一氧化氮介导的肿瘤EMT抑制机制

摘要

介绍

一氧化氮（NO）在许多人类疾病及其治疗应用中的分子理解已取得进展。然而，NO在癌症发展和进展中的作用仍然存在争议，文献中有报道称NO是一种潜在的抗肿瘤或促肿瘤药物。NO在肿瘤学中的双相作用似乎取决于其工作微环境，包括肿瘤类型的反应性、反应的氧化还原状态，以及最终的细胞内浓度和细胞内暴露于一氧化氮的持续时间。^1–三因此，文献中有大量证据表明，低浓度的NO可能通过保护肿瘤细胞免受凋亡而增强其生存、增殖和生长，而高浓度的NO则通过促进DNA损伤、蛋白质功能障碍、基因突变和肿瘤细胞死亡而表现出细胞毒效应，所有这些都有助于肿瘤的消退。⁴

NO在参与转移过程的各个阶段的调节中的作用也存在争议，有报道对其抗转移活性与促转移活性进行了辩论。转移始于肿瘤细胞获得侵袭性和迁移性，这一过程称为上皮-间充质转化（EMT）。据报道，低浓度NO通过表达血管生成和淋巴管生成因子诱导肿瘤细胞迁移和侵袭，而高浓度NO抑制血管生成和转移。^1，4

一氧化氮供体在很宽的时间间隔（秒到天）内模拟内源性NO的持续生成。因此，根据半衰期、浓度和暴露于该化合物的肿瘤细胞类型，NO供体可引发多种生物和（亲与抗）转移反应。因此，据报道，NO供体在各种肿瘤模型中外源性给予NO会导致MMP升高⁵和CXCR4，⁶表达以及降低肿瘤细胞对细胞外基质成分的粘附，^7，8所有这些都导致了肿瘤的转移。另一方面，在各种体内外肿瘤模型中，NO-释放剂通过减少血管生成，从而抑制肿瘤细胞的侵袭，从而抑制转移性肿瘤细胞的行为。^9–13NO的抗侵袭和抗转移特性要么归因于抑制血管生成因子，如β-FGF和TGFβ1，^9–11或诱导TIMP-2生成和抑制p38。¹³或者已经提出NO通过调节NO/cGMP介导的机制来干扰储存操作的钙动员，¹⁰或者可以防止氧自由基和过氧硝酸盐（ONOO⁻)导致细胞损伤，促进肿瘤转移。¹²然而，尚不清楚NO是否以及通过何种机制直接干预EMT的分子调控。

众所周知，EMT是包括NFκB通路在内的肿瘤细胞中许多组成性活性生存途径的靶点。^14–16NFκB通过调节多种基质蛋白酶、粘附分子以及血管生成和侵袭因子的表达诱导EMT。^14，17–21相反，通过各种方式抑制NFκB可抑制EMT并抑制肿瘤细胞转移。^18–22最近，NFκB被鉴定为额外EMT诱导基因产物（即蜗牛）的转录激活物。蜗牛属于蜗牛转录因子家族，被认为是EMT在发育和癌症转移过程中启动的标志，直接通过转移抑制基因的转录抑制E-钙粘蛋白并间接促进间充质基因产物的上调。^23，24除E-cadherin外，蜗牛最近被证明能抑制另一种肿瘤抑制基因产物的转录，即Raf-1激酶抑制剂蛋白（RKIP）。²⁵RKIP是磷脂酰乙醇胺结合蛋白（PEBP）家族的成员，其主要功能之一是抑制NFκB和MAPK信号通路。RKIP通过分别与Raf-1、TAK/NIK和IKK激酶的物理结合介导其对NFκB和MAPK的抑制活性，从而抑制其作为激酶的活性。^26，27RKIP表达水平在许多原发性肿瘤中降低，在一些转移性肿瘤中几乎没有表达。^28–30在包括前列腺癌在内的实验性癌症模型中，RKIP过表达被证明可以抑制转移，因此RKIP也被称为转移抑制基因产物。^28–31Snail和RKIP的表达水平在前列腺癌细胞系和患者样本中呈负相关。²⁵蜗牛和RKIP在调节肿瘤细胞对凋亡刺激的抵抗方面也表现出相反的作用。³²

