自然细胞生物学。作者手稿；PMC 2009年6月1日提供。
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APC/C通过将Cdc20作为销毁目标来维护主轴组件检查点
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摘要
纺锤组件检查点（SAC）需要阻止姐妹染色单体分离，直到所有染色体都正确连接到有丝分裂器。SAC通过后期促进复合物/环体（APC/C）泛素连接酶抑制细胞周期蛋白B1和安全蛋白的泛素化来防止细胞进入后期。SAC的目标是必需的APC/C激活剂Cdc20。尚不清楚SAC如何使Cdc20失活，但目前的模型大多涉及Cdc20与Mad2检查点蛋白形成稳定的复合物。这里我们表明，大多数Cdc20与Mad2不在一个复合体中；相反，Cdc20需要Mad2与另一个检查点蛋白BubR1形成复合物。我们进一步表明，在SAC过程中，APC/C泛素化Cdc20以使其降解。因此，人Cdc20的泛素化并不需要将其从检查点复合体中释放出来，而是需要将其降解以维持有丝分裂阻滞。
介绍
有丝分裂的正确控制取决于泛素介导的关键调节因子在正确时间的蛋白水解1至关重要的是，在所有染色体正确连接到纺锤体上之前，维持细胞有丝分裂的后期抑制剂securin和细胞周期蛋白B1不得降解。为了实现这一点，一种被称为“纺锤检查点”（SAC）的保守机制被不正确连接的动粒激活，并阻止APC/C泛素连接酶识别细胞周期蛋白B1和安全蛋白（在2). 许多保守蛋白被鉴定为SAC的成分，包括Mad1、Mad2、Mad3/BubR1、Bub1、Bub3、Mps1和Aurora B激酶。SAC的主要靶点是Cdc20/泡沫蛋白三，4这是一种重要的APC/C激活剂（参见5). 然而，尚不清楚SAC如何监管Cdc20。目前的检查点模型表明，Mad2蛋白在隔离Cdc20或与BubR1和Bub3蛋白结合形成抑制剂“有丝分裂检查点复合物”（MCC）方面起着关键作用2Mad2-Cdc20复合物的显著性是可以理解的，因为与Cdc20模拟肽结合的Mad2的晶体结构预测Mad2会改变构象6-8通过“安全带”机制将Cdc20绑紧6，8，尽管还发现了由BubR1和Bub3组成的另一种抑制复合物9，10.
最近，有人提出抑制复合物必须通过APC/C介导的Cdc20泛素化来主动解离，以关闭SAC11，12相反，在芽殖酵母中，Cdc20在纺锤体检查点期间泛素化，以将其靶向破坏13，14，这种降解很重要，因为过度表达Cdc20可以克服SAC13.
在这里，我们研究了人类SAC调节Cdc20的机制。与主流模型相反，我们发现Cdc20不会在与Mad2的化学计量络合物中积累，而主要是在与BubR1和Bub3的络合物中。此外，尽管Cdc20被APC/C泛素化，但需要泛素化来将Cdc20作为销毁目标，以维持检查点，而不是从检查点复合体中释放Cdc20：事实上，一种非泛素形式的Cdc20克服了检查点。我们认为SAC是通过BubR1-Bub3将Cdc20作为底物呈现给APC/C来维持的，而Mad2的主要作用是生成BubR1-Bub3-Cdc20复合物。
结果
Cdc20被主轴组件检查点降级
我们着手确定SAC是如何使人细胞中的Cdc20失活的，并注意到尽管在SAC停止期间Cdc20水平明显保持不变，但在添加蛋白酶体抑制剂MG132后，Cdc20的水平几乎增加了三倍（图和第1部分)表明Cdc20可能在SAC期间持续合成和降解。为了测试这一点，我们通过添加环己酰亚胺来抑制蛋白质合成，并发现Cdc20的水平大幅下降（图、和S1B级). 一个时间过程表明，Cdc20在诺克唑或紫杉醇阻滞细胞中的半衰期为～30分钟(). 细胞周期蛋白B1()和securin（未显示）也在SAC加固细胞中降解，半衰期为～1小时，如前所示15，16当我们添加雷帕霉素时，.Cdc20水平没有改变，雷帕霉素只抑制cap（eIF4E）依赖性翻译()这意味着在有丝分裂期间，Cdc20可以从内部核糖体进入位点（IRES）合成。磷酸-S6激酶的印迹表明，雷帕霉素抑制了mTOR通路，因此可能抑制了eIF4E依赖性翻译(). 我们在活细胞分析中证实了Cdc20的检查点依赖性降解15使用YFP-Cdc20融合蛋白。YFP-Cdc20保留了Cdc20的功能特性，因为它拯救了在有丝分裂中定位于动粒的siRNA耗尽的Cdc20细胞17，18当细胞退出有丝分裂时被降解。当我们用诺卡唑激活SAC时，前中期或中期细胞中的YFP-Cdc20荧光水平立即开始下降(). 当我们向间期细胞中添加诺康唑或紫杉醇时，YFP-Cdc20仅在核膜破裂（NEBD）时才开始降解()并被MG132稳定(). 当我们测定RPE细胞中Cdc20的降解时，获得了相同的结果(补充图S1B).
