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《公共科学图书馆·病理学》。2009年10月；5（10）：e1000609。
2009年10月9日在线发布。 数字对象标识：10.1371/日志.ppat.1000609
预防性维修识别码：项目经理2752191
PMID：19816569

病毒Bcl-2介导的避免自噬艾滋病慢性感染γ疱疹病毒68

小飞E，#1，2 黄承民（Seungmin Hwang），#三 Soohwan噢，#4 李宗洙，1，4 约瑟夫·H·琼，4 优桑·格瓦克，5 蒂莫西·科瓦利克，2 任荪，三 Jae U.Jung先生，1，4，*和华裔科学家梁澄玉1，4，*
菲利普·史蒂文森，编辑器
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

γ疱疹病毒（γHVs）与宿主发生了相互作用，在这种相互作用中，它们建立了终身持续感染，并与各种恶性肿瘤的发病有关。与小鼠γ疱疹病毒68（γHV68）持续存在有关的一个关键毒力因子是Bcl-2蛋白（vBcl-2）的病毒同源物，它被认为可以对抗宿主的凋亡反应和自噬途径。然而，vBcl-2的两种活性在病毒持续感染中的相对重要性尚未阐明。在这里，通过表征一系列vBcl-2的功能缺失突变体，我们在体外和体内区分了vBcl-2介导的自噬拮抗作用和vBcl-2介导的细胞凋亡抑制作用。缺乏vBcl-2抗自噬活性的突变γHV68病毒表明，在小鼠中维持慢性感染的能力受损，而缺乏vBcl-2抗凋亡活性的突变病毒建立慢性感染的效率与野生型病毒相同，但显示出体外再激活能力受损。因此，vBcl-2介导的宿主自噬拮抗作用构成了γHVs导致持续感染的新机制，进一步强调了自噬作为γ疱疹病毒体内潜伏期的关键宿主决定因素的重要性。

作者摘要

自噬（'自立'，细胞内成分的溶酶体依赖性降解和再循环，以应对应激）和细胞凋亡（'自杀倾向细胞在压力下自杀）是宿主抵抗病毒感染的重要防御机制。γ-疱疹病毒68（γHV68）编码一种Bcl-2家族蛋白vBcl-2，能有效对抗自噬和凋亡，是慢性病毒感染和发病所必需的。然而，vBcl-2介导的逃避自噬和凋亡对γHV68持续感染的相对贡献仍不清楚。在这里，我们对一系列vBcl-2突变体进行了表征，以从基因和功能上区分vBcl_2在体内外的这些密切相关的活性。我们发现，vBcl-2对自噬的抑制对于维持潜伏感染很重要，而vBcl_2的抗凋亡活性在很大程度上与潜伏期病毒的有效再激活有关。因此，我们的研究结果揭示了在慢性病毒感染期间vBcl-2介导的自噬和凋亡回避的新范式，确定了自噬在控制γHV68潜伏感染中的重要作用。

介绍

细胞凋亡和自噬以独特的形态和生化变化为特征，是体内平衡、发育和人类疾病所必需的严格调控过程[1]，[2]一旦受到内部诱导物（如DNA损伤和病毒复制）或外部刺激（如TNF受体的参与）的触发，凋亡就会通过一系列程序化内部蛋白水解消化进行，导致细胞基础结构、线粒体潜能、基因组保真度的崩溃，和细胞膜完整性（有关审查，请参阅[1]，[3]). 因此，细胞凋亡是宿主免疫的一个重要效应器，通过消除病毒感染的细胞，这些细胞的存活可能会对宿主有害[3]与自毁凋亡程序相反，细胞自噬（希腊语中“自立'）允许细胞吞噬细胞质材料，包括长寿命蛋白质或异常细胞器，形成专门的双膜结合囊泡，并将其输送至溶酶体进行降解和周转（有关综述，请参阅[4]，[5]). 尽管自噬最初的特征是细胞对营养剥夺的反应，但人们越来越认识到自噬对于保护细胞抵抗病原体至关重要[6]自噬蛋白Beclin1的神经元过度表达可抵抗Sindbis病毒感染[7]同样贝克林1植物内加剧烟草花叶病毒诱导的超敏反应（HR）[8]除了消化细胞成分外，自噬还可以隔离病毒和细菌成分进行降解[9]，[10]因此，除细胞凋亡外，自噬还构成一种重要的宿主抗病毒反应[10]然而，这两条重要途径在病毒感染过程中的相对贡献和协调仍基本未知。

然而，尽管它们是截然不同的，但凋亡和自噬机制在许多点上汇聚在一起。这两条通路之间的直接串扰部分由Beclin1（一种重要的自噬激活剂）与Bcl-2（一种原型凋亡抑制剂）的功能和物理相互作用介导[11]，[12]细胞Bcl-2最初被发现是B细胞淋巴瘤中的一种致癌蛋白，自那时以来，已鉴定出一些属于Bcl-2家族的蛋白质，每个蛋白质都具有Bcl-2同源域（BH）的特征。Bcl-2家族包括抗凋亡（例如，Bcl-2、Bcl-XL（左）和Bcl-w）和促凋亡（例如Bax、Bak、Bid和Bad）成员，它们通过形成同源或异源二聚体来合作调节细胞对凋亡的承诺[13]抗凋亡Bcl-2蛋白阻止凋亡的一个主要机制是在蛋白表面形成一个延伸的疏水沟槽，作为促凋亡Bcl2家族蛋白的α螺旋BH3结构域的结合囊[14]，[15]除了能够与Bax和BH3-only蛋白等促凋亡家族成员相互作用并抑制其活性外，Bcl-2的疏水口袋还与Beclin1（酵母Atg6的哺乳动物同源物）结合，Beclin 1是启动自噬体膜所需的III类PI3激酶复合体的一部分[16]，[17]事实上，Bcl-2的抗自噬作用密切反映了其结合和抑制Beclin1的能力[12]有趣的是，Beclin1的结构分析表明，它具有一个假定的α-螺旋BH3结构域，这使得Beclin 1可以对接到Bcl-2的疏水囊中。因此，Beclin1最近被认为是一种新型的BH3-唯一蛋白质[18]，[19]尽管目前尚不清楚Bcl-2是如何区分其靶点的，但Bcl-2在细胞凋亡和自噬中的双重作用表明，Bcl-2可能存在协调调节来进行这两种活动[20].

鉴于Bcl-2在细胞生存中的重要作用，许多病毒已进化为编码Bcl-2（vBcl-2s）的结构和功能同源序列，以防止受感染细胞因持续病毒复制和相关疾病而过早死亡[21]，[22]所有测序的γ疱疹病毒（γHV）编码Bcl-2的同源物，包括EB病毒（EBV）、卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）、赛米里疱疹病毒（HVS）和小鼠γ疱疹病毒68（γHV68）[22]，[23]，[24]γHV68的vBcl-2（也称为M11）被认为可以防止酵母中的Bax毒性，并在不同的凋亡刺激物诱导下阻止培养细胞的凋亡[25]，[26]然而，γHV68 vBcl-2对于体内急性感染和体外裂解复制似乎是不必要的，相反，它被证明对于有效的病毒持续复制以及潜伏期的重新激活至关重要，这是所有γHV的特征[25]，[27]三维结构分析表明，γHV68的vBcl-2与Bcl-2的序列相似性有限，但实际上采用了与Bcl-3相似的褶皱[25]，[28]vBcl-2的七螺旋束（α1-7）形成一个球状结构，其中螺旋2、3、4和5定义了一个扩展的疏水表面裂口，允许vBcl_2与BH3结构域，特别是Bak和Bax结构域相结合[25]，[28]BH3-结合沟内的突变破坏了γHV68 vBcl-2与Bax和Bak相互作用的能力，阻止细胞凋亡，并消除vBcl_2在体内持续复制和潜伏期再激活中的功能[25]因此，一般认为vBcl-2在体内主要通过结合和抑制促凋亡Bcl-2家族蛋白发挥作用[25]然而，最近的证据支持γHV的vBcl-2s通过vBcl-2的BH3结合沟直接与Beclin1相互作用，在阻断自噬中发挥中心作用[12]，[19]，[29]此外，与来自促凋亡蛋白（包括BAX、BAK、BIM、PUMA、BID和Noxa）的肽相比，纯化的vBcl-2蛋白与Beclin1衍生肽的结合似乎最紧密[28]与其细胞对应物不同，vBcl-2-Beclin1复合物不易被其他仅BH3-分子取代，如Bid或Bim[15]，[28]因此，vBcl-2表现出比细胞Bcl-2更强的自噬抑制能力[28]，[30]这些发现增加了避免自噬也可能解释vBcl-2在病毒生命周期和/或病理学中的生物效应的可能性。尽管如此，由于vBcl-2的疏水表面沟槽被Beclin1的前自噬BH3结构域和前自溶BH3结构体所结合[28]，到目前为止发现的破坏Beclin1结合和抑制自噬的vBcl-2突变也破坏了其与BH3肽相互作用和抑制凋亡的能力，增加了在γHV68感染中vBcl-2介导的自噬抑制和vBcl-2介导的细胞凋亡拮抗作用的体内遗传学解剖的复杂性。

