乙醛脱氢酶与CD133结合定义血管生成性卵巢癌干细胞，预示患者生存率低下

球体形成

如前所述进行球体培养(8,17). 简言之，FACS隔离ALDH^+/−CD133型^+/−细胞群在无血清MEBM-2（Lonza）超低附着板中一式三份。在随后的传代中，以指示的密度和1000–10000个细胞/ml的细胞进行培养。接种细胞2周后评估球体形成情况。

流式细胞术分析和荧光激活细胞分选（FACS）

对原发性卵巢肿瘤/腹水或细胞系单细胞悬浮液进行计数，并与原发性抗体一起孵育（第补充表1). ALDH公司⁺酶活性根据方案使用ALDEFLOUR试剂盒进行定义（加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华市干细胞技术公司）。对于每个样品，用50 mmol/L二乙氨基苯甲醛（DEAB）处理½个细胞/底物混合物。细胞孵育45分钟。用碘化丙锭（PI）建立门控，排除活性，用ALDEFLOUR/DEAB处理的细胞定义阴性门控。FACS≥1×10⁵使用BD FACSCanto II（Becton Dickinson，San Diego，USA）或FACSAria（Becton-Dickinson）的细胞在无紫外线的低压下使用。

ALDH的耐药性⁺单元格

1×10^第六将SKOV3细胞在DMEM-10%FBS中放置三次过夜。用顺铂（0.1–3μg/ml SICOR制药公司，加利福尼亚州欧文）处理细胞。72小时后，收集细胞，用PI/ALDEFLUOR分析FACS。或者，ALDH⁺和ALDH⁻分离SKOV3细胞，让其恢复约48小时，进行计数，然后将约200000个细胞进行重复电镀。用1.5μg/ml顺铂或培养基单独处理细胞72小时。顺铂治疗后3、7和14天，使用Countess自动细胞计数器（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）测定活细胞数，并绘制成初始细胞输入的百分比。

人类肿瘤异种移植

动物被安置在密歇根大学实验动物医学部，实验方案由大学动物使用和护理委员会批准。将肿瘤细胞进行FACS分离，在PBS:Matrigel（BD Biosciences，San Jose，CA，USA）中重悬（1:2），并皮下植入NOD/SCID/IL-2Rγnull（NOG）小鼠的腋窝(18–20). 除非另有说明，否则当肿瘤最大直径约为0.5-1.0厘米时，对动物实施安乐死。切除肿瘤，称重，并将每个肿瘤的一部分快速冷冻以进行组织学分析。如前所述，将剩余部分加工成单细胞悬浮液。使用LxWxW/2公式计算肿瘤体积。使用学生的T检验比较肿瘤重量。采用方差分析和学生T检验比较肿瘤生长曲线。

用于ALDH的体内连续传代、单细胞悬浮液⁺和ALDH⁻将细胞引发的肿瘤（SKOV3-1000细胞和Hey-1100细胞）分选到ALDH中⁻和ALDH⁺并重新注射到小鼠体内。n=每种分类的细胞亚型4个。共进行了四次传代。

A2780、Ovcar8和PEO4细胞系由Susan Murphy（杜克大学）提供。其他均由Rebecca Liu（密歇根大学）提供。

对于人类肿瘤异种移植物的传代，按照上述方法切除和处理肿瘤。5000 ALDH⁺或ALDH⁻细胞被FACS分离出来，然后按照描述重新植入NOG小鼠。对于ALDH⁺CD133型⁺细胞源性肿瘤，每个ALDH约1000–2000个细胞^+/−CD133型^+/−将种群重新植入NOG小鼠。

免疫组织化学（IHC）和微血管密度评估

新鲜肿瘤在线性生长期（~500 mm）收获^三)嵌入OCT-Compound（Tissue-Tek，CA，USA）中并快速冷冻。如前所述处理7μm冰冻切片(16). 初级抗鼠CD31（1:600）和抗鼠CD105（1:200）(补充表1)在20°C下孵育2小时。按照方案使用Envision系统（Dako）处理幻灯片。在4个独立ALDH的7–11个独立切片上进行CD31和CD105 IHC⁺或ALDH⁻细胞源性肿瘤（Hey-1、SKOV3）或ALDH⁻CD133型⁺、ALDH⁺CD133型⁺、ALDH⁺CD133型⁻或ALDH⁻CD133型⁻细胞源性肿瘤（A2780-DK）。然后如前所述进行微血管密度评估(16). 图像在Olympus BX41（宾夕法尼亚州，美国）荧光显微镜上以16位深度/300dpi使用12MB数码相机拍摄。使用Olympus Microsuite Biological Suite软件评估由像素面积（X:Y 1:1）和色调定义的总染色面积/低倍视野（100X），并使用双侧学生t检验对各组进行比较。

