细胞感知环境营养物质的流动，并通过严格控制合成代谢和分解代谢过程作出反应，以使细胞生长与营养状态最佳协调。雷帕霉素（mTOR）是一种保守的丝氨酸-苏氨酸激酶，其机制靶点是mTOR复合物1（mTORC1）的一部分，有助于协调细胞生长与营养状态。mTORC1的失调在人类疾病中很常见，包括癌症和糖尿病(1). 氨基酸对mTORC1激活至关重要(2,三); 然而，目前尚不清楚特定氨基酸是如何被感知的。亮氨酸（Leu）(2,4,5)，谷氨酰胺（Gln）(5–7)和精氨酸（Arg）(2)与mTORC1激活有关。在一个模型中，mTORC1间接感应溶酶体腔中需要Rag鸟苷三磷酸酶（GTPases）的氨基酸，GTPases由五聚体Ragulator复合物、液泡H调节+–腺苷三磷酸酶（v-ATP酶）和Gator复合物(8,9). 当激活时，Rag GTPase结合并将mTORC1募集到溶酶体，其中Rheb GTPase激活mTORC2(4). 在哺乳动物中，有四种Rag蛋白：RagA和RagB，它们在功能上是冗余的；以及功能等效的RagC和RagD。RagA或RagB与RagC或RagD之间异二聚体的形成，以及Rag蛋白的鸟嘌呤核苷酸状态决定了mTORC1向溶酶体的募集和随后的激活(4,10,11). 在氨基酸充足的情况下，RagA和RagB复合物是负载三磷酸鸟苷（GTP）的，能够结合猛禽。v-ATP酶以某种方式检测溶酶体氨基酸的积累(12)刺激Ragulator鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）活性，并抑制Gator GTPase激活蛋白（GAP）活性(9,13). 这将使RagA-RagB复合物与GTP结合，并将mTORC1招募到溶酶体，在溶酶体中与Rheb相遇，Rheb是一种调节生长因子信号的强效mTORC1-activator。结节性硬化症复合物（TSC）肿瘤抑制因子也定位于溶酶体，它通过充当Rheb的GAP负调控mTORC1(14).
我们生成了缺乏RagA和RagB的小鼠胚胎成纤维细胞[RagA/B敲除（KO）MEF](和图S1). RagA-RagB复合物直接与mTORC1结合(15)，并且两种蛋白之一的组成活性版本的过度表达使mTORC1对氨基酸饥饿不敏感(图S2) (4,10). RagA/B的缺失降低了RagC的丰度，这与RagA和RagB通过形成异二聚体稳定RagC和RagD一致() (4,16). 根据底物核糖体S6激酶1（S6K1）和真核生物翻译起始因子4E结合蛋白1（4EBP1）的磷酸化状态判断，RagA和RagB的缺失降低了（～30%），但没有消除mTORC1活性。当用mTOR抑制剂Torin1和雷帕霉素处理RagA/B KO细胞或用短发夹RNA（shRNA）耗尽mTORC1亚单位Raptor时，S6K1和4EBP1的磷酸化被消除(图S3). 因此，在缺乏RagA和RagB的情况下，mTORC1是活跃的。
Gln而非Leu独立于RagA和RagB激活mTORC1mTORC1活性通过S6K1（pS6K1）、S6（pS4）和4EBP1（p4EBP1）的磷酸化和4EBP的迁移率变化进行分析。AA，氨基酸。(A类)在正常条件下（NC）分析对照组（CON）和RagA/B KO MEF中的mTORC1活性。还分析了mTOR、Raptor、RagA、RagB和RagC蛋白。(B类)在NC、不含氨基酸（–AA）和添加氨基酸（+AA）后的指定时间，分析CON和RagA/B KO MEF中的mTORC1活性（左）。绘制了pS6K1的相对丰度图（右）。(C类)在CON和RagA/B KO MEFs中用Leu（顶部）或Gln（底部）刺激后的mTORC1活性。(D类)在指定时间用Leu或Gln刺激稳定表达Flag-tagged RagA的RagA/B KO MEF后，分析mTORC1活性。(E类)在缺乏氨基酸或用Leu或Gln刺激150分钟的CON、RagA KO（A1）和RagA/B KO（AB1）HEK293A细胞中分析mTORC1活性。