Cdc20在检查点对应的细胞中降解
A）HeLa细胞在S期进行预同步化，随后用诺卡唑阻止细胞有丝分裂6小时。细胞未经处理（对照）或用MG132或放线菌酮（CHX）处理2小时，通过定量免疫印迹法测定BubR1、Cdh1、Cdc20和Mad2的水平。蛋白质水平根据肌动蛋白进行标准化，条形图显示未经处理的样品设置为1时所示蛋白质的水平。B）将环己酰亚胺添加到诺可唑或紫杉醇阻滞的细胞（与A同步）后0、20、40、60和120分钟，通过ECL western blot分析BubR1、Cdc20、Cyclin B1和Mad2的水平（整个blot显示在图S7).C）将环己酰亚胺或雷帕霉素添加到诺卡唑阻滞的细胞后，在0、20、40、60和120分钟时，Cdc20和Mad2的水平（整个印迹显示为图S7).D）将雷帕霉素添加到异步HeLa细胞后，在0、30、60和120分钟时，p70S6K在Thr389上磷酸化。E和F）YFP-Cdc20在单细胞中的降解。将编码YFP-Cdc20的质粒微注射到G2期HeLa细胞中，通过有丝分裂检测荧光水平。请注意，YFP-Cdc20是由cap-dependent mRNA编码的，其翻译在有丝分裂中受到抑制，因此，我们可以在不使用环己酰亚胺的情况下检测降解。在指定的时间添加诺卡唑或MG132。在E）中的前中期和在F）中的G2期中加入诺可唑。在3个独立实验中，细胞代表10个细胞。
我们观察到YFP-Cdc20只有在NEBD后才开始降解，这表明作为对SAC的反应，Cdc20可能被APC/C泛素化，因为这是APC/C识别其第一个有丝分裂底物的时候19，20
21我们通过siRNA耗尽APC3来测试这一点()稳定细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白B1和安全蛋白（D.Izawa和JP，手稿正在准备中），并阻断细胞有丝分裂，从而证明APC/C失活。在APC/C缺失细胞中，内源性Cdc20和YFP-Cdc20在活性SAC存在下是稳定的(). 我们证实，通过siRNA耗尽Mad2，SAC本身是Cdc20降解所必需的，从而稳定Cdc20，直到细胞退出有丝分裂().
Cdc20降解取决于APC/C活性和功能性SAC。
一个)用抗GADPH的siRNA寡核苷酸处理细胞（如)或APC3，72小时后，通过添加环己酰亚胺30分钟并通过定量免疫印迹分析，在诺克唑滞留细胞中测定Cdc20的稳定性图S7).B）将Cdc20的水平归一化为Hsp70，显示了3个实验中Cdc20水平的平均值和标准偏差，未经处理的样本设置为1。C）用APC3 siRNA寡核苷酸处理的有丝分裂细胞中YFP-Cdc20荧光水平（该寡核苷酸在95%以上的细胞中阻止细胞有丝分裂数小时）。所示的细胞代表了2个实验中的6个细胞。D） 在诺科达唑存在下，用靶向Mad2或GAPDH的siRNA处理的有丝分裂细胞中YFP-Cdc20荧光水平。所示数据代表了分别针对GAPDH和Mad2、，
不活动的Cdc20不能因SAC而降级
我们观察到，Cdc20是APC/C针对SAC进行降解的目标，这引发了一个有趣的问题，即Cdc20是否激活了自身的破坏，或者是否被另一个APC/C识别Cdc20公司复杂。为了分析这一点，我们体外表达了各种带有静脉标记的Cdc20突变体，并测量了它们在诺可唑处理的细胞中的降解(). 为了结合APC/C，Cdc20需要异亮氨酸-精氨酸在其C末端和C盒基序22，23并且这些基序中的任何一个突变都可以阻止（IR突变）或显著减缓（C-box突变）其在SAC抵抗细胞中的降解(). 类似地，Mad2-结合位点（R132A）突变的Cdc20废除了SAC，并且在诺卡唑存在下未被降解().