我们的初步发现表明，用NO供体DETANONOate治疗EMT阳性的人前列腺癌细胞系PC-3和DU145可抑制其EMT表型（Baritaki等人AACR 101^标准AACR 2010年年度会议，摘要编号：1466）。我们假设DETANONOate诱导NFκB的抑制³³可能会抑制下游的转移诱导转录因子蜗牛，而蜗牛反过来会抑制转移抑制基因产物RKIP的表达。由于蜗牛和RKIP都被证明调节EMT表型，^{22–24，28–31}DETANONOate介导的对蜗牛和RKIP表达和活动的影响可能导致EMT的抑制。为了验证这一假设，我们检查了以下内容：（1）在用作实验模型的实验性前列腺转移癌细胞系中，DETANONOate是否抑制NFκB信号传导？（2） DETANONOate是否直接和/或间接抑制EMT诱导剂蜗牛的表达和活性，抑制蜗牛是否抑制EMT？（3） DETANONOate是否通过抑制蜗牛来抑制转移抑制剂RKIP的激活，RKIP过表达是否抑制EMT？（4）用DETANONOate治疗携带PC-3异种移植物的小鼠是否会逆转EMT表型并验证体外研究结果？本研究结果与上述假设一致，并揭示了DETANONOate治疗在所用浓度下通过干扰NFκB/蜗牛/RKIP电路抑制转移性前列腺癌细胞系中的EMT。

结果

DETANONOate对前列腺癌细胞系EMT表型的抑制作用。

为了研究DETANONOate在EMT调节中的作用，我们监测了DETANONOate介导的基因产物表达谱的变化，这些基因产物积极参与间充质细胞表型的获得，如纤维连接蛋白和波形蛋白。用1000μM DETANONOate处理DU145和PC-3细胞4和12小时后，两个时间点的高基线水平纤维连接蛋白和波形蛋白显著降低。通过western blot分析，这种治疗还恢复了肿瘤抑制基因产物E-cadherin的表达(图1A). 此外，用DETANNOATE处理24小时的肿瘤细胞没有显示出间充质细胞表型的任何显著逆转，这表明DETANNOATE在相对较短的时间窗口内介导其作用（数据未显示）。此外，通过体外侵袭试验评估，用浓度大于500μM的DETANONOate处理细胞后，上述处理的肿瘤细胞的侵袭性显著减弱（>5倍）。相反，低于500μM DETANONOate浓度不会显著抑制侵袭(图1B). 采用蛋白酶体抑制剂NPI-0052处理细胞作为阳性对照。²²这两种细胞系的特点是NFκB信号通路的结构性激活。用浓度为500和1000μM的DETANNOate处理DU-145细胞，可抑制NFκB DNA结合活性(图1C). DETANONOate诱导的NFκB抑制作用及其与EMT的关系通过使用核因子κB抑制剂DHMEQ得到证实。用DHMEQ处理细胞可抑制EMT并模拟DETANONOate的作用(补充图1). 总的来说，上述研究结果表明，高水平的DETANONOate（500–1000μM）通过干扰参与EMT调节的NFκB调节基因产物的表达来抑制EMT表型。