在本研究中，我们使用功能缺失突变来确定在γHV68感染背景下，vBcl-2介导的抗自噬作用与vBcl-2-介导的抗凋亡作用。我们发现一种Beclin1-binding-deficied vBcl-2突变病毒，其自噬抑制受损，但保留完整的抗凋亡活性，在潜伏期维持方面受到损害，尽管潜伏期的初始病毒建立不受影响。相反，抗凋亡缺陷型vBcl-2突变病毒感染与正常潜伏期负荷有关，但在潜伏期的有效体外再激活中受到很大损害。因此，我们的研究结果表明，自噬在控制病毒感染方面的功能尚不明确。与先前认为抗细胞凋亡在体内具有显著的vBcl-2功能不同，我们的研究表明，逃避自噬介导的宿主先天免疫是γHV68复制和发病机制的关键方面。

结果

酵母中Beclin1相互作用所需的vBcl-2最小区域

Beclin1最初通过酵母双杂交筛选鉴定为Bcl-2的相互作用物[7]Beclin1的N末端区域（残基88–150）的α-螺旋结构模拟了促凋亡Bcl-2家族成员的BH3结构域，使其与vBcl-2表面的疏水BH3结合槽相结合[19]，[28]然而，Beclin1肽(K（K）D类40 nM）与vBcl-2结合的亲和力远高于Bak的亲和力(K（K）D类76 nM）和Bax肽(K（K）D类690毫微米）[28]，增加了Beclin1可能不一定与促凋亡Bcl-2家族成员共享vBcl-2疏水沟的结合位点的可能性。为了剖析vBcl-2与Beclin1结合的特定相互作用域，我们创建了一系列vBcl-2N端和C端缺失突变(图1)，并在基于GAL4的酵母双杂交分析中测试了它们与Beclin1的BH3-样结构域（残基88–150）关联的能力[31]在酵母双杂交分析中，野生型（WT）vBcl-2容易与Beclin1 BH3-样结构域相互作用。相比之下，在BH3结合沟内的Ser85、Gly86和Arg87保守残基处有三重丙氨酸取代的vBcl-2突变体（以下称为vBcl-2AAA）已被证明可以消除vBcl-1的BH3肽结合，但失去了与Beclin1相互作用的能力(图1). 这与之前的观察结果一致，表明vBcl-2的疏水槽对该功能很重要[25]在筛选我们的截断突变体时，我们发现vBcl-2到α7螺旋的C末端截断对Beclin1结合几乎没有影响；然而，进一步截断螺旋α6（例如vBcl-2Δα6/α7/TM突变）严重损害了酵母中Beclin1的相互作用(图1)，表明Beclin1结合的vBcl-2的C端边界位于α6螺旋内，因为不容忍该末端的缺失。特别值得注意的是，仅删除BH2域，这与Bcl-2和Bcl-x中的等效域类似L（左）已经证明可以消除Bax的结合和抑制[32]，[33]，没有阻止vBcl-2在酵母中结合Beclin1(图1). 该数据表明，vBcl-2的BH2区域对于Beclin1相互作用是不必要的。与C末端部分相反，在N末端去除α1螺旋的一小段，会削弱vBcl-2与Beclin1相互作用的能力(图1). 事实上，vBcl-2的N端的任何片段截断都会导致Beclin1结合完全丢失(图1). 因此，我们的结果表明，酵母中Beclin1相互作用所需的最小区域涉及vBcl-2的α螺旋1-6。虽然N末端α1螺旋不是BH3-结合槽内核心疏水α螺旋的一部分，但它似乎对介导酵母中的Beclin1相互作用至关重要。

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酵母双杂交系统中与Beclin1相互作用的野生型（WT）和突变体vBcl-2结构的示意图。

vBcl-2的171-氨基酸序列显示在顶部，α-螺旋结构根据之前的出版物编号[25]。彩色方框表示vBcl-2中的BH 1–4域。“+”：积极互动，“−”：无互动。五十： 连接区；TM：跨膜结构域；三箭头表示vBcl-2 BH1结构域内Ser85-Gly86-Arg87处的丙氨酸替换。

哺乳动物细胞中Beclin1相互作用需要vBcl-2α1螺旋，而不是BH2结构域

接下来，我们在哺乳动物细胞中证实了我们的酵母双杂交结果。293T细胞转染WT或突变形式的vBcl-2和/或V5-tagged Beclin1，然后进行联合免疫沉淀（co-IP）分析。与酵母双杂交结合数据一致，vBcl-2的N末端α1螺旋的缺失取消了Beclin1结合，正如vBcl-2AAA突变体一样(图2A). 结合活性的丧失并非由于蛋白质表达缺陷所致，因为Δα1和AAA vBcl-2突变体在转染细胞中的表达水平与WT相当(图2A). 然而，作为vBcl-2疏水性裂的中心成分之一的α7或BH2的缺失对vBcl-2和Beclin1之间的相互作用没有显著影响，正如C末端疏水性“尾巴”（ΔTM）的缺失突变所示(图2A). 293T细胞内源性Beclin1也观察到类似的结果，即α1螺旋的去除而不是BH2结构域的去除消除了内源性Bellin1结合(图2B). 因此，这些数据表明，虽然BH2区域在结构上对组装vBcl-2表面上的疏水核很重要，但它对vBcl-2-Beclin1相互作用是不必要的，而vBcl-2N端α1螺旋充当Beclin1-相互作用域(图2B). 这些数据与从酵母双杂交试验中收集的数据一致。

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vBcl-2与Beclin1的相互作用。

（A） Beclin1与WT或突变vBcl-2的共免疫沉淀（Co-IP）。用指示的构建物瞬时转染293T细胞，然后免疫沉淀HA标记的vBcl-2和免疫印迹V5标记的Beclin1。（B） WT或突变vBcl-2与内源性Beclin1的Co-IP。用指示的vBcl-2构建物转染293T细胞，然后进行HA标记的vBcl-2免疫沉淀和内源性Beclin1免疫印迹。使用1%全细胞裂解物（WCL）作为输入。（C） vBcl-2与Bak蛋白的相互作用。如图所示，用WT和vBcl-2突变形式转染293T细胞。在转染后48小时，WCL与GST-BakΔTM融合蛋白（左侧面板）或单独与GST（右侧面板）混合，用于体外GST下拉（GST PD）分析。显示了用于下拉分析的GST融合蛋白（底部面板）。1%WCL用作输入。数据代表了至少三个产生类似结果的实验。

虽然N末端α1螺旋缺失先前已被证明不影响Bcl-2家族蛋白的整体折叠[28]，[34]vBcl-2Δα1结构体不能结合Beclin1，这可能反映了蛋白质的正确折叠丢失。为了澄清这一点，我们测试了vBcl-2突变体是否保持与其他BH3域分子结合的能力。在促凋亡Bcl-2蛋白中，Bak在体外对vBcl-2的亲和力最高[28]然后，我们使用细菌纯化的GST-融合Bak蛋白进行体外GST下拉分析，该蛋白与转染有HA标记WT或vBcl-2突变形式的293T细胞的细胞裂解物孵育(图2C). 去除Bak的TM结构域（称为GST-BakΔTM）以增加其在大肠杆菌.与之前的研究一致[25]，[28]，我们观察到Bak能够与vBcl-2的WT和ΔTM突变相关，但与vBcl-2 AAA突变无关(图2C). 在vBcl-2和纯化GST之间未检测到相互作用，表明vBcl-2-Bak相互作用是特异性的(图2C). 值得注意的是，我们发现缺乏Beclin1结合的Δα1突变体保留了其与Bak相互作用的能力，而能够与Beclin 1结合的△BH2突变体未能与Bak交互作用(图2C). 因此，用于Beclin1或Bak结合的vBcl-2突变体的功能丧失表型，尤其是Δα1和ΔBH2突变体，由于突变体vBcl-2-蛋白的错误折叠而不太可能出现，相反，这意味着vBcl-2-与Beclin1-Bak的结合机制涉及vBcl-1疏水槽内的不同接触位点。

