类和F类)全长KLF4（HA标记和内源性KLF4）与不同形式截短ERRα（FLAG标记）之间的蛋白质相互作用。(G公司)ERRα/PGC-1α复合物与不同形式截短KLF4之间的功能协同性。n个= 3. *P（P）<0.05，学生t吨使用Bonferroni校正进行测试。

为了确定KLF4是否是ERR/PGC-1信号传导所必需的，我们检测了在存在或不存在KLF4的情况下，PGC-1α诱导的NRVM靶基因表达。如预期(14,34)NRVM中PGC-1α的急性过度表达诱导了许多与线粒体FAO、OXPHOS、生物发生和动力学相关的基因。然而，当KLF4被沉默时，这种诱导要么显著减弱，要么完全消失(图7，A和B). 我们还注意到，KLF4基因敲除对独立于PGC-1α的特异性线粒体编码基因有影响(图7B)提示KLF4可能调节线粒体基因组转录。最后，KLF4沉默显著减弱了PGC-1α诱导的线粒体生物反应(26)表明KLF4是线粒体生物发生机制所必需的(图7C). 总的来说，这些数据表明，KLF4与ERR/PGC-1模块的最佳转录功能结合、协同，并且是必需的，很可能是通过形成KLF4/ERR/PCC-1三分子复合物(图7D).

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KLF4是ERR/PGC-1复合物最佳转录功能所必需的。

(一个和B类)KLF4是PGC-1α介导的(一个)代谢和(B类)NRVM中的线粒体基因。(C类)KLF4缺乏损害NRVM中PGC-1α介导的线粒体生物发生。n个= 3. *P（P）<0.05，学生的t吨使用Bonferroni校正进行测试。(D类)KLF4/ERR/PGC-1转录复合物的拟议机制模型。

KLF4调节心肌细胞的自噬。

上述结果表明，在生理和病理应激下，线粒体的稳态依赖于KLF4的表达。在KLF4缺乏状态下碎片/受损线粒体的积累提出了一个问题，即KLF4的丢失是否也会影响自噬清除过程。

为了解决这一问题，我们首先检查了TAC-stressed a-cKO心脏中LC3-I到LC3-II的转换，LC3-II是自噬诱导的标志，并发现KLF4缺乏减少了LC3-II积累(图8A). 此外，在线粒体解偶联试剂（羰基氰化物间氯苯腙[CCCP]）诱导的自噬环境中，体外KLF4功能获得和丧失的研究概括了体内KLF4对LC3-II积累的依赖性影响(图8A). 为了监测自噬通量，我们使用巴非霉素A1（BFA）阻断吞噬LC3-II的溶酶体去除，并证实KLF4促进自噬流量(图8A). 如前所述，从自噬中逃逸出来的线粒体可能会触发心肌中的炎症反应，导致心脏功能障碍(35). 微阵列分析的炎症信号显示，KLF4缺陷心脏中的自噬受损不仅可能危害能量生成，还可能诱发心肌炎症(图1B)、和伊尔6体内TAC心脏和体外CCCP处理的NRVM的诱导(补充图11). 因此，KLF4缺乏似乎会损害自噬流量，导致受损线粒体的积聚和心肌炎症。

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KLF4调节心脏的自噬。

(一个)LC3活化的Western blot分析（LC3-I到LC3-II转化）。(B类)心脏中PINK1/parkin通路的激活。将来自MG132处理细胞的样本作为阳性对照。线粒体膜蛋白TOM20作为负荷对照。(C类)心脏中ULK1信号的激活（顶部）和NRVM（底部）。p-ULK1、p-Ser555。术后3天采集心脏样本。NRVM感染指示腺病毒72小时，然后用20μmol/l CCCP加或不加100 nmol/l BFA治疗2小时。(D类)KLF4诱导的自噬通量依赖于ULK1。(E类)的表达式乌尔克1NRVMs中KLF4过度表达或敲低的mRNA。(F类)乌尔克1启动子截断分析。(G公司)KLF4招募至乌尔克1近端启动子区。箭头表示ChIP分析中的PCR区域。(H（H）和我)自噬途径qPCR阵列分析。n个= 3 (E类–我). *P（P）<0.05，学生t吨使用Bonferroni校正进行测试。