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图1

DETANONOate抑制NFκB并逆转间充质细胞和侵袭性细胞表型。（A） DETANONOate逆转间充质细胞表型。在用1000µM DETANONOate处理4和12 h前后，对来自DU-145和PC-3细胞的蛋白裂解物进行western blot分析，以测定E-cadherin、vimentin和fibronectin的表达。肌动蛋白被用作加载的内部控制。（B） DETANONOate抑制DU145细胞的侵袭性。2.5 × 10⁴将DU-145细胞接种在方法所述的体外侵袭检测系统的上腔中，同时在下腔中添加含有10%FBS的RPMI 1640。用200、500或1000µM DETANONOate处理或不处理细胞，并孵育22 h。在基质凝胶膜固定和结晶紫染色后，在显微镜下计数侵入细胞。数据表示为通过基质凝胶基质和膜的侵入百分比，相对于通过对照插入膜的迁移。与未处理的细胞相比，p＜0.03（Mann-Whitney U检验）。（C） DETANONOate对NFκB DNA结合活性的抑制。用500或1000μM DETANONOate处理DU145细胞4 h，并对衍生的核提取物进行EMSA处理。β-actin水平作为负荷控制。

DETANONOate抑制EMT诱导物蜗牛的表达并诱导转移抑制物RKIP的表达。

上述结果表明，DETANONOate抑制转移性前列腺癌细胞系中的EMT表型。EMT诱导因子蜗牛是受NFκB转录调控的基因之一，在间充质细胞表型的获得和EMT的诱导中起着关键作用。³⁴此外，转移抑制基因产物RKIP最近也被证明参与EMT的调节。²²因此，我们假设DETANONOate诱导的EMT抑制可能部分归因于DETANOOate调节蜗牛和RKIP水平表达的能力。这一假设是通过如下所述的各种实验设计进行测试的。

DETANONOate下调EMT诱导物蜗牛的表达。用1000μM DETANONOate处理EMT阳性的DU145和PC-3细胞，导致蜗牛mRNA和蛋白质水平显著降低。在治疗2 h后监测PC-3细胞中蜗牛mRNA的抑制，在治疗后4 h和8 h观察到抑制峰值(图2A和上部）。在DETANONOate治疗后4小时和12小时，发现蜗牛蛋白质水平受到显著抑制(图2A和下部），伴随着在同一时间点观察到的间充质标记物的抑制(图1A).

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图2

DETANONOate抑制蜗牛的表达和活动。（A） DETANONOAT抑制蜗牛的表达。分别通过实时PCR和western blot分析评估1000μM DETANONOate处理细胞后蜗牛转录物（上部）和蛋白质水平（下部）的时间动力学分析。蜗牛转录水平的抑制表现为扩增产物的标准化周期阈值（Ct）随时间的增加。在相同样本中评估的GAPDH的Ct值用作正常化对照。数据表示为三次执行的一次实验的平均标准化Ct值±STDEV*p<0.05：处理细胞与未处理细胞。（B） DETANONOate对蜗牛DNA结合活性的抑制作用。在不含DETANONOate的无血清培养基中培养DU145细胞30分钟或4小时。使用生物素标记的寡核苷酸蜗牛探针，通过EMSA评估蜗牛的DNA结合活性。（C） DETANONOate诱导蜗牛蛋白S-亚硝基化。DETANONOate治疗后S-亚硝基化蜗牛的免疫沉淀（1000μM，4 h）。总细胞裂解物用于免疫沉淀分析，使用材料和方法中描述的蛋白A珠。用抗S-亚硝基半胱氨酸（SNO-Cys）抗体沉淀S-亚硝酸盐化蛋白，用蜗牛多克隆抗体免疫印迹膜。兔IgG作为阴性对照。（D） 蜗牛抑制在eMt抑制中的直接作用。使用蜗牛siRNA抑制蜗牛72小时后，从DU 145细胞中获取总细胞裂解物，并进行western blot分析，以测定所示基因产物的蛋白表达。在转染试验中使用随机核苷酸序列（CNTR siRNA）作为对照。Actin被用作内部控制。