ALDH活性鉴定卵巢肿瘤细胞系中CSC样细胞

根据我们的研究，ALDH是在所有原发性肿瘤标本中表达的唯一潜在干细胞标志物，并在有限的人类原发性肿瘤细胞亚群中检测到（0.25-7.78%，表1). 这表明ALDH可能是卵巢癌中有用的CSC标记物。癌症干细胞的一个拟议特征是化疗耐受性。因此，我们分析了ALDH的百分比⁺增加顺铂剂量治疗后的细胞。虽然活细胞总数有明显的剂量依赖性减少，但我们观察到ALDH的百分比显著增加⁺单元格(图1Ai)，提示ALDH的耐药性⁺细胞和/或顺铂诱导ALDH。接下来我们治疗了FACS分离的ALDH⁺和ALDH⁻含PBS或顺铂的SKOV3细胞。我们观察到PBS处理的ALDH的生长没有差异⁺或ALDH⁻单元格（未显示数据）。顺铂治疗导致两种ALDH的细胞死亡⁺和ALDH⁻细胞细胞群。然而ALDH⁺与ALDH相比，细胞表现出更强的生存能力，并且从顺铂治疗中恢复得更快⁻细胞，提示ALDH的相对耐药性⁺与ALDH对比⁻单元格(图1Aii).

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图1

体外和体内ALDH的生长⁺细胞人卵巢癌细胞系

(艾岛)绝对细胞数和%ALDH⁺用指定浓度的顺铂治疗后的SKOV3细胞。(艾伊)FACS分拣ALDH的存活率⁻和ALDH⁺1.5μg/ml顺铂治疗前和治疗后3、7或14天的细胞。(Bi和ii)100例FACS分离的ALDH的肿瘤生长曲线⁺和ALDH⁻SKOV3和Hey1细胞。(Ci和ii)ALDH的ALDEFLOUR染色⁺和ALDH⁻SKOV3和Hey1肿瘤异种移植与DEAB对照。(D类)来自Hey-1 ALDH的CD105 IHC⁻和ALDH⁺异种移植瘤。(E类)CD31的量化⁺和CD105⁺指示的肿瘤异种移植物中的微血管密度。比例尺指示100μm。所有数据均代表至少2个独立实验（n=5个肿瘤/实验）。*与对照组相比，表示p<0.01。

CSC的一个主要特征是能够用有限数量的细胞引发肿瘤。接下来我们测试了ALDH的致癌能力⁺小鼠的细胞。在3个受试细胞系中（SKOV3、HEY1--图1B和OVCAR8数据未显示），ALDH+细胞生成较大肿瘤的速度明显快于相同数量的ALDH⁻细胞。低至100 ALDH⁺SKOV3或HEY1细胞形成肿瘤，而ALDH数量相似⁻细胞没有或很少分别形成肿瘤(表2). 1000个ALDH的FACS分析⁺与ALDH对比⁻细胞源性肿瘤表明肿瘤来源于ALDH⁺细胞同时具有ALDH⁺和ALDH⁻细胞比例与原始肿瘤细胞系中观察到的细胞比例相同。源自1000 ALDH的肿瘤⁻细胞数量或ALDH减少了10-20倍⁺单元格(图1C). SKOV3和HEY1 ALDH⁺细胞在四个连续传代过程中成功生成肿瘤，而ALDH⁻肿瘤只能通过两次。

最后，据报道CSC具有更强的血管生成能力(29,30). ALDH的免疫组织化学分析⁺衍生肿瘤，与ALDH比较⁻衍生肿瘤显示微血管密度显著增加（2倍）。泛内皮标记物CD31或血管生成内皮标记物CD105都是如此(31) (图1D). ALDH的FACS分析⁺和ALDH⁻细胞源性肿瘤中CD31的数量也有类似的增加⁺和CD105⁺单元格（未显示数据）。综合我们在卵巢癌细胞系中的数据，表明ALDH识别了一组富集CSC表型的细胞；ALDH+细胞是化疗耐药的血管生成细胞，具有显著的肿瘤启动能力。