Cdc20需要在SAC中降解APC/C和Mad2结合基序
如图所示，用编码YFP-野生型或突变体Cdc20的质粒微注射HeLa细胞，并在诺可唑存在下通过有丝分裂测定荧光水平。数据代表了每个突变体的3个独立实验。A） IR突变体（R499E）9细胞B）C-box突变体（D77RYIPHR公司83至A77AAIAHA公司83)13细胞C）Mad2-结合位点R132A，12细胞。
BubR1而非Mad2是受检查点限制的细胞中Cdc20的主要伙伴
我们对这些结果的解释是，SAC使Cdc20通过APC/C激活其自身的泛素化。为了验证这一点，我们通过尺寸排除色谱和定量免疫印迹分析了Cdc20、APC/C和检查点蛋白之间的相互作用。（我们使用氮气空化来溶解细胞，这些细胞溶解了>95%的Cdc20、APC/C和检查点蛋白(图S4和第5章)，并通过使用重组蛋白校准抗体来测量蛋白质复合物的化学计量比(图S1和S2系列)我们使用荧光标记的二级抗体，并在LiCOR Odyssey扫描仪上测量信号，该扫描仪的线性度超过104虽然在蛋白质转移、一级抗体的识别以及一级和二级抗体之间的结合中可能会引入错误，但其数量远远超过ECL。）。
在诺可达唑或紫杉醇阻滞的细胞中，大部分Cdc20在两个大的复合物中迁移，一个是约2 MDa，一个是约670 kDa（图和第3章和S4系列). 定量免疫印迹(和S3A和B)和峰值部分的免疫沉淀(和图S2)结果表明，2 MDa复合物含有APC/C、BubR1和Bub3，而670 kDa复合物含有BubR1和Bub三，但没有APC/C。两种复合物都含有极少的Mad2，其中大部分迁移到与游离Mad2相对应的大小（图和第3章和S4系列). 根据来自2 MDa和670 kDa复合物的Cdc20免疫沉淀物中的蛋白质数量，我们估计在具有活性检查点的细胞中，只有～5%的Cdc2与Mad2结合，而BubR1与Cdc20的摩尔比在0.5到1之间(图S2). 因此，我们检测到的670 kDa复合体可能与Tang等人（2001）确定的Bub3-BubR1-Cdc20检查点复合体相对应9和方（2002）10而不是MCC复合体，其中Mad2、BubR1、Bub3和Cdc20的化学计量比为1:1:1:124.
凝胶过滤色谱法分析检查点复合物
紫杉醇抑制细胞(一个)或用MG132处理紫杉醇阻滞细胞2小时(B类)或用MG132和ZM447439处理紫杉醇抑制细胞2小时(C类)在Superose 6柱上分离。检测各组分中的BubR1（红色）、APC4（绿色）、Cdc20（黑色）和Mad2（灰色），并通过定量免疫印迹分析。将值归一化为峰分数值，以获得所示的轮廓。（出现在APC/C和BubR1峰之间的星号表示的新的Cdc20峰可能是Cdc20与CCT伴侣结合，因为它并不总是可见的，例如，参见补充图4和5.）结果代表4个或更多独立实验。（紫杉醇阻滞细胞的全杂交显示图S7。请注意，这是针对Cdc20、BubR1和Mad2的顺序探测。）D&E）Cdc20是从诺卡唑阻滞细胞的两个峰组分中的每一个免疫沉淀的（组分22和组分28参见图S4)并分析了BubR1、APC3、Bub3和Mad2的存在，以及2 MDa复合体中APC/C亚基的存在(E） ●●●●。F-H）用抗GAPDH、Mad2或BubR1的siRNA寡核苷酸处理细胞72小时。在此期间，将细胞从双胸苷块中释放出来，9小时后用诺可唑和MG132处理2小时。Cdc20从振荡收集的有丝分裂细胞中免疫沉淀。通过定量免疫印迹法测定与Cdc20相关的BubR1和Mad2的数量，并将其归一化为Cdc20的数量。GAPDH处理细胞中BubR1和Mad2的水平设置为1。数据是使用BubR1 RNAi寡聚物#1在F中进行的3个独立实验的平均+/-SD，以及使用RNAi寡聚物#2在G中进行的2个独立实验的平均值。整个污点如所示图S7在这种情况下，污点被切成3块，不同的面板探测BubR1、Cdc20或Mad2。
当我们用MG132阻止Cdc20降解时，Cdc20在2 MDa和670 kDa复合物中都积累了()免疫沉淀APC/C证实了与Cdc20结合的增加(图S4). 此外，第三种复合物以大约200 kDa的速度运行，很可能是游离的Cdc20，因为它没有与任何已知的Cdc20partners共同迁移：Mad和Bub蛋白、APC/C和在～800 kDa迁移的CCT伴侣复合物25此外，当我们通过将Aurora B抑制剂ZM447439添加到紫杉醇或诺克唑处理的细胞中来释放检查点时26但通过添加MG132，在有丝分裂中保留了细胞，670kDa复合体中的Cdc20水平下降，更多作为“游离”Cdc20迁移(). 当我们分析细胞时，获得了相同的结果，在细胞中，我们通过在MG132存在下清洗纺锤体毒物来释放检查点(图S4). 添加MG132后，一些未与检查点蛋白结合的Cdc20的出现表明，阻止Cdc20降解导致Cdc20超过BubR1-Bub3复合物的水平，这与检查点校正细胞中的Cdc2和BubR1的数量相似（1:1:1:3，Cdc20:BubR1:APC/C:Mad2，图S2).