为了研究RagA/B KO MEF的氨基酸反应，我们用氨基酸刺激细胞并分析mTORC1激活的动力学。在缺乏RagA和RagB的细胞中，氨基酸激活mTORC1的量和速率都降低(和图S4). 同样，氨基酸提取后，RagA/B KO MEF中的mTORC1活性降低(图S5). 为了排除一些缺乏RagA和RagB的细胞自发突变以补偿mTORC1活性降低的可能性，我们分析了来源于RagA/B KO-MEF群体的单个克隆。单个克隆对氨基酸的反应显示mTORC1活性增加(图S6). 为了确定哪些氨基酸在没有RagA和RagB的情况下激活mTORC1，我们分别用20个标准氨基酸中的每一个刺激RagA/B KO MEF(图S7). Leu和Arg刺激对照组的mTORC1激活，但不刺激RagA/B KO细胞(和图S7和S8). 当用20种标准氨基酸刺激RagA/B KO细胞时，RagA/BKO细胞中受Gln刺激的mTORC1活化表现出与对照细胞相似的动力学(、和图S4). RagA/B KO MEF中标记RagA的稳定再表达恢复了mTORC1对Leu的激活()这证实了RagA和RagB是Leu激活mTORC1所必需的，而不是Gln。
我们通过聚集的规则间隔短回文重复序列（CRISPR/Cas9）进行基因组编辑，以灭活人类胚胎肾293A（HEK293A）细胞中的RagA和RagB基因(17,18) (图S9). 在HEK293A细胞和MEF中，RagA比RagB更丰富(和图S9E). 这些细胞中RagA单独或同时缺失RagA和RagB可以阻止Leu诱导的mTORC1活化，但不能阻止Gln诱导的mTORC1活化(和图S9F). 因此，Gln可以独立于RagA和RagB或细胞类型刺激mTORC1激活。
溶酶体在通往mTORC1的氨基酸传感途径中是必不可少的，被认为是最佳mTORCl激活平台，该平台通过Rheb整合生长因子（如胰岛素）的作用，通过Rags整合氨基酸的作用(19). 因为Gln可以在缺乏RagA和RagB的情况下激活mTORC1(,图S7和图S9F)，我们研究了在缺乏RagA和RagB的细胞中，mTORC1的溶酶体定位是否是Gln诱导mTORCl活化所必需的。在对照细胞中，mTOR早在50分钟时就转移到溶酶体膜上，通过标记蛋白溶酶体相关膜蛋白2（LAMP2）的存在进行鉴定，并在氨基酸刺激150分钟后留在溶酶体上(图S10A) (4,11). 相反，氨基酸刺激50分钟后，mTOR没有定位于RagA/B KO细胞的溶酶体膜(图S10B). 然而，到150分钟时，我们观察到mTOR在一组细胞中的溶酶体定位，这些细胞也显示mTORC1的激活(和图S10B). Gln而非Leu诱导RagA/B KO MEF中mTOR溶酶体定位(). 此外，在RagA/B KO细胞中观察到氨基酸和胰岛素协同激活mTOR(图S11). 因此，Gln似乎以独立于RagA和RagB的方式通过易位到溶酶体来诱导mTORC1的激活。
缺乏RagA和RagB时Gln诱导的mTORC1溶酶体定位(A类)免疫荧光（IF）分析显示RagA/B KO MEF中S6（pS6；橙色）磷酸化激活mTORC1。图中还显示了mTOR（绿色）和LAMP2（红色）。具有mTOR和LAMP2共定位的pS6细胞的百分比的定量（右上）和具有mTOR但不在溶酶体中也含有S6磷酸化的细胞的百分比（右下）。(B类和C类)IF分析显示CON（B）或RagA/B KO MEF（C）中的mTOR和LAMP2，不含氨基酸或用Leu或Gln刺激150分钟（顶部）。定量无氨基酸溶酶体或受Leu或Gln刺激的mTOR细胞百分比（底部）。插图所描绘区域的高倍图像（A）至（C）及其叠加显示在右侧。
氨基酸转运蛋白(5,12)和Ragulator复合体(11,13)与mTORC1激活有关。我们分析了缺乏几种氨基酸转运体的细胞和缺乏p14（p14 KO MEF）的MEF中的mTORC1活性，p14是Ragulator复合体的一个基本亚单位。在缺乏某些氨基酸转运体的细胞和p14 KO MEF中，Gln激活了mTORC1，这表明这些转运体和Ragulator对Gln诱导的mTORC2激活不需要(图S12和).