抑制Beclin1介导的自噬需要vBcl-2α1螺旋，而不是BH2结构域

Bcl-2与Beclin1的相互作用与其抗自噬活性密切相关[15]然后我们评估了与Beclin1结合的vBcl-2突变体，特别是Δα1和ΔBH2突变体对Beclin1-dependent自噬的影响。生成了稳定表达空载体（NIH3T3.vector）、WT vBcl-2（NIH3A.WT）或vBcl_2突变形式（包括Δα1、AAA、Δα7、ΔBH2和ΔTM突变）的NIH3T_3细胞。为了测量自噬水平，我们首先使用荧光自噬体标记GFP-LC3（酵母Atg8的哺乳动物同源物），在自噬刺激下，它从扩散的胞浆/核染色重新分布到细胞质中的点状模式[35]我们发现，与其共诱导Beclin1的能力一致，vBcl-2ΔBH2、Δα7和ΔTM突变体在营养耗竭和雷帕霉素处理下，与WT一样有效地抑制了这些细胞中的自噬，雷帕霉素是已建立的自噬诱导剂(图3A和3B). 相反，vBcl-2的Δα1突变体和AAA突变体不能与Beclin1相互作用，不能抑制饥饿和雷帕霉素诱导的细胞自噬(图3A和3B). 相应地，在表达WT和ΔBH2突变体的细胞中观察到每个细胞轮廓的自噬体数量显著减少，但在表达Δα1和AAA vBcl-2突变体的电池中没有观察到(图S1A). 然后用抗LC3的抗体进行免疫印迹，以进一步测量vBcl-2表达细胞中的自噬。在自噬体形成过程中，细胞溶质LC3（LC3-I）与磷脂酰乙醇胺（PE）发生共价偶联，生成脂质形式的LC3，LC3-II，显示出较高的电泳迁移率[36]与GFP-LC3点刺试验结果一致(图3A和3B)与表达Δα1-和AAA的细胞相比，在正常和雷帕霉素处理条件下，表达WT和ΔBH2的细胞中LC3从LC3-I到LC3-II的转化大大减少(图3C). 值得注意的是，vBcl-2突变体蛋白在自噬抑制中的不同特征并不是因为它们的蛋白表达不同，因为所有测试的突变体在稳定转染细胞中的表达水平相当于WT vBcl-2(图S1B). 此外，除了vBcl-2的ΔTM突变体表现出适度的核染色外，所有vBcl-2突变体在细胞中都表现出与WT相似的点状细胞质染色(图S1C). 通过类比Bcl-2亲属中等效区域的作用，这种疏水性“尾巴”可能在vBcl-2中充当膜锚定序列。虽然vBcl-2的功能不需要C-末端疏水尾，但它可以通过确保蛋白质的适当亚细胞定位来促进vBcl-2。这些数据共同表明，vBcl-2疏水沟的BH2结构域对抑制Beclin1介导的自噬并不重要，其消除并不影响Beclinl结合，而α1螺旋的消除导致Beclin2结合和自噬抑制活性的丧失，反映了vBcl-2结合Beclin1的能力与其对Beclin1-介导的自噬的保护之间的显著相关性。

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vBcl-2突变蛋白的抗自噬活性。

（A） 用GFP-LC3转染稳定表达WT的NIH3T3细胞和突变型vBcl-2。在转染后18小时，细胞在正常或饥饿条件下培养4小时。自噬被量化为三个独立实验综合结果的平均值±SEM。**，P（P）<0.0001. （B） 用GFP-LC3转染表达野生型或突变型vBcl-2的NIH3T3细胞，并用2µM雷帕霉素处理6小时。使用倒置荧光显微镜检测GFP-LC3（顶部）。自噬被量化为三个独立实验综合结果的平均值±SEM。比例尺，5µm；**，P（P）<0.01. （C） 如图所示，用2µM雷帕霉素处理稳定表达WT或vBcl-2突变形式的NIH3T3细胞。然后用抗LC3抗体的免疫印迹法测定LC3-I和LC3-II水平（顶部）。底部显示了正常和雷帕霉素处理条件下LC3-II/LC3-I比率的密度定量。从三个独立的实验中获得了类似的结果。

为了进一步研究vBcl-2是否抑制病毒感染细胞中Beclin1介导的自噬，我们制备了重组γHV68病毒，该病毒表达HA-tagged WT（简称HA-WT）或vBcl_2的突变形式，包括AAA、Δα1和ΔBH2突变体（分别称为HA-AAA、HA-Δαl和HA-Δ的BH2）使用细菌人工染色体（BAC）系统，从病毒基因组中的正常背景出发（有关详细信息，请参阅材料和方法). 通过限制性内切酶图谱和Southern blot分析确认了所有重组子的基因组完整性(图S1D). 用抗HA抗体和所有重组γHV68病毒对溶血感染的3T3成纤维细胞进行免疫印迹，检测预测分子量为18kDa的vBcl-2蛋白(图S2A). 此外，vBcl-2的基因操作不会影响重组病毒中邻近的v-cyclin（ORF72）的表达(图S2B). 然后用WTγHV68或表达HA标记的WT vBcl-2或其突变衍生物的重组γHV68病毒感染NIH3T3细胞。我们发现，感染表达HA标记的WT vBcl-2的重组γHV68的细胞与感染WTγHV68细胞的自噬水平相当，这表明HA标记并不影响vBcl_2的功能(图4). 值得注意的是，WTγHV68感染的细胞显示出与模拟感染细胞无法区分的自噬水平(图4). 相反，感染Beclin1结合缺陷型vBcl-2突变病毒（γHV68vBcl-2Δα1和γHV68vBcl-2AAA）的3T3细胞显示出明显高于感染WT和ΔBH2突变病毒的细胞的自噬体积累水平(图4). 这些数据表明，γHV68感染可以触发细胞自噬，而vBcl-2通过抑制Beclin1来拮抗这种自噬。综上所述，vBcl-2可有效抑制转染细胞和病毒感染细胞中Beclin1介导的自噬，并且这种活性需要vBcl_2的α1螺旋，而BH2结构域对于vBcl-2-的抗自噬活性是不必要的。

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vBcl-2的Beclin1结合α1螺旋是γHV68感染期间抑制自噬所必需的。

（上）感染指示病毒（MOI）的NIH3T3细胞中GFP-LC3和HA标记的vBcl-2（WT和突变体）的代表性共聚焦图像 = 5). 细胞核用4′，6′-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）复染。比例尺，5µm。（底部）用GFP-LC3点状染色定量病毒感染细胞的百分比。结果所示为三个独立实验（每个实验条件200个细胞）的综合结果的平均值±SEM。*，P（P）<0.01与HA-WT；**，P（P）<0.001与HA-WT。

vBcl-2抗凋亡功能需要BH2区域，而不是α1螺旋

鉴于vBcl-2在细胞凋亡抑制中的关键作用，重要的是要知道结合和抑制Beclin1所需的vBcl_2区域是否同样或不同地需要阻止细胞凋亡。为此，我们比较了WT或vBcl-2突变体赋予细胞凋亡抵抗的能力。在用TNFα和环己酰亚胺（CHX）处理12小时后，稳定表达WT、ΔTM或Beclin1结合缺陷型Δα1 vBcl-2突变体的NIH3T3细胞存活率显著高于表达空载体ΔBH2或AAA vBcl-2突变体的细胞(图5A). TUNEL染色对凋亡细胞的进一步定量显示，BH2结构域的去除导致vBcl-2无法抑制凋亡和凋亡细胞的积聚(图5B). 相反，删除α1螺旋或TM区域并不影响vBcl-2抑制凋亡的能力(图5B). 当我们使用碘化丙啶（PI）染色通过流式细胞术测定被认为是凋亡的亚G1细胞的积累时，获得了相同的结果(图S3). 最后，在稳定表达vBcl-2ΔBH2和AAA突变体的细胞中检测到凋亡早期事件caspase-3的强烈激活，而WT或vBcl_2Δα1突变体的表达显著阻断了TNFα/CHX-(图5C). 这进一步支持了BH2结构域而非α1区域的缺失会严重削弱vBcl-2抑制caspase依赖性凋亡的能力的观点。结合自噬分析数据，这些结果清楚地表明，vBcl-2介导的细胞凋亡抑制在重要方面与其抗自噬活性不同。总结如下表1vBcl-2中阻止Beclin1结合和自噬抑制的α1螺旋的缺失通常对vBcl-2'抗凋亡活性影响不大。相反，去除vBcl-2的BH2区（该区域消除了vBcl_2阻止宿主细胞凋亡的能力）对vBcl-2-介导的抗自噬作用的影响最小。因此，vBcl-2介导的自噬拮抗作用可以在结构和功能上与之前定义的凋亡抑制活性区分开来，从而为评估其在病毒感染期间在体内的功能贡献提供了一般依据。