释放检查点后，随着APC/C迁移的BubR1的量减少，但与APC/C结合的Cdc20的量保持不变()，可能对应于活动的APC/CCdc20公司.
这些结果与Cdc20首先与BubR1结合，在检查点激活时形成670 kDa复合物一致，随后作为泛素化底物呈现给APC/C，从而形成2 MDa复合物。通过抑制降解，我们可能阻断了这一途径，导致2 MDa和中间670 kDa复合物积累。为了支持这一点，当蛋白酶体被抑制时，与APC/C结合的Cdc20和BubR1的量增加，而当添加环己酰亚胺时，其减少(图S4).
由于我们没有发现与Cdc20结合的大量Mad2，因此我们询问是否与酵母一样，Cdc20与BubR1结合需要Mad227，但Mad2和Cdc20之间的绑定不需要BubR1。与此相一致，抗Mad2的siRNA导致MG132有丝分裂中SAC相关细胞中结合到BubR1的Cdc20数量显著下降，而BubR1-siRNA没有显著改变结合到Cdc20的Mad2数量().
非泛素化Cdc20覆盖主轴组件检查点
我们的数据表明，APC/C催化的泛素介导的人Cdc20降解是维持SAC的重要组成部分。相比之下，泛素化最近被提议不是针对Cdc20进行降解，而是通过从检查点复合体释放Cdc20来灭活SAC11，12为了确定Cdc20的泛素化是否需要维持SAC或使其失活，我们制作了一个不能通过将所有赖氨酸转变为精氨酸而泛素化的Cdc20突变体。这种Cdc20的“无K”突变体不能被APC/C泛素化在体外()但功能正常，因为它可以激活APC/C(图S5A)和挽救以Cdc20为靶点的siRNA诱导的有丝分裂阻滞（3个独立实验中21个细胞中的21个），时间与野生型Cdc20相似（3个单独实验中16个细胞中有16个，图S5). （siRNA耗尽了95%以上的Cdc20水平，导致90%的细胞在有丝分裂中停滞28此外，无K突变体能够与检查点复合物适当结合和分离（见下文）。K-less突变体比野生型Cdc20更稳定()，并且与作为SAC不可分割的一部分的Cdc20降级一致，它能够驱动检查点认证的HeLa(，和电影1）和RPE(图S6，和电影2）细胞失去有丝分裂，而野生型Cdc20在类似水平上表达则不能。此外，以低于内源性Cdc20的水平表达K-less突变的细胞最初可以建立检查点，但无法维持，而过度表达野生型Cdc20～10倍的细胞仍然被阻止。siRNA耗尽Mad2可消除野生型或无K型Cdc20的这种延迟（数据未显示）。这些结果指出了Cdc20的泛素化和降解在维持SAC（但不是最初强加SAC）中的重要作用。
无赖氨酸的Cdc20突变体覆盖纺锤体检查点
A）从杆状病毒感染的SF9细胞中表达和纯化Cdc20的野生型或无K突变体，并用诺可唑阻滞细胞中纯化的APC/C培养增加量。通过免疫印迹法分析Cdc20的反应。。B）用siRNA处理以消耗内源性Cdc20的G2期HeLa细胞注射编码siRNA抗性YFP标记的野生型Cdc20或无K突变体的质粒，并用诺可达唑处理。每隔3分钟通过延时DIC和荧光显微镜监测细胞，并测量和量化荧光水平。YFP-Cdc20 K-less的缓慢下降是由于光浸出。C和D）DIC和细胞荧光图像分析(B类). 表达YFP-Cdc20 K-less蛋白的有丝分裂细胞（箭头所示）(D类)～120分钟后退出诺卡唑阻滞，而表达野生型YFP-Cdc20的细胞仍被阻滞5.5小时以上，并降解YFP-Cd20蛋白(C类). 在两个独立实验中，细胞代表17个（野生型）和16个（无K突变型）细胞。
表
表达Cdc20野生型或无K突变的HeLa和RPE细胞核膜破裂到后期的时间以及克服SAC的能力
| 时间NEBD-Anaphase | 诺康唑有丝分裂的退出 | 紫杉醇有丝分裂退出 | DMA中有丝分裂的退出 |
|---|
| 氦镧+重量Cdc20 | 90-180（n=16） | 0%（n=17） | 0%（n=8） | |
| HeLa+无K | 24-90（n=21） | 100%（n=16） | 100%（n=14） | |
| RPE+重量Cdc20 | | | | 0%（n=10） |
| RPE+无K | | | | 100%（n=15） |