除了DETANONOate对蜗牛表达的抑制作用外，我们进一步研究了DETANOOate是否也可以作为转录因子影响蜗牛的活性。EMSA对PC-3细胞中蜗牛DNA结合活性的分析表明，DETANONOate在DETANOOate处理30分钟后即可显著抑制蜗牛的DNA结合活动。如用500和1000μM DETANNOATE处理后4小时所示，抑制遵循浓度依赖性模式(图2B). 考虑到蜗牛的锌指结构，³⁵我们假设，DETANONOate对其DNA结合活性的抑制可能部分归因于DETANOOate介导的蜗牛蛋白S-亚硝基化，正如我们之前报道的其他锌指转录因子（如YY1）。³⁶使用SNO-Cys多克隆抗体进行的共免疫沉淀试验在DETANOATE处理的细胞中检测到显著水平的S-亚硝基化蜗牛蛋白(图2C).

通过小干扰RNA（siRNA）沉默DU145细胞中的蜗牛，检测DETANONOate诱导的蜗牛抑制与EMT抑制的直接相关性。蜗牛沉默模仿DETANONOate抑制间充质标记物波形蛋白和纤维连接蛋白，上调上皮基因产物E-cadherin(图2D). 这些发现表明，DETANONOate抑制蜗牛的表达和活动。此外，研究结果表明，DETANONOate对蜗牛的抑制参与了DETANOOate对EMT的抑制。

DETANONOate诱导转移抑制剂RKIP的表达。1000μM DETANONOate治疗肿瘤细胞的时间动力学分析显示，在治疗后不到2 h，RKIP mRNA上调(图3A). 对于蛋白质表达，在4小时时有诱导作用，在12小时时增加(图3B). RKIP作为一种转移抑制基因产物在几种肿瘤中的作用已被证实。⁸蜗牛直接抑制RKIP转录；²⁵因此，我们假设DETANONOate介导的蜗牛表达抑制可能导致下游RKIP诱导。在转染野生型RKIP-Luc报告子或携带与蜗牛结合的电子盒突变的RKIP-Loc报告子的DU145细胞中，证实蜗牛参与了RKIP调节。²⁵与野生型RKIP报告子转染的肿瘤细胞相比，携带蜗牛结合突变的RKIP报道子转染肿瘤细胞的基础启动子活性增强。与蜗牛siRNA共转染提高了野生型RKIP报告子转染细胞的报告活性，而与突变型RKIP报告子转导的细胞没有变化(图3C). 通过使用CMV表达载体在DU145细胞中异位表达RKIP，进一步检测了DETANNOate诱导的RKIP在抑制EMT中的直接作用。过度表达RKIP的细胞（CMV-HA-RKIP转染细胞）显示蜗牛表达降低，波形蛋白和纤维连接蛋白表达受到抑制，E-cadherin水平升高(图3D). 通过沉默RKIP逆转DETANONOate对EMT的抑制作用，进一步证实了RKIP诱导在DETANOOate介导的EMT抑制中的直接作用。用RKIP siRNA预处理70 h，然后再暴露于DETANONOate（1000 uM）12 h的DU145细胞，其波形蛋白和纤维连接蛋白的表达与基线（未用DETANONOate处理的细胞）相似；然而，与来自DETANONOate和对照siRNA处理的细胞相比，这些表达显著上调(图3E). RKIP沉默后由DETANNOATE诱导的上皮表型的逆转通过在不存在或存在RKIP siRNA的情况下用DETANNOATE处理的细胞的形态学的显微镜比较得到证实（数据未显示）。