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vBcl-2突变蛋白的抗凋亡活性。

用TNFα和环己酰亚胺（CHX）处理稳定表达WT或vBcl-2突变形式的NIH3T3细胞12 h，然后用台盼蓝排斥试验（A）检测细胞活力，或用TUNEL染色（B）检测细胞凋亡，或用流式细胞术（C）检测caspase 3激活。在高倍放大（60倍放大）下计数（B）中的凋亡细胞。模拟，未经处理。数据表示三个独立实验的综合结果的平均值±SEM。比例尺，100µm（A），5µm，P（P）<0.0001与载体细胞相比。

表1

vBcl-2突变体的抗自噬和抗凋亡活性概述。
贝克林1贝克反自噬抗凋亡
重量 ++++
Δα1 −+−+
啊啊 −−−−
ΔBH2 +−+−
ΔTM ++++

vBcl-2Δα1和ΔBH2突变体对γHV68裂解复制无影响

为了确定vBcl-2介导的自噬和凋亡抑制在病毒感染过程中的作用，我们首先在BHK21细胞和NIH3T3细胞中检测了表达HA标记WT的重组γHV68病毒的体外生长特性以及vBcl2突变形式与WTγHV68的比较(图6A和S4系列). γHV68 vBcl-2Δα1和ΔBH2突变病毒以及vBcl-2AAA突变病毒在培养细胞中以与WTγHV68相同的动力学生长(图6A和S4系列)，表明vBcl-2介导的自噬和凋亡抑制不需要用于体外溶血复制，这与之前的报道一致，即γHV68不需要vBcl-1在体外复制[25]，[27]，[37]根据其在成纤维细胞中的体外生长，vBcl-2突变型γHV68病毒在感染后5天或7天（dpi）经鼻内感染的BALB/c小鼠肺部的复制水平与WTγHV68相当(图6B，左面板）和实时PCR(图6B，右侧面板）。在γHV68 WT、缺失vBcl-2的γHV68突变体（vBcl-2-null）和表达HA-tagged WT或vBcl-3突变体衍生物的γHV68recombinants之间未检测到统计上的显著差异(图6B). 含有vBcl-2的Δα1或ΔBH2突变的γHV68的独立分离株在肺部正常复制，与重组病毒基因组中其他地方发生偶然突变的可能性相矛盾(图S5A). 这些数据共同支持了vBcl-2介导的抗自噬和抗凋亡在体外和体内病毒裂解复制中的重要作用。

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WT和重组γHV68病毒的体外和体内裂解复制。

（A） WT和重组γHV68病毒在BHK21细胞中的单步（右）和多步（左）生长曲线。（B） 通过受感染小鼠（左）肺部的病毒滴度或病毒基因组DNA的实时PCR（右）测定经鼻感染后，在5 dpi（向上）和7 dpi（向下）的BALB/c小鼠肺部中WT和突变vBcl-2γHV68病毒的急性复制。每组/实验五只小鼠的平均值±SEM。7 dpi的数据来自两个单独的实验。与WT相比，vBcl-2Δα1和ΔBH2突变体在感染病毒滴度方面没有产生显著不同的结果[对于Δα1]，P（P） = 0.82（第5天）；P（P） = 0.08（第7天）；对于ΔBH2，P（P） = 0.49（第5天）；P（P） = 0.54（第7天）；未成对的t吨-以及肺部病毒基因组负荷[Δα1，P（P） = 0.25（第5天）；P（P） = 0.28（第7天）；对于ΔBH2，P（P） = 0.21（第5天）；P（P） = 0.37（第7天）；未成对的t吨-测试]。不另作说明，不重要。

Beclin1结合缺陷型vBcl-2突变病毒在潜伏期维持中受损

急性复制免疫清除后，γHV68在脾细胞、巨噬细胞和树突状细胞中建立潜伏期[38]，[39]，[40]vBcl-2的破坏已表明可以消除γHV68建立潜伏期和/或再激活[25]，[27]为了确定vBcl-2的两种活性（抗自噬和抗凋亡）中的哪一种可能主要负责vBcl_2在体内的功能，我们接下来评估了重组γHV68 vBcl-2-突变体与WTγHV68相比在小鼠中传播慢性感染的能力。用5000 PFU的γHV68 WT或突变体对BALB/c小鼠进行鼻内感染。在感染后12天和14天，当WTγHV68在脾脏中达到其峰值潜伏负荷时，分离脾细胞，并通过前面描述的感染中心分析评估病毒潜伏负荷[41]在所有感染小鼠中均发现病毒驱动的脾脏肿大，但在样本之间未观察到脾细胞数量的显著差异（数据未显示）。vBcl-2突变体的病毒滴度（包括vBcl-2-Δα1、vBcl-2-ΔBH2、vBcl-2AAA和vBcl2-null）与BALB/c小鼠的WT相似(图7A和7B，左）。与感染中心的数据一致，vBcl-2突变病毒在12和14 dpi时显示出与WTγHV68相当的病毒DNA载量峰值，这表明脾脏中潜伏病毒的正常扩增(图7A正确的，​右侧，7B第7页右侧）。对于独立衍生的Δα1和ΔBH2突变病毒也可以进行类似的观察(图S5B). 因此，我们的结果表明，vBcl-2在自噬或凋亡抑制中的功能丧失突变，或两者兼而有之，对脾脏病毒潜伏期的建立没有明显影响，这与早先的发现一致，即γHV68潜伏期的确立不需要vBcl-2[37].

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vBcl-2介导的抑制γHV68体内慢性感染自噬和凋亡的独特作用。

在12 dpi（A，左）、14 dpi（B，左），21 dpi（C，左，在经鼻感染WT或重组γHV68突变体的BALB/c小鼠中，如所示（每组5只小鼠的平均值±SEM/时间点/实验）。14dpi和28dpi的数据分别来自两个和三个单独的实验。所有脾脏样本中的预制感染病毒可忽略不计。与感染中心滴度的WT相比，在12 dpi（A）、14 dpi（B）和21 dpi（C）时，与Δα1和ΔBH2突变病毒相比，没有显著差异[Δ，P（P） = 0.58（第12天）；P（P） = 0.75（第14天）；P（P） = 0.18（第21天）；对于ΔBH2，P（P） = 0.64（第12天）；P（P） = 0.73（第14天）；P（P） = 0.81（第21天）；未成对的t吨-和病毒基因组载量[对于Δα1，P（P） = 0.85（第12天）；P（P） = 0.76（第14天）；P（P） = 0.96（第21天）；对于ΔBH2，P（P） = 0.56（第12天）；P（P） = 0.73（第14天）；P（P） = 0.25（第21天）；未成对的t吨-测试]。在28 dpi（D）、35 dpi（E）和42 dpi（F）时，与WTγHV68相比，vBcl-2突变病毒的感染中心滴度下降（顶部）具有统计学意义[vBcl-2-Δα1 vs.vBcl-2-AAA（42 dpi），P（P） = 0.46; vBcl-2Δα1与WTγHV68（42 dpi），P（P） = 0.08；未成对的t吨-测试]。在28dpi（D）、35dpi（E）和42dpi（F）时，与WTγHV68和vBcl-2ΔBH2突变体相比，vBcl-2Δα1、vBcl-2AAA和vBcl-2无效突变体的病毒DNA载量（底部）降低具有统计学意义，如下所示（未配对t吨-试验）：第28天，vBcl-2Δα1与WTγHV68，P（P）<0.01; vBcl-2AAA与WTγHV68，P（P）<0.01; vBcl-2-null与WTγHV68，P（P）<0.01; vBcl-2Δα1与vBcl-1ΔBH2，P（P）<0.001；vBcl-2AAA与vBcl-2ΔBH2，P（P）<0.001; vBcl-2-零vs.vBcl-2ΔBH2，P（P）<0.001; 第35天，vBcl-2Δα1 vs.WTγHV68，P（P）<0.05; vBcl-2AAA与WTγHV68，P（P）<0.05; vBcl-2Δα1与vBcl-1ΔBH2，P（P）<0.01; vBcl-2AAA与vBcl-2ΔBH2，P（P）<0.05; 在第42天，vBcl-2Δα1与vBcl-1ΔBH2，P（P）<0.001; vBcl-2AAA与vBcl-2ΔBH2，P（P）<0.001; ΔBH2与WTγHV68的比较，P（P） = 0.33. 感染中心*，P（P）<0.05; **,P（P）<0.01; ***,P（P）<0.001.