ALDH公司⁺人卵巢癌细胞诱发小鼠肿瘤

根据我们在细胞系中的发现，我们测试了ALDH的能力⁺从人类肿瘤中分离出的细胞在小鼠体内生成肿瘤；推测人类CSC的最终证据。而50000 ALDH⁻细胞没有生长肿瘤，1000 ALDH⁺2/9原发肿瘤的细胞生成肿瘤(表2). 肿瘤生成大约需要9个月。异种移植瘤的组织学分析显示分化良好的乳头状瘤，与原发肿瘤相同(图2A). 肿瘤异种移植物的FACS分析显示ALDH稳健⁺和ALDH⁻细胞群(图2C). 类似于细胞系研究ALDH⁺细胞源性肿瘤具有高度血管性(图2B). 我们已成功通过ALDH⁺Pt118肿瘤细胞三次分离。这些数据表明，ALDH活性可识别富含CSC活性的卵巢癌细胞群。

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图2

FACS分离的ALDH体内肿瘤生成⁺原代人卵巢上皮肿瘤细胞

(一个)ALDH产生的原发性肿瘤和异种肿瘤的组织学⁺从Pt118肿瘤中分离的细胞。(B类)原发性卵巢ALDH的CD31 IHC分析⁺细胞源性肿瘤异种移植。(C)FACS分析显示来自Pt 118 ALDH的DEAB控制（左）和ALDEFLOUR活性（右）⁺细胞瘤异种移植第二代。

共表达ALDH和CD133的细胞系的致瘤性

在造血系统中，ALDH与CD133联合使用可提高干细胞的鉴定。接下来我们研究了ALDH与CD133在卵巢肿瘤中的作用。FACS证实存在罕见的ALDH⁺CD133型⁺多个细胞系中的细胞(补充表2). 通过对A2780细胞的有限稀释研究，我们观察到两种ALDH的肿瘤起始能力相似⁺CD133型⁺和ALDH⁻CD133型⁺细胞。相反，ALDH⁺CD133型⁻和ALDH⁻CD133型⁻在最低细胞数时，细胞的肿瘤起始能力有限(表3). 有趣的是，ALDH⁻CD133型⁺细胞比ALDH更快生成更大的肿瘤⁺CD133型⁺细胞和ALDH⁺CD133型⁺细胞源性肿瘤明显大于ALDH⁺CD133型⁻和ALDH⁻CD133型⁻细胞瘤(图3A). ALDH公司⁻CD133型⁺和ALDH⁺CD133型⁺与ALDH相比，细胞瘤均显示微血管密度增加⁺CD133型⁻和ALDH⁻CD133型⁻肿瘤(图3B和补充图2). 两个ALDH的FACS分析⁻CD133型⁺和ALDH⁺CD133型⁺细胞源性肿瘤重述了在原代细胞系中观察到的细胞群，产生所有四个CD133^+/−ALDH公司^+/−细胞群。相反，ALDH⁺CD133型⁻或ALDH⁻CD133型⁻异种细胞移植几乎没有或根本没有产生CD133的能力⁺单元格(图3C). 这一观察结果表明ALDH⁺CD133型⁻细胞和ALDH⁻CD133型⁻细胞必须位于CD133的下游⁺在分化途径中表达细胞。OVCAR-8细胞系也获得了类似的结果（数据未显示）。这些研究表明，基于ALDH活性和CD133表达的血管生成性卵巢癌干/祖细胞具有潜在的层次结构。