为了直接测试是否需要Cdc20的APC/C依赖泛素化来释放检查点蛋白，我们通过siRNA从细胞中耗尽APC3和APC11亚基(). 如前所述，这稳定了SAC阳性细胞中的Cdc20，与APC/C靶向Cdc20进行破坏一致（图和). 当我们从具有活性SAC的对照细胞或APC/C缺失细胞中免疫沉淀Cdc20时，Cdc20与BubR1和一些Mad2结合，用ZM447439灭活检查点表明，具有或不具有APC/C活性的细胞从Mad2和Bub R1释放Cdc20的能力没有差异(). 与此一致，我们发现野生型和无赖氨酸Cdc20突变体从检查点复合体释放的能力没有差异。我们在四环素诱导的启动子下建立了稳定表达FLAG-tagged野生型或K-less Cdc20的细胞系，并使用抗FLAG抗体从诺康唑和MG132抑制的细胞中生成了免疫沉淀的FLAG-Cdc20。尽管与野生型Cdc20相比，无K突变体结合更多Mad2、BubR1和APC3（见讨论），但添加ZM447439后，野生型和无K突触从Mad2和BubR1分离的能力没有差异(). 因此，我们得出的结论是，Cdc20作为SAC的一部分广泛存在，目的是将其作为销毁目标，而不是将其从检查点复合体中释放出来。
检查点蛋白与Cdc20的分离不需要Cdc20泛素化。
A）用抗GAPDH的siRNA或抗APC3和APC11的siRNA处理细胞，并对APC3、APC11和Hsp70进行免疫印迹，作为负荷对照。B）细胞被视为A）用紫杉醇阻止有丝分裂，并通过添加环己酰亚胺（CHX）测定Cdc20的半衰期。C）在中处理的单元格A）与紫杉醇孵育6小时，将样品分成两部分，并添加MG132或MG132加ZM447439。2小时后对Cdc20进行免疫纯化，并通过定量免疫印迹法测定与Cdc20结合的BubR1和Mad2的量。（LC=抗体轻链）。整个污点如所示图S7注意，污点被切成3块，面板探测BubR1、Cdc20或Mad2。D）中所示实验的量化抄送：结合的BubR1和Mad2的水平归一化为Cdc20的量，在不含ZM447439的样品中，BubR1和Mad1的水平设置为1。显示了3个独立实验的平均+/-SD。
E）稳定表达FLAG-tagged wt或K-less Cdc20的HeLa细胞系从S期释放出来，在9小时后加入MG132，持续2小时，并通过振荡收集有丝分裂细胞。将样品分为两部分，并将100 nM紫杉醇和MG132添加到两者中。1小时后，从一个细胞中免疫纯化FLAG-Cdc20，并在免疫沉淀FLAG-Cdc20前1.5小时向另一个细胞中加入4μM ZM4447439。通过定量免疫印迹法测定与Cdc20结合的BubR1、APC3和Mad2的数量。F）中所示实验的量化E）在没有ZM447439的实验中，将BubR1和Mad2的水平标准化为Cdc20的量，并将绑定到Cdc20上的BubR1和Mad2量设置为1。注意，Cdc20的无K突变体从紫杉醇处理的细胞中共免疫纯化，其具有比wt Cdc20更多的BubR1和Mad2。显示了3个独立实验的平均+/-SD。当检查点失活时，与K-less和wt-Cdc20相关的APC3数量下降了75%。
讨论
这里我们已经证明SAC通过降解Cdc20作为APC/C底物来维持有丝分裂阻滞。为了做到这一点，SAC需要Mad2，但与大多数当前的检查点模型相比，我们发现在人类细胞中，大多数Mad2并不与Cdc20形成稳定的复合物。相反，Cdc20主要积累在与BubR1和Bub3的复合体中，该复合体与APC/C结合。然而，在没有Mad2的情况下，Cdc2不与BubR1结合。因此，我们的工作模式()是Mad2起催化作用，促进Cdc20与BubR1的结合，进而将Cdc20作为底物呈现给APC/C，以使其降解。一旦检查点失活，Cdc20就不再与BubR1结合，可以自由激活APC/C。这与芽殖酵母的数据一致，表明Cdc20在纺锤检查点期间降解13，14BubR1同源物Mad3对Cdc20的稳定性影响最大，Cdc20需要Mad2才能与Mad3结合27此外，在芽殖酵母中过度表达Cdc20，使其超过内源性水平的3倍，可使细胞在纺锤体毒物的存在下最初停止有丝分裂，但不会停留在有丝分裂状态13因此，通过降解Cdc20来维持SAC可能通过进化得以保存。
主轴检查点模型
Cdc20在有丝分裂过程中不断合成，并作为APC/C的激活剂。然而，在存在不正确附着的动粒的情况下，Mad2结合Cdc20，这允许Cdc20加载到BubR1上。一旦BubR1与Cdc20结合，就不需要Mad2来维持结合，并在复合物呈现给APC/C之前或之后离开复合物。APC/C随后促进Cdc20的泛素化和降解以维持检查点。