鉴于vBcl-2在潜伏感染早期缺乏作用，我们扩展了我们的分析，以确定vBcl-2-介导的自噬和/或凋亡是否影响病毒在以后时间点维持脾脏潜伏期。在第21天，WT和vBcl-2突变体γHV68之间的脾脏潜伏期没有显著差异(图7C). 然而，到感染后28天，vBcl-2突变病毒（包括独立衍生的vBcl-2-Δα1和vBcl-2-ΔBH2突变病毒）的滴度与WT相比下降了6到10倍(P（P）<0.001;图7D向上和S5C系列). 值得注意的是，这种缺陷并不是暂时的，而是在感染后35天和42天持续存在，WT和vBcl-2突变γHV68之间的感染中心滴度显著降低，降幅超过10倍，这表示能够在体外重新激活的潜伏病毒的频率降低了约90%。(图7E和7F向上）。这些结果表明，vBcl-2突变病毒在感染后潜伏期的维持方面持续存在缺陷。WT和vBcl-2突变病毒在42 dpi时，潜伏感染的脾细胞明显收缩(图7F向上）。在所有分析的小鼠中，在同等的冻融脾脏样品中未检测到预制的感染病毒（数据未显示）。总之，这些数据表明，尽管vBcl-2突变病毒最初建立的潜伏性水平与WT相当，但在感染缺乏功能性vBcl-2的病毒的小鼠中，潜伏性病毒库在随后的时间点似乎稳步下降。

由于感染中心分析无法区分病毒潜伏负荷的减少与潜伏病毒本身未能重新激活之间的差异，我们通过实时PCR定量了每个脾细胞样本的病毒基因组，以进一步测量病毒潜伏的程度。在重复实验中，与WT病毒相比，vBcl-2Δα1突变病毒的基因组载量在第28天到第42天的时间过程中严重降低，这与后期感染中心滴度降低一致(图7D、7E和7F向下，然后第5天). 事实上，表达抗自噬缺陷vBcl-2的γHV68 vBcl-2-Δα1突变体几乎与AAA和vBcl-2-null突变体病毒一样受损(图7D、7E、7F向下）。病毒基因组载量与感染后后期在体外潜伏的γHV68vBcl-2Δα1再激活频率之间的密切关系证实了γHV68v Bcl-2△α1病毒存在严重的潜伏期缺陷。由于α1螺旋的缺失取消了vBcl-2的抗自噬活性，但保留了其抗凋亡功能，因此，与vBcl-2-Δα1突变病毒感染相关的潜伏期受损表明，vBcl_2的自噬回避在维持脾细胞中γHV68潜伏感染中起着重要作用，而vBcl-2介导的抗凋亡可能不是维持γHV68潜伏期的绝对必要或充分条件。事实上，vBcl-2ΔBH2突变体在抑制细胞凋亡的同时保留Beclin1结合和自噬抑制的完整性，维持了与WT病毒相当的病毒基因组载量(图7D、7E、7F向下和S5D系列)认为ΔBH2突变对病毒潜伏期没有显著影响。然而，与正常的病毒基因组载量和脾细胞数量形成鲜明对比(图S5E)如前所述，在ΔBH2突变病毒感染小鼠中，vBcl-2ΔBH1突变株的感染中心滴度在随后的时间显著低于WTγHV68(图7D、7E和7F向上）。病毒基因组载量和潜伏病毒滴度之间的差异表明，尽管γHV68 vBcl-2ΔBH2突变病毒能够维持WT水平的病毒DNA载量，但在感染后第28天至第42天，它无法有效地从脾脏中的潜伏期重新激活。由于BH2结构域与vBcl-2抑制凋亡而非自噬的能力有关，因此这一结果表明，vBcl2抑制宿主凋亡是从潜伏状态有效地体外再激活所必需的，特别是在感染后的稍后时间点，这与之前的报告一致，即需要γHV68 vBcl-2来重新激活潜伏期[37].

潜伏期维持的病毒能力是建立γHV终身持续感染的先决条件，通常与各种恶性肿瘤相关。因此，我们对vBcl-2突变型γHV68病毒的研究表明，vBcl-2-介导的抗自噬和抗凋亡可能在γHV68持续感染中发挥不同的作用，因为vBcl-2-的自噬回避对维持病毒潜伏期特别重要，而vBcl-2介导的凋亡抑制可能在病毒再激活过程中发挥作用。

讨论

在此，我们提供证据表明，vBcl-2介导的Beclin1结合和自噬抑制对于维持γHV68潜伏感染是必要的，而vBcl-2-拮抗宿主细胞凋亡反应的能力对于从潜伏期体外有效激活病毒是必需的。因此，我们的研究首次表明，vBcl-2诱导的抗自噬和抗凋亡活性在功能和基因上是不同的，也表明避免自噬是γHVs生命周期和/或发病机制中的关键步骤。

抗凋亡Bcl-2蛋白的结构特点是具有疏水表面沟槽，可容纳促凋亡Bcl2家族成员的BH3结构域以及Beclin1的BH3样结构域。Beclin1的BH3样结构域和Bcl-2前凋亡蛋白的BH3结构域的结构比对显示出高度保守的拓扑结构和沟接触位点，尽管总体序列存在差异，因此得出结论Beclin 1是一种假定的BH3唯一蛋白[15]，[18]，[19]然而，Beclin1在体内没有发现明显的凋亡诱导活性[15]此外，我们的研究表明，尽管它们的结构重叠，Beclin1和促凋亡Bcl-2蛋白通过依赖于vBcl-2不同区域的两种离散结合模式与vBcl-2.相互作用。我们表明，从vBcl-2中去除BH2结构域不会影响vBcl-2Beclin1的结合和抑制能力，但会显著抑制其抗凋亡活性。相反，删除α1螺旋并不影响vBcl-2抑制凋亡的能力，但显著削弱其抗自噬活性。因此，我们认为vBcl-2对自噬抑制的作用并不需要抗凋亡功能，反之亦然。与之前的体外vBcl-2-Beclin1相互作用研究相比[19]，我们的体内数据进一步表明，vBcl-2-Beclin-BH3结构域界面外的vBcl-2突变（例如，vBcl-2Δα1）也会影响vBcl-2-Beclin-1结合亲和力，可能是通过改变由BH1、BH2和BH3结构域组成的疏水性裂缝的构象。可以推测，正如前面所述，不仅不同的BH3域在vBcl-2表面凹槽上有不同的结合足迹[19]但当vBcl-2与不同的BH3结构域序列结合时，会发生不同的构象变化。因此，我们的数据，以及最近的发现[19]，[28]为vBcl-2介导的活细胞凋亡和自噬调节的不同作用提供了分子解释。

γHV68vBcl-2是病毒持续复制和潜伏时病毒重新激活所必需的[25]，[27]，[37]; 两种生物活性被描述为：抗凋亡和抗自噬。然而，尚不可能通过实验描述它们对体内vBcl-2整体功能的相对贡献。我们的研究通过构建具有阻断凋亡能力但不能抑制感染细胞自噬的重组突变病毒，使我们能够从遗传学上区分vBcl-2介导的体内自噬阻断和vBcl-2-介导的抗凋亡作用。这种突变病毒在维持病毒潜伏期方面高度减弱，表明vBcl-2介导的抑制宿主细胞凋亡不足以导致持续感染，而是需要vBcl-2-介导的阻断Beclin1依赖性自噬才能有效维持病毒潜伏期，随后重新激活和传输的先决条件。这一发现似乎是史无前例的，因为还没有发现vBcl-2同源物通过干扰宿主自噬机制直接导致病毒潜伏感染。然而，我们的数据并不排除凋亡在维持体内病毒潜伏期方面的重要作用，凋亡可能由其他病毒因子提供，但相反，它们确定了γHV68慢性感染中vBcl-2相关的自噬缺陷。与γHV68 vBcl-2类似，KSHV编码的vBcl-2比细胞Bcl-2更能靶向Beclin1依赖的自噬[12]，[30]鉴于其与细胞Bcl-2家族成员的整体氨基酸同源性较差，自噬抑制机制的保存有力地支持了这样一种观点，即干扰宿主自噬机制可能代表了这些病毒以及其他持久性γHV共同的潜在感染的共同策略。尽管如此，我们观察到的vBcl-2突变型γHV68病毒潜伏期受损可能不仅仅是由于vBcl-2-的抗自噬活性被禁用，而是其他尚未明确的机制。未来对缺乏功能性自噬基因的小鼠病毒复制和发病机制的研究将有助于解决这种偶然性。

值得注意的是，之前的两项研究也证明了vBcl-2在γHV68慢性感染中的功能作用，但结果略有不同[37]与我们的发现相反，vBcl-2是有效维持γHV68潜伏期所必需的，Gangappa等。在vBcl-2突变体的脾潜伏期中未观察到明显缺陷[37]如前所述[27]，[42]，这种差异可能是由于使用了不同的病毒给药途径：Gangappa腹膜内接种等。与我们研究中的鼻内接种相比。另一方面，德利马等。在感染后第14天，在缺乏功能性vBcl-2的情况下，观察到γHV68脾潜伏期的初始建立效率降低，随后在感染后6个月恢复[27]然而，在我们对vBcl-2突变病毒的研究中，潜伏期缺陷直到感染后4～6周才被检测到，在此期间，明显观察到潜伏感染的脾细胞收缩。这些数据与我们的发现之间差异的基础尚不清楚。高剂量接种（2×104德利马使用的PFU等可能会在肺部引发更强的促炎反应，这可能会影响脾脏中最初的病毒接种和扩增。或者，vBcl-2可以执行除抗凋亡和抗自噬之外的其他活动，这些活动有助于γHV68的慢性感染。尽管在不同的实验环境中显示出差异，但感染γHV68 vBcl-2突变株后潜伏期缺乏绝对消融，这表明γHV68持续存在的复杂性，涉及多种病毒因子和细胞过程。然而，我们对vBcl-2在维持脾脏潜伏期中的作用，特别是其抗自噬功能的研究，突显了γHV68感染期间自噬的重要性。