Gln-诱导的mTORC1激活需要v-ATP酶而不是Ragulator通过S6K1（pS6K）的磷酸化和4EBP1的迁移率变化分析mTORC1活性。(A类)在缺乏氨基酸的CON和p14 KO MEF中分析mTORC1活性，然后在指定时间用Leu（顶部）或Gln（底部）刺激。(B类和C类)氨基酸缺乏的CON和RagA/B KO细胞mTORC1活性分析；用或不用1μM Baf A预处理；然后刺激氨基酸、亮氨酸或谷氨酰胺150分钟(D类)用靶向v-ATP酶V0c亚基（shV0c）的shRNA CON（shCON）或shRNA处理CON和RagA/B KO MEF。CON和RagA/B KO MEF缺乏氨基酸，随后进行氨基酸刺激，并评估mTORC1活性。
v-ATP酶对溶酶体的酸化至关重要，并与Rags和Ragulator相互作用，刺激mTORC1对氨基酸的激活(12). 我们用v-ATP酶抑制剂bafilomycin A（Baf A）处理对照组和RagA/B KO细胞(20). 当用所有氨基酸刺激细胞时，Baf A抑制了对照细胞和RagA/B KO细胞中mTORC1的激活(和图S13A)或单独使用Leu或Gln(). Baf A还抑制RagA/B KO细胞中mTORC1的溶酶体定位(图S13、B和C). 此外，concanamycin A对v-ATP酶的抑制或氯喹对溶酶体pH梯度的抑制也阻断了Gln诱导的RagA/B KO细胞溶酶体定位和mTORC1激活(图S13，D至H). 此外，v-ATPase V0c亚单位的缺失，该亚单位与Ragulator相互作用并控制mTORC1活性(12)，在很大程度上阻止了氨基酸诱导的对照组和RagA/B KO MEF中mTORC1的激活(和图S13I). 此外，在缺乏RagA和RagB的情况下，几种溶酶体蛋白的缺失对Gln诱导的mTORC1的激活和定位没有影响，这表明v-ATP酶的修饰并不是溶酶体结构和功能全面破坏的次要因素(图S13、K和L). 总之，Gln诱导的mTORC1激活似乎需要v-ATP酶和溶酶体功能。
在果蝇属S2细胞，TORC1活性在缺乏果蝇属ADP核糖基化因子-Arf1（dArf1）(21)当dRagA和dArf1都耗尽时，我们观察到氨基酸诱导的TORC1活化进一步减少(). 我们使用小干扰RNA（siRNA）从HEK293A RagA/B KO细胞中去除Arf1。Gln刺激经对照siRNA处理的RagA/B KO细胞中的mTORC1活化；然而，它未能在Arf1缺失的RagA/B KO细胞中诱导mTORC1激活(). 其他Arf家族成员的耗尽未能抑制Gln诱导的RagA/B KO细胞中mTORC1的激活(图S14A). Arf1 GEF抑制剂brefeldin A（BFA）对RagA/B KO细胞的治疗作用(22)在高剂量下，阻断了mTORC1的氨基酸信号传导，而BFA对对照细胞中的氨基酸的反应仅导致mTORCl活化的少量减少(和图S14、B和C). BFA始终阻断Gln诱导的RagA/B KO细胞中mTORC1的激活(和图S14D). 此外，Arf1或BFA处理的缺失不会抑制对照细胞中Leu诱导的mTORC1的激活，也不会影响溶酶体的pH(图S14，E至G).