为什么必须降级Cdc20以维护检查点尚不清楚。最简单的解释是，它可以防止Cdc20超过BubR1-Bub3复合体的水平。这是可行的，因为Cdc20和BubR1在单元格中的级别相似，当我们将MG132添加到检查点对应的单元格时，会出现空闲的Cdc20。然而，这可能不那么简单，因为野生型Cdc20过度表达到～10倍的内源性水平不会覆盖检查点，并且共同表达的BubR1并不能阻止K-less突变驱动细胞脱离有丝分裂（尽管Bub R1可能需要Bub3和/或另一个检查点成分发挥作用）。由于即使少量不太可能超过Bub3-BubR1数量的无K Cdc20也能克服检查点，这可能表明泛素化直接使Cdc20失活。（尽管我们不能排除所有赖氨酸的突变也改变了其他调节性翻译后修饰（如磷酸化）的可能性，但Cdc20的突变版本，其中所有Cdk共有磷酸化位点都被改变为丙氨酸，并没有覆盖SAC，未显示）。另一种解释可能与我们的观察结果有关，即只有当APC/C的中期底物能够定位到细胞中的特定位置时，它们才能被降解（F.Cooke，A.Hagting和JP，制备中）。因此，如果只需要在特定位置保持Cdc20的低水平，那么在整个细胞中过度表达Cdc20可能不会使降解机制的能力饱和，而无K突变体可能会局部超过可用检查点复合物的水平。我们之前已经证明APC/C本身被检查点蛋白招募到不适当附着的动粒上29我们在这里提供的数据表明，正是在未附着的动粒上，BubR1将Cdc20作为底物呈现给APC/C。
我们的模型的优点是它使检查点成为一个动态系统。我们和其他人以前的工作表明，SAC和APC/C活动是紧密耦合的：关闭检查点后，细胞周期蛋白B1几乎立即开始破坏，如果重新设置检查点，破坏几乎立即停止（参见参考15). 由于Cdc20在SAC期间不断合成，这意味着激活或灭活Mad2将通过确定Cdc20是否与BubR1结合并变为非活性，或保持自由来激活APC/C，从而快速改变APC/C活性。
我们建议Mad2催化Cdc20和BubR1之间的结合。（Davenport等人得出了类似的结论，但他们在异步细胞中使用了过度表达的蛋白质30). 然而，Mad2没有一个可识别的催化域，并且Mad2的晶体结构也不能立即提供这种催化活性的线索。然而，仅Mad2是Cdc20抑制剂，或构成Cdc20抑制复合物的化学计量部分的反证据并不强烈。Mad2是一种很差的抑制剂在体外在裂变酵母中，Mad3/BubR1对Mad2阻断细胞有丝分裂至关重要31对有丝分裂检查点复合体的化学计量学定义方法也有警告241:1:1:1 Mad2:BubR1:Bub3:Cdc20，其中细胞仅标记有35S-蛋氨酸维持6小时，这不足以将长寿命蛋白质标记为平衡状态。
由于APC/C需要一个激活剂来识别其底物，所以一个有趣的问题是，在SAC期间，Cdc20的同一分子是否同时充当激活剂和底物，或者与BubR1结合的Cdc20是否需要另一个APC/C激活剂被降解。我们还无法区分这些可能性，但根据以下证据支持Cdc20同时作为活化剂和底物的观点。首先，siRNA处理表明SAC不需要另一种APC/C激活剂Cdh1；实际上，小鼠敲除表明胚胎或体细胞分裂不需要Cdh132其次，检查点期间Cdc20退化所需的基序映射到两类()：第一个是Mad2-binding区域（R132）中的基序，第二个是Cdc20绑定和激活APC/C所需的C盒和C端“IR”基序。
我们建议泛素化和降解用于灭活人类Cdc20并维持SAC，而不是像最近提出的那样关闭检查点11，12虽然我们注意到无K的Cdc20结合更多Mad2，但这可能是因为我们通过改变Cdc20的Mad2结合位点中的保守赖氨酸来增加其对Mad2的亲和力，因为精氨酸在噬菌体展示筛选Mad2-结合肽的这个位置是首选的8我们没有发现证据表明Cdc20泛素化对使检查点失活很重要，因为不能泛素化的无K形式的Cdc20能够替代野生型Cdc20以明显正常的时间促进有丝分裂的退出，当检查点关闭时，其从Mad2或BubR1释放的能力不会受到影响。
泛素化和降解并不是Cdc20失活的唯一途径，因为表达无K突变的细胞在微管毒素存在的情况下最初延迟有丝分裂，并且它们通过无挑战的有丝分裂以与野生型Cdc20细胞相似的速度进行，而没有SAC的细胞通过有丝分裂大大加速33因此，当Cdc20与Mad2结合并并入BubR1复合物时，其最初可能会失活，但为了维持阻滞，Cdc20必须泛素化和降解。失活可能与BubR1结合并将Cdc20呈现给APC/C的方式有关，从而使Cdc20靶向自身进行破坏：在这种状态下，Cdc20不太可能针对另一种底物激活APC/C。
最后，我们发现Cdc20在有丝分裂中不断合成，以取代被降解的蛋白质。Cdc20的合成对雷帕霉素不敏感，这表明它可能是从IRES翻译过来的。肿瘤细胞系维持检查点阻滞的能力有很大差异34这一可变性是否是由Cdc20合成或降解的差异引起的，这将是一件有趣的事情。
致谢