PINK1/parkin通路在线粒体清除中起主要作用。去极化线粒体被PINK1识别，并通过parkin介导的泛素化进行标记，随后激活自噬相关基因（ATG）参与自噬过程(36). 通过一连串的蛋白质相互作用和修饰，ATG形成自噬体吞噬受损的线粒体并将其传递到溶酶体进行降解(37). 我们评估了TAC后心肌PINK1/parkin信号的激活。KLF4缺乏并未显著影响PINK1和parkin的线粒体富集，随后线粒体蛋白的泛素化，或p62的募集，表明PINK1/parkin信号完整(图8B). Unc-51类激酶1和2(乌尔克1和Ulk2公司)，的哺乳动物同源物附件1，在自噬体形成的起始过程中至关重要，因此是自噬的中央调节器(38–40). 研究表明，ULK1是通过一磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）在Ser555残基上磷酸化而激活的。我们检测了心肌ULK1信号，发现在KLF4缺乏的心脏中TAC诱导的ULK1磷酸化显著减弱(图8C). 这些数据在急性KLF4过度表达或敲除的NRVM中进行了重述(图8C). 此外，急性沉默乌尔克1NRVM中KLF4诱导的LC3-II转化显著减弱，表明ULK1在KLF4介导的自噬中起着不可或缺的作用(图8D).

接下来，我们试图了解KLF4如何影响ULK1激活。鉴于AMPK的磷酸化不受体外NRVMs中KLF4水平的影响，而实际上在体内KLF4缺乏的心肌中增加(图2C和图8C)，KLF4介导的ULK1磷酸化的改变不太可能是由AMPK活性的改变引起的。事实上，作为AMPK直接靶点的乙酰辅酶a羧化酶的磷酸化不受NRVM中KLF4的影响(补充图12). 然而，我们注意到ULK1总蛋白水平与ULK1磷酸化水平平行，并且与KLF4水平呈正相关(图8C)，提示可能存在KLF4介导的转录调控。与此假设一致，KLF4介导的转录乌尔克1心脏和NRVM中的qPCR证实(图1C和图8E). 确定是否乌尔克1是KLF4的直接转录靶点，我们克隆了大鼠转录起始位点上游的1071-bp启动子区域乌尔克1基因并发现其可由NRVM中的KLF4诱导(补充图13A). 值得注意的是，KLF4似乎直接将乌尔克1启动子，作为一个缺乏ZnF DNA结合域的KLF4突变体，对启动子的诱导没有影响，这种影响是KLF4特有的，因为一个密切相关的家族成员KLF2未能诱导乌尔克1发起人(补充图13B). 启动子截断研究表明，转录起始位点近端区域的多个KRE位点对KLF4介导的转录至关重要(图8F). 随后的ChIP研究证实KLF4在内源性乌尔克1NRVM中的促进者，表明乌尔克1很可能是KLF4的直接目标(图8G). 类似的KLF4介导的监管和依赖Ulk2公司也被观察到(补充图14). 总的来说，这些数据表明KLF4通过转录调控自噬流量Ulk1/2号机组.

最后，为了全面了解KLF4介导的自噬转录调控，我们使用商用qPCR阵列筛选了整个自噬途径，发现NRVM中的KLF4过表达和缺陷对广泛的自吞噬基因进行了差异调节(图8H和补充图15A). 我们进一步证实，在KLF4基因敲除后，54个基因中有31个在体内KLF4缺乏的心脏中表达减少，这再次证明了体外发现(图8I和补充图15B). 这些数据表明，KLF4可能在多个步骤转录调节自噬，使其成为这一过程的新型中央转录调节器。因此，通过自噬途径的直接转录调控，KLF4可能影响线粒体清除，即线粒体生命周期的最后阶段。

讨论

线粒体是心肌细胞的动力工厂，以ATP的形式提供能量需求，以维持收缩功能。线粒体OXPHOS功能受到严格控制，以满足细胞能量需求。此外，线粒体经历生物生成、裂变和融合以维持体内平衡。在这项研究中，我们证明KLF4可能通过与ERR/PGC-1通路的合作来调节线粒体OXPHOS、生物发生和心脏动力学。此外，KLF4还直接调节自噬基因。这些发现将KLF4定位为调节心肌线粒体稳态的转录电路的关键组成部分（总结于图9).