在没有RagA和RagB的情况下，向mTORC1发送Gln信号需要Arf1(A类)TORC1活性分析用于果蝇属S6K1（pdS6K1）英寸果蝇属用靶向GFP、RagA或Arf1的双链RNA（dsRNA）处理S2细胞。细胞饥饿氨基酸1小时，然后用或不用氨基酸刺激30分钟(B类)通过用对照（siCON）或Arf1 siRNA（siArf1）处理的RagA/B KO HEK293A细胞中S6K1（pS6K1）的磷酸化或4EBP1的迁移率变化来分析mTORC1活性。细胞缺乏氨基酸，然后用谷氨酰胺刺激150分钟(C类)在缺乏氨基酸的CON和RagA/B KO MEF中分析mTORC1活性，如（B）所示，然后用指示浓度的BFA预处理，并用氨基酸刺激150分钟。标签s.e.和l.e.分别表示短时间接触和长时间接触。(D类)在缺乏氨基酸的RagA/B KO HEK293A细胞中分析mTORC1活性，如（B）所示，然后用或不用1μM BFA预处理，并用Leu或Gln刺激150分钟(E类)描述RagA/B KO MEF中mTORC1激活（pS6；橙色）和溶酶体定位（LAMP2；红色，mTOR；绿色）的IF分析。细胞缺乏氨基酸，用或不用1μM BFA预处理，然后用Gln刺激150分钟。图像右侧显示了插图所示区域的高倍图像及其叠加。定量不同条件下溶酶体中mTOR的细胞百分比和相应的Western blot（右）。(F类)在转染有HA-Raptor或含有Rheb C末端CAAX基序（HA-Raptor-C-Rheb）的HA-Rapter的RagA/B KO HEK293A细胞中，mTORC1活性如（B）所示进行分析。细胞缺乏氨基酸，用或不用1μM BFA预处理，用Gln刺激150分钟。
亮氨酸或谷氨酰胺刺激似乎不会影响Arf1的鸟嘌呤核苷酸状态(图S14H). 过表达组成活性Arf1-GTP未能在氨基酸缺乏情况下恢复mTORC1活性(图S14I). 此外，绿色荧光蛋白标记的Arf1（Arf1-GFP）定位不受氨基酸饥饿或刺激的影响(图S15). 这些结果表明，激活mTORC1需要GTP水解或Arf1核苷酸循环，或两者兼而有之。
Arf1调节水泡运输，因此我们测试了内质网（ER）和高尔基体之间运输的双向抑制是否会影响Gln诱导的mTORC1激活(23). 我们耗尽了参与顺行运输的蛋白质，并用高尔基肽A处理RagA/B KO细胞(24)但未观察到对谷氨酰胺诱导的mTORC1活化的影响(图S16). 这些结果支持Arf1对mTORC1的信号传导是特异的，并且独立于ER-Golgi囊泡转运。
分析BFA处理的RagA/B KO MEF对Gln刺激的mTOR定位。Gln-诱导mTOR定位于溶酶体(和); 然而，BFA预处理细胞抑制了Gln的作用(). 通过将Rheb的C末端溶酶体靶向基序添加到猛禽，将mTORC1人工靶向溶酶体表面(11)激活RagA/B KO细胞中的mTORC1，即使存在BFA(). 因此，BFA通过干扰其溶酶体定位来抑制mTORC1，这意味着Arf1参与了连接Gln与mTORCl定位和溶酶体激活的信号通路。
总之，我们表明mTORC1受Gln和Leu的差异调节(图S17). 我们的研究结果表明，RagA和RagB对Leu激活mTORC1是必需的，而不是Gln激活，这在进化上似乎是保守的酿酒酵母(25). 我们确定Arf1 GTPase参与了一条信号通路，该通路在Rag GTPase缺失的情况下将Gln连接到溶酶体的mTORC1激活。许多癌症细胞系增加了mTORC1活性，并显示出对生长的Gln高度依赖。因此，Gln诱导的mTORC1激活可能对正常细胞和肿瘤细胞的生长都很重要。