我们感谢岩泽大辅开创性地去除APC3和APC11 siRNA，感谢保拉·马尔科帮助构建BubR1，感谢斯蒂芬·泰勒、方国伟和安德烈亚·穆萨奇试剂，感谢阿萨纳西奥斯·詹尼斯用于二甲基萘醌，感谢桑格质谱中心质谱小组的梅塞德斯·帕尔多和卢瑜，Andrea Musacchio和我们实验室的成员进行了有益的讨论。MY特别感谢松坂隆弘在显微镜和显微注射方面的帮助。JN得到了嘉士伯基金会和丹麦癌症协会的奖学金支持，MY得到了Yousef Jameel奖学金的支持。这项工作得到了英国癌症研究所向JP提供的项目拨款（C29/A3211）的支持。
附录
材料和方法
抗体
在指定的稀释度下使用以下抗体。Cdc20（ab26483，Abcam）1:200，Cdc201:200 BubR1（SBR1.1是曼彻斯特大学Stephen Taylor博士赠送的礼物）1:1000，Bub3（611730，BD Transduction Laboratories）1:500，Cyclin B1（mAb GNS-1，BD Pharmingen）1:2000，FLAG（F3165，Sigma）1:1000、APC3（610455，BD Conduction Laburatories）1:1500。APC4（针对C末端肽的单克隆抗体）1:500，APC11（针对C端肽的单抗）1:500。APC7（Abcam 4171）1:500、APC8（Biolegend）1:500，Cdc16（Santa Cruz Biotechnology）1:500；磷酸-APC1（Jan-Michael Peters博士馈赠的礼物），APC10（针对全长蛋白质饲养）1:2000
用于LiCor的二级抗体：Alexa Flour 680兔抗羊（A21088）、Alexa Fluor 680羊抗鼠（A21057）、Alexa Fluoro 680山羊抗兔（A21076）均以1:5000使用。
凝胶过滤柱色谱法
细胞通过有丝分裂摇晃获得，并用冰镇PBS洗涤两次。细胞重新悬浮在缓冲液A中（140 mM NaCl，30 mM Hepes pH 7.8，6 mM MgCl2，5%甘油，1 mM DTT，1μg/μl亮肽，1μg/ml凝乳抑素，0,2μM微囊藻毒素，3 mM ATP），缓冲液与细胞的比例为1:1，通过氮气空化打开（1000 PSI，30分钟，美国帕尔仪器公司）。在将溶解的细胞装入Superose 6 PC 3.2/30（GE Healthcare，USA）前10分钟，分别在20000g、10分钟和259000g下离心。在缓冲液B（140 mM NaCl、30 mM Hepes 7.8、5%甘油、1 mM DTT）中以25μl/min的流量运行色谱柱，并收集50μl馏分。
定量免疫印迹
一级抗体与荧光标记的二级抗体孵育，并根据制造商的说明使用LI-COR Odyssey CCD扫描仪测量荧光（LI-COR Biosciences，NE，USA）。我们已经测试了这个扫描仪，它在至少10个范围内是线性的三，我们校准了5到150纳克范围内的抗体，参见图S2B.
RNA干扰
使用了以下ON-TARGETplus（美国科罗拉多州达尔马孔）寡聚物APC3-1（GGAAAAGCGAGAGAGUAAUU）和APC3-2（CAAAGAGCCUUAGUUAAUU。使用寡病毒素（Invitrogen，美国）将100 nM寡病毒转染细胞。在转染IP后72小时收集细胞，或在40小时后通过显微镜进行分析。在实验中，APC3和APC11均被敲除75 nM的APC3-1和50 nM的APC11，并在细胞收获前72小时和48小时转染细胞。
细胞培养
HeLa细胞在含有10%FBS的高级D-MEM中保存。RPE细胞在含有10%FBS的D-MEM（SIGMA）中保存。为了在S期开始时同步化，HeLa电池用2.5 mM胸腺嘧啶或2.5 mM嘧啶处理，然后用2.5μg/ml蚜虫灵处理，如前所述35为了在前中期阻断HeLa细胞，添加诺康唑或紫杉醇至0.08 ng/μl的最终浓度。使用Eg5抑制剂Dimethylanastron在10μM（德国莱比锡大学Athanassios Giannis博士的馈赠）下在前中期阻断RPE细胞。用于免疫沉淀或凝胶过滤分析的细胞在单次或双次胸腺嘧啶阻断后，用诺可唑或紫杉醇以0.08 ng/μl的浓度处理12小时。使用Flp-In系统（Invitrogen）制备稳定的表达FLAG-Cdc20 wt和FLAG-Cdc20 K-less的细胞株。HeLa FRT细胞系是Stephen Taylor（曼彻斯特）赠送的礼物。通过添加最终浓度为20μg/ml的环己酰亚胺或20 ng/ml的雷帕霉素来抑制蛋白质合成。为了阻断蛋白酶体，将MG132添加到10μM。
体内检查点蛋白的分离