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图3

ALDH的特征⁺CD133型⁺卵巢肿瘤细胞系和原发性卵巢上皮性肿瘤中CSC细胞的研究

(一个)所示FACS分离的A2780肿瘤细胞群中1000个细胞的肿瘤重量（n=5/组）。(B类)CD31的量化⁺和CD105⁺所示A2780细胞系群体的微血管密度（血管/低倍视野）。(C)显示的A2780异种移植物表达ALDH和ALDH中CD133的FACS分析⁺大门。(迪)FACS隔离ALDH生成的球体^−/+CD133型^+/−来自原发性卵巢肿瘤样本的细胞。显示了球体分析开始时电镀的细胞数。比例尺（左下方）指示100μm。(ii（ii）)来自8名不同患者的指定细胞群中的平均球体形成。(E类)Pt94原发肿瘤和ALDH生成的异种肿瘤的组织学⁺CD133型⁺从Pt94分离。(F类)Pt 94肿瘤的FACS分析，左侧显示DEAB控制，中间显示Pt 94异种移植中的ALDEFLOUR活性，右侧显示CD133的直方图和同型控制*与ALDH相比，表示p<0.05⁺CD133型⁻和ALDH⁻CD133型⁻组，**表示与所有其他组相比p＜0.05。

ALDH公司⁺CD133型⁺人类卵巢癌细胞具有CSC表型，并且在小鼠中诱发肿瘤的能力增强

鉴于这些发现，我们评估了ALDH活性和CD133在原发性人类肿瘤中的表达是否可以改善卵巢CSC的分离。CD133分析⁺原发性人类卵巢肿瘤中有少量细胞同时表达ALDH活性和CD133（约0.1–0.01%，补充表3). 我们使用肿瘤球试验分析原发性ALDH的表型^+/−CD133型^+/−8例患者的细胞群。当分析~5000个细胞时，我们从6/8名患者中观察到ALDH中的球体数量显著增加⁺CD133型⁺细胞群(图3D和补充图3). 在另外两个患者样本中，我们观察到ALDH中优先形成球体⁺CD133型⁻细胞和CD133⁺ALDH公司⁻细胞(补充图3). 当检测100000个细胞时，ALDH−CD133−阴性细胞只能生成球体。这些球体无法通过，表明这些是粘附的细胞簇，而不是真正的球体。

我们接下来测试了体内ALDH的致癌能力^+/−CD133型^+/−人原发性卵巢肿瘤细胞。从9个测试的原发性肿瘤中，我们能够成功地从11、500、500和500 ALDH产生肿瘤⁺CD133型⁺来自四名患者的细胞（分别为Pt 32、Pt55、Pt94和Pt171，表3). 所有四个患者样本均显示ALDH中肿瘤球生成量最大⁺CD133型⁺细胞群(补充图3). 肿瘤生长需要4-7个月。肿瘤不是从类似数量的ALDH中获得的⁻CD133型⁺细胞，5000 ALDH⁺CD133型⁻，或50000 ALDH⁻CD133型⁻从同一肿瘤样本中同时分离出的细胞。

异种移植物的组织学分析显示高度血管化、高级别乳头状细胞癌，与原发肿瘤相一致(图3E和数据未显示）。对这些肿瘤的FACS分析显示，ALDH⁺CD133型⁺细胞能够用ALDH生成肿瘤^+/−CD133型^+/−单元格(图3F). ALDH公司⁺CD133型⁺来自两名患者样本的细胞源性肿瘤已成功传代4次。第三篇目前在第一篇中。这些研究表明，在CD133阳性的人类卵巢肿瘤中，可以通过ALDH和CD133的双重表达来鉴定肿瘤干细胞。

应用ALDH和CD133确定卵巢CSC的分级

在CD133中⁺ALDH和CD133的组合似乎增强了卵巢CSC的分离。只有11个初级人类ALDH⁺CD133型⁺细胞生成肿瘤体内此外，我们观察到ALDH的肿瘤植入率增加⁺CD133型⁺与ALDH相比⁺CD133型⁻细胞。ALDH公司⁺CD133型⁺患者样本和细胞系中的细胞源性肿瘤都能生成所有ALDH^+/−CD133型^+/−细胞群。相比之下，ALDH⁺CD133型⁻患者和细胞系的细胞源性肿瘤均未生成CD133⁺细胞。这意味着CD133⁺细胞是CD133的“上游”⁻潜在分化途径中的细胞。