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图3

DETANONOate上调RKIP表达。（A） 通过实时PCR评估，DETANONOate上调PC-3细胞中的RKIP转录水平。RKIP转录水平的诱导表现为扩增产物的标准化周期阈值（Ct）随时间的降低。在相同样本中评估的GAPDH的Ct值用作正常化对照。数据表示为三次执行的一次实验的平均标准化Ct值±STDEV*p<0.05：处理细胞与未处理细胞。（B） DETANONOate诱导RKIP蛋白表达。在DETANONOate处理后4和12小时，从DU145和PC-3细胞中获取蛋白裂解物，并进行蛋白质印迹分析，以测定RKIP蛋白。（C） 蜗牛对RKIp启动子活性的调节。将蜗牛siRNA或相对对照siRNA与pRKIP-Luc野生型（pRKIP-Luc w/t）或突变了5个E-box中3个的pRKIP-Luc突变体（pRKIP-Luc mut）启动子构建物共同转染DU145细胞*p=0.013：转染与转染，并用蜗牛siRNA细胞处理。（D） RKIP在EMT抑制中的直接作用。在使用CMV-HA-RKIP载体过度表达RKIP 48 h后，从DU145细胞中获取总细胞裂解物，并进行western blot分析，以测定所示基因产物的蛋白表达。使用CMV空载体（CMV-HA-EV）作为阴性转染对照。（E） siRNA沉默RKIP可逆转DETANOOATE介导的对DU145细胞EMT表型的抑制。用RKIP siRNA或对照siRNA预处理细胞70 h，然后再暴露于DETANONOate（1000 uM）中12 h。使用随机核苷酸序列（CNTR siRNA）作为阴性沉默对照。western blot分析检测RKIP、波形蛋白和纤维连接蛋白的表达。肌动蛋白被用作所有蛋白质分析的内部对照。

总的来说，上述研究结果表明，DETANONOate诱导转移抑制基因产物RKIP的表达，并且这种诱导对DETANOOate介导的EMT抑制具有关键和直接的作用。

DETANONOate在体内抑制含胶束PC-3异种移植物中的EMT表型。

为了进一步验证我们在体内对DETANONOate介导的EMT表型抑制的体外研究结果，我们使用了携带PC-3异种移植物的裸鼠，连续12天每天用DETANOOate或生理盐水治疗。治疗结束后，取肿瘤组织切片，通过免疫组织化学方法在体外分析RKIP、蜗牛、E-cadherin、波形蛋白和纤维连接蛋白的表达(图4). 研究结果表明，与体外用DETANONOate处理的PC-3细胞相似(图4A)，来自DETANONOate处理小鼠的活检组织中蜗牛、波形蛋白和纤维连接蛋白的表达显著降低，而RKIP和E-cadherin的表达与盐处理小鼠相比升高(图4B). 此外，单用DETANONOate治疗PC-3肿瘤的小鼠对肿瘤大小没有影响，而DETANOOate和CDDP的联合治疗显著减小了肿瘤大小（Huerta Yepez等，AACR 100^第个2009年AACR年会，摘要编号：4542）。这些发现构成了我们对DETANONOate逆转PC-3细胞间充质转移表型的体外观察的体内验证。

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图4

在携带PC-3异种移植物的小鼠中验证NO介导的间充质细胞表型逆转。（A） 500和1000μM DETANONOate治疗后PC-3细胞纤维连接蛋白、波形蛋白和E-cadherin表达的免疫组织化学分析。使用兔IgG对照作为阴性对照。（B） PC-3肿瘤小鼠活检组织中RKIP、蜗牛、纤维连接蛋白和E-cadherin表达的代表性免疫组织化学染色。如上所述，使用兔IgG对照作为阴性对照。

讨论

有证据首次证明，高水平的NO供体DETANONOate可抑制用作模型的转移性肿瘤细胞系中的EMT表型。DETANONOate介导的EMT抑制的潜在机制在很大程度上是由于EMT诱导剂蜗牛的抑制和转移抑制剂RKIP的诱导。有几条证据支持DETANNOATE修饰的Snail和RKIP表达在抑制EMT中的直接作用。因此，DETANONOate对EMT和细胞侵袭性的抑制作用是由于转移抑制因子RKIP和E-cadherin水平的增加，以及转移诱导因子蜗牛、波形蛋白和纤维连接蛋白表达的抑制。在接受DETANONOate治疗的荷瘤异种移植物小鼠中，验证了DETANOOate对体外显示的EMT表型的抑制作用。这些发现表明NO供体在抑制恶性肿瘤细胞EMT和转移方面具有潜在的治疗作用。

