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细胞死亡不同。2014年7月；21(7): 1036–1049.
2014年2月21日在线发布。 doi（操作界面）：10.1038/cdd.2014.17
预防性维修识别码：项目经理4207472
PMID：24561342

LIM激酶-2通过DRP1介导的线粒体分裂功能障碍诱导程序性坏死神经元死亡

J-E金,1 H J Ryu先生,1 M J Kim先生,1和T-C康1中，*
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摘要

尽管细胞周期蛋白的异常激活在神经元死亡中起着关键作用，但细胞周期蛋白D1/细胞周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）介导的死亡信号的效应器或介质仍不清楚。在这里，我们描述了LIM激酶2（LIMK2）在程序性坏死神经元死亡中先前未被怀疑的作用。p27下调基普1Rho激酶（ROCK）激活的表达诱导易患癫痫持续状态（SE）神经元中cyclin D1/CDK4的表达水平。细胞周期蛋白D1/CDK4复合物随后增加了LIMK2的表达，这与caspase-3和受体相互作用蛋白激酶1的活性无关。反过来，上调LIMK2会损害动态相关蛋白-1（DRP1）介导的线粒体分裂，而不会改变cofilin磷酸化/表达，最终导致坏死神经元死亡。抑制LIMK2表达和拯救DRP1功能可以减弱SE诱导的程序性坏死神经元死亡。因此，我们认为ROCK-p27基普1-细胞周期蛋白D1/CDK4-LIMK2-DRP1介导的程序性坏死可能是神经元死亡的新治疗靶点。

关键词：第27页基普1、细胞周期蛋白D1/细胞周期蛋白依赖性激酶4、LIM激酶2、动态相关蛋白-1、坏死神经元死亡、癫痫发作

细胞周期对于包括各种细胞的增殖、分化和存活在内的重要过程至关重要。细胞周期进程由两类蛋白质调节，即细胞周期素和细胞周期素依赖性激酶（CDK）。其中，细胞周期蛋白D1与CDK4形成复合物，并通过磷酸化使视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）失活，从而激活转录因子E2启动子结合因子（E2F）家族。活性E2F诱导涉及细胞周期的各种基因转录。1在有丝分裂后神经元中，一些病理条件上调细胞周期蛋白D1/CDK4复合体的表达，以诱导E2F成员的激活，从而促进促凋亡分子的转录增加。2,三然而，由于以下几个原因，细胞周期蛋白D1的表达是否直接导致神经元死亡尚不清楚。首先，由于cyclin D1/CDK4表达与DNA断裂开始之间存在时间延迟，大多数cyclin D2阳性神经元显示TUNEL阴性。4,5第二，细胞周期蛋白D1水平在培养的胚胎神经元凋亡诱导后没有改变。6第三，很少观察到Rb磷酸化体内,4尽管细胞周期蛋白D1/CDK4复合物磷酸化凋亡培养神经元中的Rb蛋白。6第四，缺血后细胞周期蛋白D1的诱导与再生和对细胞凋亡的抵抗有关，而不是细胞凋亡的介质。5,7,8第五，细胞周期蛋白D1/CDK4介导的死亡信号的效应器或介质尚不清楚。最后，各种损伤导致的神经元死亡是形态学上的坏死而非凋亡。9,10,11,12因此，在细胞周期蛋白D/CDK4介导的神经元死亡途径中可能缺少一些基本因子。

LIM激酶（LIMK1和LIMK2）磷酸化cofilin，它是肌动蛋白动力学的刺激反应介质。13,14,15有趣的是，非磷酸化cofilin靶向线粒体膜，以响应细胞色素的凋亡刺激c（c）以依赖肌动蛋白的方式释放。16LIMK2也转位到细胞核，在那里它介导对细胞周期蛋白D1表达的抑制，并抑制G1-S相变。17因此，LIMK可能以肌动蛋白依赖或非依赖的方式参与细胞周期蛋白D1介导的神经元死亡。为了解决这个假设，我们研究了LIMKs在癫痫持续状态（SE，长时间发作活动）诱导的神经元死亡中的作用。

结果

LIMK2过度表达诱导CA1神经元坏死性变性

首先，我们研究了SE后LIMK2表达及其磷酸化水平的变化。

Western blot研究显示，SE后LIMK2蛋白逐渐上调，但LIMK1蛋白没有上调(P（P）<0.05与非SE动物，图1a). 在SE后1、2和3天，LIMK2 mRNA也分别增加到非SE水平的3.8、6.1和7倍(P（P）<0.05,图1b). 尽管与非SE动物相比，pLIMK2 T505水平显著降低，但pLIM2 S283和S291+293水平没有改变(P（P）<0.05,补充图S1a和b). SE也未改变Cofilin mRNA/蛋白表达和Cofilin磷酸化(补充图S1a–c). LIMK2基因敲除显著抑制SE诱导的LIMK2mRNA/蛋白表达上调(P（P）<0.05与控制siRNA，图1c和d).LIMK2（极限状态2）siRNA显著降低SE后pLIMK2 T505、S283和S291+293的水平(P（P）<0.05与控制siRNA，补充图S1a和b). 然而，LIMK2（极限状态2）与对照siRNA相比，siRNA不影响cofilin mRNA/蛋白的表达及其磷酸化(补充图S1a–c).