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KLF4在代谢和线粒体基因调节中的作用模型。

KLF4通过（i）与ERR/PGC-1转录模块合作调节代谢和线粒体基因，以及（ii）独立于ERR/PCC-1模块直接调节自噬基因，从而充当心脏线粒体稳态的关键转录调节器。十、 其他转录因子。

迄今为止，心脏能量代谢和线粒体功能的转录调控主要归因于ERR/PGC-1转录模块，在将发育和生理信号传递给转录因子的关键子集以指导核基因和线粒体基因的协调表达方面发挥着综合作用(16). 我们相信，我们的数据表明，KLF4是该转录模块的一个新的重要组成部分，这一结论的基础是多方面的。首先，在成熟和发育中的心脏中KLF4缺乏与在第1a页第1b页KO（单一和复合KO）和埃斯拉KO动物，包括细胞代谢改变、线粒体生物发生、动力学和心脏功能障碍。其次，KLF4的缺失减弱了PGC-1的经典细胞作用，包括基因表达和线粒体生物发生的改变。最后，发现KLF4在共同靶点的启动子上与ERR/PGC-1结合并协同作用。这些观察结果使人们越来越认识到，核受体和KLF串扰可以协调关键的细胞事件。例如，在脂肪细胞中，KLF5与PPARδ协同诱导第2部分基因，从而促进脂肪生成(21,41). 在心肌细胞中，KLF15与PPARα协同调节脂质代谢(42). 相反，GR信号的激活可以在特定的生理或病理环境中诱导许多KLF（例如KLF9、KLF11和KLF15）(43–45). 最后，本研究从两个层面阐明了KLF与核受体之间合作的重要性：（a）与ERR/PGC-1模块的直接合作；（b）PPARα的上游调控。

目前工作的另一个重要方面涉及KLF4对自噬的控制。这一过程对心脏稳态至关重要，其破坏会导致心脏功能恶化(10,35). 重要的是，迄今为止的大部分工作都集中在细胞质事件上，最终导致自噬反应。此外，一个小但新兴的文献强调了转录调控这一过程的重要性(19)我们的工作支持并推动了这一观点。具体而言，我们表明KLF4调节自噬途径中的许多靶点，其中许多（诱导的36个靶点中的27个；减少的54个靶点当中的27个）似乎是直接转录靶点(图8G). 我们专注于乌尔克1（及其家庭成员Ulk2公司)是ATG1的哺乳动物同源物，因为它是控制自噬的节点(19). 我们证实了乌尔克1和Ulk2公司是KLF4的直接靶点，并且是KLF4诱导的自噬所必需的。先前的研究也表明，其他转录因子参与自噬，包括p53、NF-κB、FOXO和HIF-1(19). 有趣的是，在不同细胞环境中的工作揭示了KLF4和许多其他转录因子之间的串扰，增加了KLF3在自噬的转录调控中也能与这些途径相互作用的可能性(46–49). 重要的是，我们认为KLF4介导的自噬基因诱导可能独立于ERR/PGC-1模块。先前的研究表明，PGC-1可以抑制骨骼肌的自噬(17)，我们在NRVM中也证实了这些发现（数据未显示）。虽然有必要进行更多的研究，但我们目前的观察表明，KLF4在许多步骤上对自噬途径进行调节，因此起到自噬转录开关的作用。研究表明，自噬是基础状态下心脏健康和应激反应所必需的(9,10). 因此，KLF4缺陷心脏的自噬受损可能导致最终的心肌病。

KLF4在心肌细胞/线粒体生物学中的几个方面尚不完全了解，需要进一步研究。例如，虽然我们观察到KLF4-null心脏在基线检查时多个脂质流量指标和复合物I功能降低，但心脏功能得到了保护。在应力（压力过载和老化）之后，基线时KLF4缺陷状态可能有一个未超过的阈值。功能冗余是另一种可能性，因为其他KLF已在心脏中确定。有趣的是，在单个第1a部分KO，第1b部分KO和埃斯拉KO小鼠。在所有3例患者中，突变心脏在基线时与对照心脏没有区别，但在应激反应中表现出更强的心脏功能障碍敏感性(13,30,50). 然而，两者都缺乏的复合KO小鼠P参数1a和第1b部分心脏出现了严重的心脏缺陷，支持了冗余的观点(5,14). 最后，我们注意到线粒体稳态不仅包括生物发生、分裂和融合，还包括通过自噬消除受损的线粒体。KLF4或KLF4/ERR/PGC-1通路在这些过程中是否起作用以协调整个线粒体生命周期是一个重要的尚未回答的问题。