综合所有观察结果，我们假设卵巢CSC分化的层次模型(图4C). 在该模型中，ALDH⁺CD133型⁺具有自我更新能力的细胞产生ALDH⁺CD133型⁻自我更新能力有限的细胞，最终导致分化的ALDH⁻CD133型⁻细胞。我们认为卵巢CSC可以由任何具有自我更新能力的细胞群体产生。鉴于我们在CD133中观察到一些肿瘤生成⁻ALDH公司⁻我们推测可能存在卵巢CSC/祖细胞缺乏CD133或ALDH的明显表达。或者，这可能是肿瘤细胞系的伪影，或者是由于追踪ALDH⁺CD133型⁺ALDH的细胞污染⁻CD133型⁻细胞。

ALDH和CD133联合用于增强干细胞鉴定与造血系统平行(34–39). 我们的模型与血液恶性肿瘤一致，其中具有自我更新能力的部分分化祖细胞可以表现出干细胞特性(40–42). 这种模型解释了在患者和卵巢癌细胞系中观察到的变异性。其他报道的卵巢CSC标记物的表达，包括CD24、CD44和CD117与ALDH和CD133的关系，尚待确定。考虑到卵巢肿瘤的异质性，可能存在其他不同的干细胞群体。

根据我们的模型，我们可以预测来自早期干细胞的肿瘤（即ALDH⁺CD133型⁺细胞）预示着预后较差，而肿瘤由分化程度较高的细胞（ALDH）衍生的干细胞驱动⁺CD133型⁻)会有更好的结果。在我们的研究中，ALDH的存在⁺CD133型⁺细胞与肿瘤分级、ALDH的存在无关⁺CD133型⁺细胞与不良预后密切相关。与我们的模型一致，卵巢肿瘤胰岛中ALDH表达增加与预后改善有关(43). 然而，ALDH单独作为预后因素的作用是有争议的，一项新的报告表明，ALDHs表达增加表明卵巢癌预后不良(44). 基于CD133共表达的ALDH表达分层可能可以解释这种差异。

ALDH公司⁻CD133型⁺卵巢癌

ALDH的作用⁻CD133型⁺细胞仍然不确定。在原始样本中，ALDH⁻CD133型⁺细胞没有生成大量的球体，也没有生成肿瘤。在细胞系ALDH中⁻CD133型⁺细胞生长速度比ALDH快⁺CD133型⁺细胞，具有与ALDH相似的肿瘤起始能力⁺CD133型⁺低细胞浓度的细胞。ALDH公司⁻CD133型⁺细胞源性肿瘤生成所有ALDH^+/−CD133型^+/−细胞群。ALDEFLOUR分析和保守ALDH的不敏感性⁺门控可以允许ALDH内的ALDH“暗淡”单元⁻CD133型⁺细胞的数量可以解释这些观察结果。然而ALDH⁻CD133型⁺用免疫荧光分析清楚地观察到细胞。ALDH可能⁻CD133型⁺从人类肿瘤中分离的细胞可能无法耐受与FACS分离相关的应激条件。最后，ALDH⁻CD133型⁺从整个肿瘤细胞悬浮液中分离出来的细胞可能主要是非肿瘤细胞，如内皮祖细胞，稀释了ALDH的数量⁻CD133型⁺肿瘤细胞。细胞系研究表明ALDH与⁻CD133型⁺和ALDH⁺CD133型⁺细胞。有必要进行进一步研究以阐明ALDH的作用⁻CD133型⁺细胞。

改善卵巢CSC生长体内

我们的研究首次证明了从原发性卵巢癌直接分离的CSC产生肿瘤异种移植物。然而，从原发性人类卵巢肿瘤中分离出的细胞的肿瘤发生率较低（20-40%）。这可能是FACS诱导的细胞毒性的次要原因。或者，皮下肿瘤接种可能是肿瘤生长的较低位置；只有50%的胶质母细胞瘤干细胞皮下植入，而将这些细胞原位植入颅骨后，植入率为100%(45). 同样，当胰腺癌干细胞注射到胰腺而不是皮下部位时，肿瘤发生率增加(46). 最后，使用“人性化”微环境显著增强了乳腺CSC的植入(27). 因此，未来使用原位CSC注射或人源化卵巢CSC微环境的研究可能会增加植入率。

我们感谢组织采购、流式细胞术和微阵列核心的成员。A2780和OVCAR8细胞系由S.Murphy博士（杜克大学）提供。这项工作得到了Damon Runyon癌症研究基金会临床研究者奖和NIH新研究者创新奖（#00440377）的慷慨支持。