尽管vBcl-2主要在γHV68裂解周期中表达，并且在细胞培养和转基因模型中有效阻止凋亡[25]，[26]，[37]γHV68 vBcl-2对于急性感染中细胞凋亡的初始回避是必不可少的，Gangappa也证明了这一点等。和德利马等。 [27]，[37]在这方面，人们预计其他抗凋亡裂解γHV68基因也参与了γHV68感染的急性期。的确，冯最近的工作等。 [43]表明γHV68编码一种线粒体相关抗凋亡蛋白（vMAP），该蛋白有效拮抗细胞凋亡，是γHV68在细胞培养中裂解复制所必需的。然后，测试vMAP是否也能对抗宿主的自噬反应，以及自噬是否参与γHV68的急性感染，将是很有意义的。另一方面，vBcl-2在潜伏感染晚期和潜伏期的体外再激活中的优先作用强烈暗示其表达可能会一直持续到潜伏感染[27]，[37]在潜在感染的细胞和/或组织中检测到vBcl-2转录物，尽管其丰度较低，这一观点得到了加强[41]，[44]，[45]，[46]然而，需要注意的是，由于编码vBcl-2的M11基因插入在v-cyclin基因和LANA/ORF73之间的相反方向，其转录物与ORF73重叠，因此vBcl-2RT-PCR信号可能对应于编码在相反链上的ORF73 mRNA。由于该区域转录的复杂性，链特异性转录图谱对于阐明小鼠病毒感染不同阶段vBcl-2的表达谱可能是必要的。

虽然vBcl-2对溶血复制来说是不必要的，但之前已经表明它是体外再激活所必需的[25]，[37]我们进一步扩展了这一观点，表明vBcl-2的活化效率与其抗凋亡能力相关，而非抗自噬作用。我们发现，一株γHV68突变株在vBcl-2的凋亡抑制活性方面受到特异性损害，同时仍能抑制自噬，表现出正常水平的脾脏潜伏期，但对潜伏感染细胞的病毒体外再激活效率很低，表明vBcl-2逃避凋亡在病毒潜伏期的再激活过程中尤为重要。值得注意的是，这种与ΔBH2突变相关的病毒表型在第28天的第28天出现，但在潜伏期的早期没有出现。这意味着病毒潜伏期的维持代表了γHVs感染的基因不同阶段，并涉及不同的病毒和/或宿主因素。在这种情况下，可能需要γHV68和/或宿主蛋白的额外凋亡抑制剂，或至少直接参与潜伏期早期的体外再激活，以补偿vBcl-2的抗凋亡作用。因此，我们的研究并没有排除细胞凋亡调节对潜伏期早期体外再激活的重要性，而是发现了潜伏期维持中vBcl-2相关的缺陷。这种缺陷可能也会降低γHV68的毒力。此外，有人提出，移植的小鼠B细胞活性差可能会影响体外再激活的效率。因此，BH2结构域的去除可能会降低vBcl-2的抗凋亡特性，从而影响移植的B细胞的存活，从而间接影响病毒体外复活的效率。然而，这种可能性并没有在病毒潜伏期的早期时间点表现出来，这表明，培养中潜伏感染的B细胞的存活在决定γHV68 vBcl-2ΔBH2突变体的表型方面并不起关键作用，而vBcl-2-介导的宿主凋亡抑制可能更直接地参与γHV68的活化程序。然而，我们对潜伏期维持和再激活过程中vBcl-2需求的研究与潜在感染组织中vBcl-2的表达一致[45]它还指出了vBcl-2突变体在细胞凋亡和自噬方面对病毒感染不同阶段的独特保护作用，以及它们对γHV68持续性和/或发病机制的协同作用。

γHVs与宿主形成了一种独特的相互作用模式，在这种模式下，它们建立了终身潜伏期，并可能在宿主的整个生命周期中被重新激活，这与各种恶性肿瘤的发病有关。虽然尚不完全清楚是什么因素控制潜伏期的建立和维持，但我们的研究清楚地表明，脾细胞中持续的γHV68潜伏期需要vBcl-2介导的抑制宿主自噬机制。但是，自噬是如何起作用的以及其作用的原因尚不清楚。鉴于自噬对宿主细胞细胞质成分的质量控制具有重要作用，最简单的是，自噬诱导可能会促进维持潜伏期所必需的胞浆病毒蛋白的降解。或者，病毒潜伏抗原的“自噬消化”可能促进其MHC II类表达和细胞毒性T细胞（CTL）识别，最近以EBNA1病毒核抗原1为例[47]此外，自噬可能有助于向含有TLR的内体传递“病毒信号”，从而刺激IFNα的产生，这已被证明对控制急性γHV68感染和潜伏期很重要[48]，[49]，[50]，[51]也有可能，当Beclin1被vBcl-2抑制时诱导的自噬可以触发潜伏感染细胞的细胞死亡，这种情况得到了不能与Bcl-2结合的Beclin 1突变体诱导半胱氨酸蛋白酶非依赖性自噬细胞死亡这一事实的支持[12]如HSV-1所述，自噬可促进宿主细胞内复制病毒的隔离和消化[52]，[53]也可以为限制γHV68持续感染提供一个有吸引力的解释，但缺少直接证据。虽然目前尚不清楚自噬通过何种机制限制病毒的持续性，但这些机制都不是相互排斥的，自噬功能可能会产生其他与激活宿主对γHV68的免疫应答和潜伏期有关的后果。进一步研究vBcl-2介导的自噬抑制所涉及的分子细节，将扩大我们对自噬和γHV相关发病机制的理解，并揭示抗病毒治疗的新靶点。

总之，我们描述了潜伏病毒感染中病毒逃避自噬的关键作用。除了已建立的抗凋亡功能外，vBcl-2以宿主自噬效应蛋白Beclin1为靶点，vBcl-2的这种活性对病毒维持潜伏期至关重要。因此，我们的研究结果表明，vBcl-2靶向的两种宿主固有免疫途径，即自噬和凋亡，实际上在预防病毒感染方面发挥了迄今为止意想不到的独特作用。未来的研究将旨在详细分析有助于控制γHV感染的自噬分子机制。

材料和方法

老鼠

所有小鼠的处理均按照南加州大学（USC）和洛杉矶加州大学动物研究委员会的指南进行。本文中使用的所有方法也已获得南加州大学动物研究委员会的批准。BALB/c小鼠取自Charles River Laboratories，Inc.（马萨诸塞州威明顿）。所有小鼠（～6周龄，n = 每个池5～8只）在短暂的氟烷麻醉下用5000个γHV68病毒斑块形成单位（PFU）鼻内感染，并在感染后5天和7天处死受感染的小鼠，以测量肺部的急性感染，或在12dpi、14dpi、21dpi、28dpi、35dpi和42dpi时处死受感染的小鼠，以测量脾脏中的病毒潜伏载量。

细胞培养和病毒

NIH3T3、BHK21和293T细胞在添加10%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素（Gibco-BRL）的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）中培养。使用Fugene 6（Roche）、Lipofectanine 2000（Invitrogen）或磷酸钙（Clontech）进行瞬时转染。使用2µg/ml嘌呤霉素（Sigma-Aldrich）的标准选择方案建立NIH3T3稳定细胞系。野生型（WT）γHV68病毒[54]，其突变衍生物均在BHK21细胞中进行体外研究，在NIH3T12细胞中进行体内研究。