这项工作大大增加了目前的假设，即KLF是细胞代谢的节点调节器。格雷及其同事提供了最初的联系，他们表明KLF15调节葡萄糖代谢(51). 从那时起，该基因家族中又有8个成员被证明可以调节哺乳动物和蠕虫的脂肪生成(52,53). 一些KLF因子（如KLF10、KLF11、KLF15）已被证明调节肝脏代谢(22,54–56). KLF15还被证明可以控制心肌和骨骼肌中的脂质流动和代谢(57,58). 然而，该基因家族的任何成员作为线粒体生物学的中央调节器的作用尚未报道，因此，当前的工作是该领域的一个重要进展。

方法

动物模型。

心脏特异性出生后缺失的小鼠Klf4公司(Myh6-Cre Klf4公司飞行/飞行老鼠,A-cKO小鼠）之前已经描述过(24). 胚胎心脏特异性缺失小鼠Klf4公司（E-cKO小鼠）通过将2.8 kb胶转蛋白推广人驱动的Cre lineKlf4公司飞行/飞行老鼠(28). 所有老鼠都在C57BL/6J背景上。小鼠被安置在一个温度和湿度可控的无特定病原体设施中，该设施具有12小时的光/暗循环，并可随意获得水和标准实验室啮齿动物食物。如前所述，进行TAC模型、超声心动图和遥测心电图(24,59).

组织学。

组织样本固定在10%中性福尔马林中，并按照标准方案用石蜡包埋。如前所述进行H&E染色和三色染色(24). 通过CD31（Millipore，CBL1337）或CD34染色（BD Pharmingen，553731）显示心肌毛细血管密度(60,61). 在氩缓冲无氧室中用新鲜冰冻切片进行DHE和EF5染色(62,63). 使用石蜡包埋切片，通过周期酸-希夫试剂盒（Sigma-Aldrich，395B-1KT）检测心肌糖原含量。使用ImagePro软件对显微图像进行定量分析。

细胞培养和基于细胞的分析。

如前所述，培养NRVM（从2日龄Sprague-Dawley大鼠分离）和HEK293细胞（ATCC CRL-1573）(24). 表达质粒（KLF4、ERRα、ERRγ、PGC-1α和PGC-1β）、腺病毒KLF4以及PPARα和PDK4启动子荧光素酶结构体已在前面描述过(24,31–33). 靶向大鼠的shRNAKlf4公司（GTATGTGCCCCAAGATTAA）由Welgen Inc.设计并包装成腺病毒。靶向小鼠/大鼠的腺病毒shRNA乌尔克1和Ulk2公司购自Vector Biolabs（shADV-275618和shADV-175619）。小鼠的启动子区域周期（1766 bp）和大鼠乌尔克1PCR扩增1071 bp，克隆到pGL3-碱性荧光素酶载体中。启动子的突变是通过使用QuikChange Lightning定点突变试剂盒（Stratagene，210518）进行定点突变引入的。对所有质粒进行测序以确保序列的准确性。实验前48至72小时，用指示的病毒（10 MOI用于过度表达或50 MOI用于击倒）进行腺病毒感染。使用X-tremeGENE HP DNA转染试剂（Roche，06366236001）进行瞬时转染。转染24小时后，在Veritas光度计（Turner Biosystems）上记录荧光素酶产生的生物发光(24). FAO速率通过释放[三H] -高2细胞溶解液水相中的O从1氧化氯仿提取物-[三H] -如前所述的油酸(47). 使用Seahorse XFp胞外通量分析仪和XFp糖酵解应激测试试剂盒和XFp细胞线粒体应激测试试剂包分别评估NRVM中的糖酵分解率和线粒体呼吸率（Seahorse-Bioscience）(42). 在体外自噬研究中，NRVM被指示的腺病毒感染72小时，然后用20μmol/l CCCP加或不加100 nmol/l BFA治疗2小时(35)（CCCP，西格玛-阿尔德里奇，C2759；BFA，西格马-阿尔德里希，B1793）。

RNA提取和qPCR。

使用TissueLyser（Qiagen）在TRIzol试剂（Life Technologies，15596-026）中均质组织样品。将细胞样品直接溶解在TRIzol试剂中。提取总RNA，用DNase I（Life Technologies，18068015）处理，用RNeasy MinElute Cleanup Kit（Qiagen，74204）纯化，并用iScript逆转录试剂盒（Bio-Rad，170-8841）逆转录到互补DNA。qPCR采用TaqMan方法（罗氏通用探针库系统）或SYBR绿色方法在ViiA 7实时PCR系统（应用生物系统）上进行。使用ΔΔCt方法计算相对表达，并将其归一化为Gapdh公司PCR引物序列列于补充表2.