DETANONOate诱导的修饰导致NFκB/蜗牛/RKIP环的失调，导致EMT表型的抑制(图5). DETANONOate单独修饰的这些基因产物中的每一个都被证明与EMT直接相关，一些证据支持它们在EMT中的作用。NFκB在肿瘤转移和EMT中具有既定的诱导作用。NFκB调节多个粘附分子和基质蛋白酶的表达以及参与血管生成和细胞侵袭的基因的表达。^14，17，18肿瘤模型中NFκB缺乏导致细胞形态改变，细胞运动和侵袭潜能降低。^18–21我们和其他人之前已经证明，NO供体释放的高亚毒性NO浓度可以在多个水平上作为NFκB活性的有效抑制剂。^37–40我们的发现是，DETANONOate诱导NFκB的抑制以及NFκ的B在EMT抑制中起作用，这与我们的观察结果一致，即化学抑制剂DHMEQ对NFκ）B的抑制作用⁴¹导致DU145细胞的间充质表型丢失（参见补充图1). 我们已经报道了用DETANONOate治疗前列腺癌和非霍奇金B细胞淋巴瘤（B-NHL）细胞系可降低NFκB与DNA的结合活性，这种活性归因于NO对核因子κB p50亚基的s-亚硝化作用。^33，42，43上述观察结果表明，NO是一种有效的NFκB抑制剂，而DETANONOate部分通过抑制核因子κB信号传导调节其抗转移特性。

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图5

DETANONOate介导的EMT抑制中的NFκB/Snail/RKIP串扰。我们认为，NO-介导的NFκB活性抑制不仅是EMT反应的调节剂，而且还通过调节下游EMT相关靶点（如蜗牛）发挥调节作用。NO介导的对蜗牛表达和活性的抑制反过来导致其转录靶点RKIP和E-cadherin的去表达，以及蜗牛调节的间充质标记物的抑制。除了NO直接介导的抑制外，RKIP诱导通过NFκB抑制直接减弱蜗牛抑制的反馈回路。上述基因产物的表达和活性的所报告的修饰构成了一种可能的机制，通过这种机制，DETANONOate可以在体内外抑制间充质细胞表型以及转移前列腺细胞的迁移和侵袭特性。

一些证据支持DETANONOate抑制蜗牛作为抑制EMT表型的关键因素的作用。DETANONOate治疗前列腺转移细胞导致蜗牛的表达和活性受到抑制。在我们的实验模型中，siRNA对蜗牛的沉默导致间充质基因标记的抑制和E-cadherin的重新表达，表明NO-介导的蜗牛抑制与上皮细胞表型的恢复直接相关。我们最近证实，在非转移性前列腺细胞系LNCaP中，稳定的蜗牛型蜗牛-6SA的过度表达导致E-cadherin下调和EMT表型的获得，同时伴有波形蛋白和纤维连接蛋白的表达，而之前的研究表明，蜗牛间接调节基因产物。^22，23这些发现与之前的研究一致，研究表明，除了E-cadherin抑制外，异位蜗牛表达下调其他上皮标记物，如mucin1和细胞角蛋白-18，⁴⁴上调并重新分配间充质标志物，如波形蛋白和纤维连接蛋白。²⁴上述发现证实了先前的报道，即蜗牛沉默可以抑制肿瘤生长和侵袭性。^45，46因此，我们的研究结果表明，NO可以通过负面干扰蜗牛的表达和转录活性来充当EMT的调节器。