质粒构建

从S11基因组DNA中扩增出与γHV68 vBcl-2编码序列相对应的DNA片段。然后，将PCR-扩增的vBcl-2 DNA克隆到编码N末端HA标签（pEF-HA-vBcl_2）的改良pEF-IRES-puro载体（Invitrogen）中。vBcl-2基因的突变是通过PCR（Hi-Fidelity PCR kit，Roche）和寡核苷酸定向突变产生的。具体而言，使用特异性引物从pEF-HA-vBcl-2载体中扩增出vBcl-2-Δα1（缺少N端21个残基）和ΔTM（缺少C端20个残基；vBcl-2ΔBH2（缺少BH2结构域的残基129-144）和Δα7（缺少残基130–134（NHFPL））突变体通过两步PCR突变产生。使用Quickchange定点突变试剂盒（Stratagene）创建了在Ser85-Gly86-Arg87残基上具有丙氨酸取代的HA-vBcl-2 AAA突变体。所有带有指示vBcl-2突变的PCR产物随后在框架中克隆到Xho公司我/Mlu公司pEF-IRES-puro载体的I位点，用于瞬时和稳定表达。所有突变构建体都被完全测序，以确保所需突变的存在和二次突变的缺失。表达HA标记的Bcl-2家族蛋白的构建物由J.Marie Hardwick（约翰·霍普金斯大学）提供。Beclin1-V5质粒已在前面描述过[29]为了进行酵母双杂交分析，将vBcl-2及其突变衍生物克隆到生态RI公司/巴姆酵母质粒pGBKT7（Clontech）的HI位点，携带酿酒酵母TRP1基因作为选择标记。Beclin1的BH3-样结构域（残基88-150）被亚克隆到生态RI公司/Xho公司pGADT7载体（Clontech）的I位点，包含低浓缩铀选择标记。从中制备Bak的GST融合蛋白（GST-BakΔTM）大肠杆菌，将Bak cDNA的PCR产物（C末端TM区域缺失）亚克隆到生态RI公司/Xho公司pGEX4T-1的I位点。使用ABI PRISM 377自动DNA测序仪对所有构建物进行测序。

病毒诱变

为了制备γHV68的特异性突变体（即HA-WT、HA-Δα1、HA-△BH2和HA-AAA），利用GS1783中的γHV68细菌人工染色体（BAC）克隆，进行了两步噬菌体lambda Red介导的同源重组方法大肠杆菌含有阿拉伯糖诱导型I-SceI基因的菌株，由西北大学医学院G.Smith提供），如前所述[55]简而言之，PCR用于生成含有卡那霉素抗性（KanR（右）)带有突变vBcl-2基因的基因。然后通过同源重组将卡那霉素盒插入到γHV68 BAC克隆中，并通过I-SceI删除卡那霉素抗性基因实现无标记突变。通过DNA测序确认BAC DNA的后续突变，并通过限制性内切酶消化和southern blot分析研究突变的BAC MHV-68的基因组完整性，如前所述[54]vBcl-2-全BAC是通过标记转座子的体外MuA转座产生的[54]通过转染BAC DNA和Cre公司使用Lipofectamine Plus试剂（Invitrogen）将去除BAC载体序列的重组酶表达质粒转入NIH3T12细胞。通过限制稀释将产生的病毒纯化为单个克隆，然后在NIH3T12细胞中扩增。使用覆盖有1%甲基纤维素的单层Vero细胞，通过菌斑试验对纯化的病毒库进行窃笑。感染后5天，细胞固定并用2%结晶紫和20%乙醇染色。然后对菌斑进行计数，以确定感染滴度。

酵母双杂交分析

为了分析Beclin1和vBcl-2突变体之间的相互作用，用表达Beclin 1 BH3样结构域与pGADT7质粒中Gal4活化结构域融合的酵母菌株AH109转化含有vBcl_2突变体的pGBKT7质粒，然后检测转化子的α-半乳糖苷酶活性，如前所述[56].

自噬分析

在表达WT或vBcl-2突变形式的NIH3T3稳定细胞中进行定量GFP-LC3光镜自噬分析，然后转染GFP-LC3-表达质粒[35]然后通过饥饿或雷帕霉素处理诱导自噬。为了饥饿，用PBS清洗细胞三次，并在37°C的Hank溶液（Invitrogen）中培养4小时。或者，在含有1%FBS和2µM雷帕霉素（Sigma-Aldrich）的DMEM中培养细胞6小时。如前所述，通过免疫印迹检测LC3迁移率变化[29]对于病毒感染期间的自噬水平，将GFP-LC3转染NIH3T3细胞，然后在MOI为5时感染重组γHV68 WT或突变病毒，并在感染后18 h固定。

细胞凋亡分析

将稳定表达WT或vBcl-2突变形式的NIH3T3细胞接种于1×106将每孔细胞放入6孔板中24 h。然后用含有2 ng/ml肿瘤坏死因子α（TNFα）和1µg/ml环己酰亚胺（CHX）的新鲜培养基处理细胞12 h。对于细胞活力测定，用台盼蓝染色以排除染料。为了分析凋亡细胞，使用DEADEND™（死亡™）荧光TUNEL系统套件（Promega）符合制造商的说明。细胞核用4，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）复染。使用奥林巴斯IX-70显微镜进行荧光显微镜分析。根据DAPI染色细胞核的数量确定TUNEL阳性细胞的百分比。对于PI染色分析，用细胞分离缓冲液（Sigma-Aldrich）收集细胞，然后在−20°C下用70%乙醇固定过夜。用PBS洗涤固定细胞两次，并在室温下在含有丙啶（PI；5µg/ml）、RNase A（1 mg/ml）和Triton X-100（0.5%）的PBS中培养30分钟。使用FACScan流式细胞仪测量丙啶-DNA复合物发出的荧光。含有亚二倍体DNA的细胞被认为是凋亡细胞。使用Cell Quest（BD Bioscience）对数据进行分析。对于caspase-3活性测定，处理后采集细胞，用PBS洗涤三次，并用固定介质（Invitrogen，目录#GAS001S）固定15分钟，用渗透介质（Invistrogen）渗透15分钟，然后用PE结合的抗Caspase3活性形式（BD biosciences#550821）染色进行流式细胞术分析。数据通过FlowJo-6.4进行分析。对于病毒感染期间的凋亡水平，NIH3T3细胞在MOI为5的情况下感染重组γHV68 WT或突变病毒，并通过TUNEL染色和如上所述的细胞核反染来评估凋亡。

增长曲线

BHK21细胞和NIH3T3细胞接种于2×105感染多重性（MOI）为5.0或1×10时的单步生长曲线，每孔细胞数为6孔板5MOI为0.1的多步骤生长曲线的每孔细胞数。在感染后的不同时间点采集样本，进行三次冻融循环，然后按照前面描述的方法通过菌斑试验进行三次滴度测定[37].

肺部滴度和感染中心测定

为了测定受感染肺部的病毒滴度，将肺部均匀放入1 ml DMEM中，并通过三种独立的菌斑分析测定匀浆上清液中的感染病毒。对于感染中心分析（用于测量能够从潜在感染的B细胞中重新激活的潜伏病毒的数量），从受感染的脾脏制备脾细胞的单细胞悬浮液，并与覆盖有1%甲基纤维素的单层Vero细胞共同培养。将Vero细胞进一步培养5天，然后固定并用2%结晶紫在20%乙醇中染色。然后对菌斑进行计数，以确定感染中心[57].在预成型病毒检测中，大多数样品没有产生斑块，少数样品每～10个显示1至2个斑块7脾细胞。

病毒基因组的量化

如前所述，为了量化感染细胞/组织的病毒基因组载量，制备感染器官的总基因组DNA并进行实时定量PCR[54]简单地说，根据制造商的说明，使用DNeasy Tissue Kit（加利福尼亚州瓦伦尼亚QIAGEN）从受感染的肺或脾组织中提取总基因组DNA。γHV68 ORF56特异性引物（正向引物：5′-GTAACTCGCAGACTGAACCTCGCAGAGTCC-3′; 反向底漆：5′-CCGAAGCTTGCACGGTGCAATGTGTCACAG-3′)用于分析。将DNA模板与2×Master mix（Biorad iQ™SYBR®Green Supermix）混合，在95°C下进行PCR，15′和45个循环，95°C为30〃，60°C为30〃，72°C为30m，然后进行熔融曲线分析。对每个样本重复分析100–500 ng的DNA，并与含有γHV68基因组的BAC质粒的标准曲线进行比较，用未感染的细胞DNA连续稀释并平行扩增。使用Opticon II（MJ Research）进行放大和检测。琼脂糖凝胶电泳证实了扩增产物的特异性。

在DNA Engine Opticon®2连续荧光检测系统（MJ Research，Incorporated，Waltham，MA）上使用SYBR GreenER™qPCR试剂盒（Qiagen）对v-cyclin转录物进行定量分析。使用Trizol（Invitrogen）从感染细胞中提取总RNA，并使用cDNA合成试剂盒（Invit罗gen）将100 ng纯化总RNA反向转录到cDNA。根据制造商的建议设置PCR反应。简言之，在95°C下变性最初5分钟后，在94°C下进行45〃、57°C下1′和72°C下1'的热循环，共40个循环，然后进行熔融曲线分析。用每个样品中定量的β-肌动蛋白对RNA量进行标准化。扩增orf72的引物组为：正向，5′-GGAGCAACAACACTCTGACAA-3′; 反向，5′-GTGATAGCACTGGGCGTTT-3′β-肌动蛋白的引物组为：正向，5′-CGAGGCCCAGAGAAGAG-3′; 反向，5′-CGGTTGGCCTTAGGGTTCAG-3′定量实验至少进行了三次，包括每次无模板对照。通过琼脂糖凝胶电泳确认扩增产物的大小。