线粒体呼吸研究。

在每次实验中，收集4只小鼠的心肌线粒体。简而言之，心室被切除、汇集，并在冷藏的Chappell-Perry缓冲液中清洗，然后均质。采用差速离心结合胰蛋白酶消化法分离纤维间线粒体(64). 通过在30°C下使用克拉克型氧电极测量耗氧量来评估线粒体呼吸率。用100μmol/l ADP耗尽内源性底物后，在100μmol/l ADP存在下记录到状态3呼吸速率，在ADP耗尽后记录到状态4呼吸速率。ETC酶活性通过使用渗透性线粒体的特定供体受体氧化还原酶活性进行分光光度测定(64).

线粒体基因组定量。

使用QIAamp DNA Mini Kit（Qiagen，51304）从心脏或NRVM中提取总DNA。使用多个线粒体编码基因特异性引物通过qPCR评估线粒体DNA含量(mt-Co1型,二氧化硫（mt-Co2）,mt-Nd1号,mt-Nd5,mt-Cytb公司,mt-Atp6型)并使用ΔΔCt方法归一化为核DNA含量（小鼠6号染色体或大鼠4号染色体上的特定位点）。引物序列列于补充表2.

透射电子显微镜。

用三醛-DMSO、四氧化二铁氰化锇和酸化醋酸铀酰连续浸泡法固定左室游离壁的小块组织；在浓度升高的乙醇中脱水；通过环氧丙烷；并嵌入Poly/Bed树脂中（Polysciences Inc.，21844-1）。薄片依次用酸化的醋酸铀酰进行染色，然后用佐藤三铅染色法进行改良，并用JEOL 1200EX电子显微镜进行检查(65).

蛋白质印迹。

使用RIPA缓冲液（Sigma-Aldrich，R0278）提取培养细胞或组织中的蛋白质，并辅以蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒（Roche，4693132001和4906845001）。用1%DDM（生命技术，BN2005）或2%CHAPS（Sigma-Aldrich，C5070）溶解线粒体蛋白。使用了以下抗体：磷酸-AMPKα（Thr172）（细胞信号，2535）、AMPKα（细胞信号学，2603）、α-微管蛋白（Sigma-Aldrich，T9026）、mt-CO1（Abcam，ab14705）、mt-CO2（Abcan，ab110258）、NDUFS1（Abcam，ab169540）、ATP5a（Abcam，ab14748）、COX IV（细胞信号化，4844）、KLF4（Santa Cruz，sc-20691）、LC3B（Cell Signaling，3868）、，PINK1（Sigma-Aldrich，SAB1304438），parkin（Cell Signaling，4211），SQSTM1/p62（Cell信号，5114），TOM20（Santa Cruz，sc-11415），泛素（Cell信令，3936），磷酸-ULK1（Ser555）、HRP-linked anti-FLAG（Sigma-Aldrich，A8592）、HRP-linked anti-HA（Sigma-Aldrich，H6533）、HRP linked anti rabbit IgG（Cell Signaling，7074）和HRP-linkd anti-mouse IgG。请参阅补充材料中完整的未经编辑的斑点。

协同免疫沉淀。

使用Pierce IP裂解缓冲液（Life Technologies，87787）结合超声处理制备HEK293细胞的总蛋白，以确保提取核蛋白。对于每次免疫沉淀，用2至5μg与琼脂糖或磁珠结合的抗体对1 mg蛋白质进行免疫沉淀。抗-FLAG（EZview Red Anti-FLAG M2亲和凝胶，Sigma-Aldrich，F2426）、抗-HA（EZview Red Anti-HA亲和凝胶、Sigma-Aldrich，E6779）和抗KLF4（Santa Cruz，sc-20691）抗体用于免疫沉淀。免疫复合物被广泛清洗并在Laemmli样品缓冲液中洗脱（Bio-Rad，161-0737）。沉淀蛋白和输入蛋白按照指示进行SDS-PAGE和免疫印迹。