DETANONOate诱导的RKIP表达在抑制EMT表型中的直接作用得到了多个证据的证实。DU145细胞中RKIP的异位表达在减少间充质标记物的表达和重新分配E-cadherin水平方面模拟了DETANONOate的细胞治疗。相反，siRNA沉默RKIP导致DETANONOate介导的DU145细胞间充质表型抑制逆转。据报道，在前列腺癌细胞系中，Snail的表达不仅与E-钙粘蛋白水平呈负相关，而且通过直接转录抑制与转移抑制因子RKIP的表达呈负相关。²⁵siRNA对DU145细胞中蜗牛的抑制导致野生型而非突变型RKIP启动子活性和表达增强，表明蜗牛对RKIP的负调控。用DETANONOate处理DU145细胞，在恢复RKIP mRNA和蛋白质水平方面模拟了蜗牛沉默，而此前已经证明蜗牛在LNCaP细胞中过度表达会导致RKIP显著下调。²²RKIP介导的蜗牛抑制作用可部分归因于RKIP对NFκB的抑制作用，NFκ子B是蜗牛的转录激活物。³⁴此外，NO对RKIP表达的诱导作用可能转化为对NFκB及其下游靶点的进一步抑制，因为RKIP是一种有效的NF-κB激活抑制剂。²⁷在我们的实验模型中，DETANNOATE对RKIP的诱导得到了研究结果的支持，该研究结果表明，用NO供体SNAP处理正常角质形成细胞会导致RKIP mRNA和蛋白质水平升高，并抑制增殖。⁴⁷体外和体内研究已确定RKIP是前列腺癌和乳腺癌的转移抑制剂，对肿瘤细胞内灌注和骨转移具有抑制作用。³¹虽然RKIP抑制侵袭和转移的潜在机制尚未完全阐明，但有人提出，乳腺肿瘤中的抗转移RKIP功能在一定程度上是通过干扰涉及MAPK、Myc、LIN28、let-7和下游let-7靶点的信号级联来介导的。⁴⁸

我们关于DETANONOate对RKIP和蜗牛表达的抑制作用以及对EMT细胞表型的体外研究结果在携带PC-3异种移植物的小鼠体内得到了进一步验证。与我们的体外观察结果类似，与未经DETANONOate处理的小鼠相比，来自DETANOOate处理小鼠的肿瘤活检的特征是间充质标记物的表达下调，RKIP和E-cadherin的诱导。这些发现与其他研究一致，这些研究表明，一氧化氮释放剂在体内外对转移性肿瘤细胞行为具有抑制作用。^9–13

将NO供体视为治疗剂的挑战是以持续和可控的方式输送NO。自发产生大量NO的NO供体，独立于iNOS诱导，在生理pH下被激活。⁴⁹DETANONOate属于NO供体的二氮二甲酸盐（以前叫NONOates）家族。⁵⁰描述了一系列非油酸盐，半衰期从秒到小时不等。目前，NONOates尚未用于临床，尽管它们在不同的实验模型中经常进行测试，包括癌症的发展、进展和转移。⁵¹这类化合物的一个吸引人的特点是，通过对NONOate结构的特定修饰，可以准确预测NO释放的速率和选择性。^52，53因此，NONOates释放NO的可预测性，特别是在高浓度下抑制肿瘤进展和转移，使其成为治疗某些癌症的潜在实验工具，⁵⁴尽管对这些药物的进一步鉴定是必要的。

总的来说，我们目前的研究结果支持通过抑制EMT在高水平使用DETANONOate的潜在抗转移特性。我们进一步证明，DETANONOate介导的NFκB/蜗牛/RKIP电路的调节是NO介导其抗EMT功能的一种新的分子机制。因此，我们确定NFκB/Snail/RKIP串扰是一个关键的信号网络，它不仅干扰肿瘤细胞对凋亡刺激的抵抗32，而且干扰转移级联的启动(图5). 单独或与其他常规化疗药物联合使用NO释放剂抑制蜗牛和恢复RKIP表达的临床相关性和意义，可能与癌症进展和扩散方面的良好临床结果相关。显然，需要进行临床试验来检验NO供体在抑制EMT和转移方面的治疗潜力。

材料和方法

致谢

缩写

脚注

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