将APC3和APC11敲除，通过双胸苷方案使细胞同步，并释放到紫杉醇中6小时。将MG132添加到细胞中，并将ZM447439添加到1个培养皿中2小时。按照所述处理细胞进行Cdc20免疫沉淀。
表达FLAG-Cdc20 wt或FLAG-Cdc20 K-less的稳定细胞系通过双胸腺嘧啶方法进行同步化，并在最后一次胸腺嘧啶治疗释放后9小时添加MG132 2小时，通过摇晃收集有丝分裂细胞。细胞被重新放置到紫杉醇中，1小时后执行第一次FLAG-IP。向剩余的一半细胞中加入ZM4447439 1，5小时，并进行第二次FLAG IP。
显微镜
使用delta T系统（美国宾夕法尼亚州Bioptechs）在显微镜上培养细胞，并在配备40×1.2 NA浸油透镜的徕卡DMIRBE或DMIR2显微镜上通过延时荧光和DIC显微镜成像。Cerulean/CFP和Venus/YFP是使用JP5滤光片组（美国科罗拉多州科罗拉多州，VE）和Cascade 512B或QuantEM CCD相机（美国亚利桑那州，Photometrics），滤光片轮上装有激励和发射滤光片（Lambda 10-3，Sutter Instrument Co，CA，USA）。
使用Corvus（德国马尔扎泽）或H117（英国普赖尔）阶段捕获多个单元位置。快门（Smart shutter，Sutter Instrument Co，CA，USA）、滤光片轮、舞台、显微镜和相机都由SlideBook软件（Intelligent Imaging Innovations，Co，USA，美国）控制。每隔3分钟拍摄一次图像，并使用幻灯片进行分析。图像被导出到ImageJ以组装成电影。
免疫沉淀
使用缓冲液B将复合物与共价偶联到Dynabeads（Invitrogen）的抗体进行免疫沉淀，用于孵育和洗涤。将用于免疫沉淀的细胞在冰上用缓冲液B中的0.1%NP40裂解30分钟，并通过20000×g旋转澄清10分钟。
构件
pET30a-Mad2:Mad2被克隆到pET30a的BamHI和HindIII中。pET30a-TEV-Securin：用BamHI和XhoI消化TEV-Secrin，并将其插入BamHI-和XhoI消化的pET30a中。pET30a-UbcH10:用BamHI和HindIII消化UbcH10，并克隆到用BamHI和Hind III消化的pET30a中。pET30a-APC10:用BamHI和EcoRI消化APC10，并克隆到用BamRI和Eco RI消化的pET30a中。pFAST-BAC BubR1:用BamHI和SmaI消化的BubR1连接到用Bam HI和Stu I消化的pFAST BAC B中克隆到pPICZ A的EcoRI和Not I位点。YFP-Cdc20：Cdc20克隆到pYFP-C1的EcoRI和BamHI。将pcDNA5/FRT/TO FLAG-Cdc20克隆到改良pcDNA5/RRT/TO载体的BamHI位点。如有要求，可提供所有克隆的详细信息。
蛋白质表达
Mad2、APC10、Securin和UbcH10在37℃的BL21（DE3）RIL中表达，并通过镍亲和层析（Qiagen）纯化。在变性条件下纯化APC10。镍亲和层析后，通过TEV裂解从Securin中去除His-Tag，然后通过镍亲和色谱去除Tag，最后在Superdex 75上进行层析。通过Superdex 75上的色谱进一步纯化Mad2和UbcH10。Cdc20在pPICZ His-Cdc20中表达毕赤酵母并通过镍亲和层析纯化，然后在Superdex 200上层析。根据制造商的说明（Invitrogen），在Sf9细胞中表达BubR1、wt Cdc20和K-less Cdc20，并通过镍亲和层析纯化。
体外泛素化
用APC4抗体纯化APC/C复合物并用肽抗原洗脱。在37°C的QA缓冲液（100 mM NaCl、30 mM Hepes-KOH 7,8、2 mM ATP和2 mM MgCl）中在15μl中进行反应30分钟2,0,1μl/μg BSA，1mM DTT），并含有0.02μg/μl securin，1,3μg/µl ubiquitin，0,05μg/¦Μl UbcH10，0.015μg/Μl E1，0,1 ng/¦µl Cdc20和1μl APC/C。
抗RNAi Cdc20结构
为了挽救RNAi介导的Cdc20缺失，我们构建了野生型Cdc20和Cdc20，通过组装化学合成的寡核苷酸将所有赖氨酸转变为精氨酸，如前所述36使用Gene Designer软件将DNA序列设计为与野生型最大不同37.
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