凝胶过滤色谱法。

通过超滤将无细胞提取物浓缩至<200μl（总蛋白~7 mg），并以0.5 ml/min的流速施加到与PBS平衡的Superdex 200 10-×300-mm柱上。将洗脱液收集在1 ml馏分中，并通过超滤浓缩至40μl。洗脱组分通过Western blotting进行分析。使用凝胶过滤标准物的洗脱曲线测定组分中蛋白质的分子量（Bio-Rad，151-1901）。

炸薯条。

NRVM（2×107)用1%甲醛固定，提取染色质并用BioRuptor（Diagnode）进行超声处理。用2至5μg与Dynabeads（Life Technologies，10003D）结合的抗KLF4抗体（Santa Cruz，sc-20691）免疫沉淀超声染色质，然后进行大量洗涤和洗脱。然后反向交联染色质，然后纯化基因组DNA。通过qPCR扩增沉淀样品和输入样品中的靶区和非靶区。大鼠4号染色体上的一个位点被用作非靶点对照。ChIP引物序列列于补充表2.

微阵列分析。

在术后3天，从A-Cre和A-cKO小鼠假手术或TAC中纯化心室总RNA(n个=每组4人）。根据UCSF共享微阵列核心设施和安捷伦科技公司的标准协议进行样品制备、标记和阵列杂交(网址：http://www.arrays.ucsf.edu和网址：http://www.agilent.com). 使用安捷伦2100生物分析仪（安捷伦科技公司）上的Pico芯片评估总RNA质量。按照制造商的协议，使用安捷伦低RNA输入荧光线性扩增试剂盒扩增RNA并用Cy3-CTP标记。使用Nanodrop ND-100（Nanodrot Technologies Inc.）评估标记的cRNA，并将等量的Cy3标记靶基因与安捷伦全鼠基因组4x44K喷墨阵列杂交。根据制造商的方案进行14小时的杂交。使用安捷伦微阵列扫描仪扫描阵列，并使用特征提取v10.1软件（安捷伦）提取原始信号强度。在使用limma软件包进行差异表达分析之前，对微阵列数据进行对数转换。带有P（P）使用Benjamini和Hochberg方法校正错误发现率后，该值小于0.05，被认为在差异表达中具有显著意义。使用DAVID生物信息学套件分析生物过程中的富集。微阵列数据集已存放在NCBI基因表达总览室，其登录号为GSE61177标准.

统计。

结果显示为平均值±SEM。双尾学生t吨用检验法比较两组之间的差异。采用带Bonferroni校正的单向方差分析进行多重比较。使用对数秩检验比较存活曲线。统计显著性定义为P（P）< 0.05.

研究批准。

所有动物研究均由凯斯西储大学机构动物护理和使用委员会批准。哥伦比亚大学和凯斯西储大学的机构审查委员会批准使用人体样本（IRB-AAAE7393）。如前所述获取人体心脏样本(57,66).

补充材料

补充数据：
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致谢

我们感谢白晓东（凯斯西储大学RNA中心）对微阵列数据进行分析，感谢陈泉（中国科学院动物研究所，北京）对自噬研究的帮助。这项工作得到了美国心脏协会设立的研究者奖（M.K.Jain）的支持；美国心脏协会国家科学家发展基金资助12SDG12070077（给X.Liao）和12SDG12050558（给Y.Lu）；NIH授予R01HL058493（给D.P.Kelly）；R01HL110630-01、R01HL112486、R01WL086548和R01HL19195（致M.K.Jain）；T32HL105338和F32HL110538（致D.A.Prosdocimo）。这项工作也得到了Tom F.Peterson（对M.K.Jain）的慷慨支持。

脚注

关于本手稿评估的注意事项：杜克大学、北卡罗来纳大学教堂山分校、杜克-美国和桑福德-伯纳姆医学研究所的科学家撰写的手稿，不是由编辑委员会成员处理，而是由科学编辑处理，他们与选定的外部编辑和审稿人协商。

利益冲突：Jonathan S.Stamler拥有Adamas Pharmaceuticals、LifeHealth LLC和Nivalis Therapeutics的所有权；从LifeHealth LLC和诺华获得收入；拥有众多优秀的专利和专利申请。Daniel P.Kelly是辉瑞公司的顾问，接受武田制药和Acorda Therapeutics的研究支持。

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文章来自临床研究杂志由以下人员提供美国临床研究学会