免疫印迹、免疫沉淀和GST下拉

对于免疫印迹，多肽通过SDS-PAGE溶解并转移到PVDF膜（Bio-Rad）上。用5%的非脂肪乳封闭膜，并用指示的抗体进行探测。山羊抗体与鼠或兔免疫球蛋白特异性辣根过氧化物酶偶联，用作次级抗体（稀释1∶10000，Sigma-Aldrich）。免疫检测用化学发光试剂（Pierce）实现，并用富士荧光成像仪（BAS-1500；富士胶片公司，日本东京）检测。

为了进行免疫沉淀，收集细胞，然后在添加了完整蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche）的1%NP40裂解缓冲液中进行裂解。在4°C下用蛋白A/G琼脂糖珠预先清除1 h后，使用全细胞裂解物与所示抗体进行免疫沉淀。通常，将1–4µg商业抗体添加到1 ml细胞裂解液中，然后在4°C下培养8–12 h。添加蛋白A/g琼脂糖珠后，再继续培养2 h。用NP40裂解缓冲液广泛清洗免疫沉淀物，并用SDS-PAGE加载缓冲液煮沸5分钟洗脱。

对于体外GST下拉分析，GST自身或GST-BakΔTM融合蛋白从大肠杆菌菌株BL21（DE3）（Promega）。将293T细胞裂解物与含有GST融合蛋白的谷胱甘肽珠在结合缓冲液（20 mM HEPES[pH7.4]、100 mM NaCl、1%NP-40和蛋白酶抑制剂）中在4°C下培养2 h。然后用结合缓冲液将谷胱甘肽小球洗涤四次，用SDS-PAGE分析与小球相关的蛋白质，并用荧光成像仪进行免疫印迹分析。

免疫荧光和共焦激光扫描显微镜

用2%（w/v）多聚甲醛在PBS中固定20 min，用0.2%（v/v）Triton X-100渗透15 min，用10%山羊血清（Gibco-BRL）封闭1 h。在室温下，用1%山羊血清中的抗血清或纯化抗体进行一级抗体染色。然后用PBS广泛清洗细胞，并用稀释的次级抗体在1%山羊血清中孵育1小时。使用Vectashield（Vector Laboratories，Inc.）安装细胞。共聚焦图像是使用装有100×Leica物镜（PL APO，1.4NA）和Leica图像软件的Leica TCS SP激光扫描显微镜（Leica Microsystems，PA）获得的。

统计分析

使用未配对数据进行统计分析t吨-测试。除非另有说明，否则数值表示为至少三个独立实验的平均值±SEM。A类P（P）≤0.05的值被认为具有统计学意义。

支持信息

图S1

（A） 用GFP-LC3转染稳定表达WT或vBcl-2突变形式的NIH3T3细胞，然后在正常或饥饿条件下培养4h。用荧光显微镜计数每个细胞中GFP-LC3-阳性点的数量。数据表示三个独立实验的综合结果的平均值±SEM。**，P（P）<0.0001. （B） 使用抗HA抗体通过免疫印迹法测定NIH3T3细胞中WT和突变vBcl-2蛋白的表达。β-actin作为负荷对照。（C） vBcl-2 WT及其突变体在NIH3T3细胞中的细胞内定位。固定稳定表达HA标记的WT vBcl-2及其突变体的NIH3T3细胞，并通过共焦显微镜下抗HA抗体染色确定vBcl_2蛋白的定位。比例尺，5µm。（D） 野生型（wt）γHV68和vBcl-2突变体的限制性酶消化模式（顶部）和Southern blot分析（底部）。制备了wt和突变体的细菌人工染色体（BAC）DNA，并用巴姆H我，经济效益一、 或后面的三、 用1%琼脂糖凝胶电泳分离消化后的DNA。M： 1 Kb DNA梯（Invitrogen）；WT：野生型γHV68；空：通过transpon插入的vBcl-2空突变体。星号（*）表示vBcl-2AAA突变中40-bp重复序列的异质性，该突变通常出现在我们的BAC系统中，但不影响病毒在体内外的复制[57].将酶消化的DNA转移到硝化纤维素膜上，并与32M11基因和转座子的P标记探针。的预期大小（bp）巴姆HI消化物：wtγHV685249bp；空突变，3473、2060和1033bp；HA-WTγHV68，5288 kb；HA-vBcl-2AAA突变体，5288 bp；HA-vBcl-2Δα1突变体，5228 bp；HA-vBcl-2ΔBH2突变体，5240 bp。的预期大小（bp）生态RI消化：wtγHV68，5186 bp和3147 bp；空突变，4881、3147和1622 bp；HA-WTγHV68，5225 bp和3147 bp；HA-vBcl-2AAA突变体，5225 bp和3147 bp；HA-vBcl-2Δα1突变体，5165 bp和3147 bp；HA-vBcl-2ΔBH2突变体，5177 bp和3147 bp。的预期大小（bp）后面的III消化道：wtγHV68，8357 bp和2882 bp；空突变，84012882和1273bp；HA-WTγHV68、8396bp和2882bp；HA-vBcl-2AAA突变体，8396 bp和2882 bp；HA-vBcl-2Δα1突变体，8336 bp和2882 bp；HA-vBcl-2ΔBH2突变体，8348 bp和2882 bp。3147 bp和2882 bp带生态RI和后面的III消化物来源于与M11基因探针杂交的BAC载体片段，因为探针是通过随机六聚体标记含有vBcl-2基因的质粒生成的。

（5.19 MB畅通节能法）

图S2

（A） 免疫印迹分析感染WTγHV68病毒（第1道）、表达HA标记WT vBcl-2（第2道）、Δα1（第3道）、AAA（第4道）或ΔBH2（第5道）突变体的NIH3T3细胞中vBcl_2的表达。β-actin作为负荷对照。（B） 培养中重组γHV68感染细胞中v-cyclin的转录。NIH3T3细胞被表达所示vBcl-2结构的WT或重组γHV68病毒感染。从感染细胞中提取总RNA，并用实时RT-PCR（底部）定量β-肌动蛋白标准化的v-cyclin表达，反应产物在2%琼脂糖凝胶中电泳（顶部）。阴性对照（阴性ct）表示模拟感染NIH3T3细胞的反应。样品一式三份，数据代表三个独立实验。

（4.43 MB TIF）

图S3

vBcl-2突变蛋白的抗凋亡活性。用TNFα和环己酰亚胺（CHX）处理稳定表达WT或vBcl-2突变形式的NIH3T3细胞12 h，然后进行PI染色检测，然后进行流式细胞术分析。细胞凋亡被量化为三个独立实验综合结果的平均值±SEM。PI，碘化丙啶。

（230万桶/日）

图S4

WT和重组γHV68病毒在NIH3T3细胞中的单步（底部）和多步（向上）生长曲线。

（2.02 MB TIF）

图S5

（A，B，C，D）BALB/C小鼠经鼻感染WT病毒，WT病毒是Δα1（Δα1-IND）突变体或ΔBH2（ΔBH2-IND）突变γHV68的独立分离物。然后通过实时PCR在肺部的7 dpi（A）、脾脏的14 dpi（B）和28 dpi（D）下测量病毒基因组负荷。脾脏感染中心（C）也在28 dpi时测量。数值为平均值±SEM。不另作说明，不重要。*，P（P）<0.05; **,P（P）<0.01; ***,P（P）<0.001. （E） 28 dpi时WT或突变vBcl-2γHV68感染小鼠的脾细胞数量。

（4.95 MB TIF）

致谢

我们感谢B.Levine、M.J.Hardwick、S.Virgin、S.Field、T.Yoshimori和Y.Ohsumi博士提供试剂，感谢Z.Toth博士提供实时PCR，感谢Michelle Connole提供FACS分析。最后，我们感谢所有实验室成员的支持和讨论。

脚注

提交人声明，不存在相互竞争的利益。

这项工作得到了美国公共卫生署拨款CA082057、AI073099、CA31363（JUJ）和AI083841（CL）的支持；KICOS/KMEST全球研究计划（JUJ和BHO；批准号：K20815000001）；Hasting基金会（JUJ）和Robert E.和May R.Wright基金会（CL）。XE获得了Ruth L.Kirschstein国家研究服务奖，CL是白血病和淋巴瘤协会会员。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

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文章来自多囊卵巢综合征病原体由以下人员提供多环芳烃