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SE后LIMK2介导的神经元死亡(一)蛋白质印迹显示在SE之后LIMK2蛋白水平逐渐上调*P（P）<0.05与非SE(n个分别=5）。(b条)定量逆转录酶-PCR数据显示，SE后LIMK2 mRNA增加*P（P）<0.05与非SE(n个分别=5）。(c（c）和d日)LIMK2（极限状态2）siRNA显著抑制SE诱导的LIMK2信使核糖核酸/蛋白质表达水平*P（P）<0.05与控制siRNA(n个分别=5）。(e（电子）)在CA1锥体细胞中检测到LIMK2表达上调。钢筋=400μm（LIMK2）和50μ米（FJB）。(（f）)LIMK2（极限状态2）siRNA显著减少SE诱导的FJB阳性神经元数量*P（P）<0.05与控制siRNA(n个分别=5）。(克和小时)大多数LIMK2阳性神经元显示TUNEL信号。LIMK2（极限状态2）siRNA显著降低SE诱导的TUNEL信号*P（P）<0.05与控制siRNA(n个分别=5）。巴=12.5μ米

免疫组化数据显示SE上调CA1锥体细胞中LIMK2的表达(图1e). 大多数LIMK2阳性神经元（92%）显示TUNEL信号(图1g). 这些CA1神经元显示出指骨样蛋白（F-actin标记物）信号减少，树突肿胀，微管解体，细胞核固缩(P（P）<0.05与非SE动物，补充图S1d和e). 此外，尽管HMGB1免疫反应仅在非SE动物的细胞核中检测到，但SE后高迁移率族蛋白1（HMGB1）从细胞核中释放出来，最终在CA1神经元中消失(补充图S1f和g). 由于HMGB1通常位于细胞核中，转位到细胞质和/或细胞外间隙，发生坏死而非凋亡，18,19这些发现表明SE诱导坏死性神经元变性而非凋亡。

LIMK2敲除减弱SE诱导的Fluoro-Jade B（FJB）和TUNEL阳性神经元的数量(P（P）<0.05与控制siRNA，图1e–h).极限2siRNA还可以阻止SE诱导的卵磷脂信号减少、微管解体和HMGB1向细胞质的移位(P（P）<0.05与控制siRNA，补充图S1d–g). 综上所述，目前的数据表明，LIMK2过度表达可能在坏死性神经元死亡中起重要作用，而不依赖于cofilin磷酸化和F-actin含量。

SE后细胞周期蛋白D1/CDK4激活上调LIMK2表达

为了阐明细胞周期蛋白D1/CDK4复合物与LIMK2表达之间的关系，我们研究了SE后大鼠海马中细胞周期素D1/CDK复合物的表达情况。

SE后一天，细胞周期蛋白D1 mRNA表达增加了非SE水平的2.5倍(P（P）<0.05与非SE动物，补充图S2a). 细胞周期蛋白D1 mRNA表达是SE后2天非SE水平的1.43倍(P（P）<0.05与SE后1天，补充图S2a). 细胞周期蛋白D1蛋白表达在SE后1天和2天分别是非SE水平的3.51倍和2.72倍(P（P）<0.05与非SE动物，补充图S2b和c). 在SE后1-2天，CDK4 mRNA/蛋白表达显著升高，是非SE水平的1.58–1.75倍(P（P）<0.05与非SE动物，补充图S2a–c). SE后活性caspase-3未发生改变(补充图S2b和c). SE后CA1锥体细胞中可见Cyclin D1和CDK4免疫反应(补充图S2d). SE后一天，23%的cyclin D1阳性神经元表达LIMK2。细胞周期蛋白D1在LIMK2阳性神经元中的表达是LIMK2-阴性神经元的0.37倍(P（P）<0.05与LIMK2-阴性神经元，补充图S2e和f). SE后2天，只有7%的cyclin D1阳性神经元表达LIMK2。此外，11%的TUNEL阳性神经元显示cyclin D1免疫反应(补充图S2f).

与报道的LIMK2作为细胞周期蛋白D1转录诱导阻遏物的功能一致，17 LIMK2（极限状态2）siRNA提高SE诱导的细胞周期蛋白D1 mRNA/蛋白表达(图2a-d).LIMK2（极限状态2）siRNA不影响SE诱导的CDK4 mRNA/蛋白的表达(图2a-c). Flavopiridol（一种细胞周期蛋白D1/CDK4抑制剂）显著降低细胞周期蛋白D1、CDK4和LIMK2的mRNA/蛋白表达水平(图2e–g)减少SE诱导的神经元死亡(图2h和i). 这些发现表明，LIMK2可能是细胞周期蛋白D1/CDK4介导的神经元死亡的重要下游成分之一，LIMK过度表达可能是抑制SE诱导的细胞周期蛋白D_1表达的负反馈反应。

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SE后LIMK1和cyclin D1/CDK4复合物的相互调节(一——d日)LIMK2（极限状态2）siRNA可提高SE诱导的细胞周期蛋白D1 mRNA/蛋白表达水平。LIMK2（极限状态2）siRNA不能影响SE诱导的CDK4 mRNA/蛋白表达水平*P（P）<0.05与非SE动物#P（P）<0.05与对照siRNA融合动物(n个分别=5）。巴=12.5μ米(e（电子）——克)Flavopiridol（一种细胞周期蛋白D1/CDK4抑制剂）显著降低了周期蛋白D1、CDK4和LIMK2 mRNA/蛋白的表达水平*P（P）<0.05与非SE动物。#P（P）<0.05与车用动物(n个分别=5）。(小时和我)Flavopiridol减弱SE诱导的FJB阳性神经元数量。Bar=50μ米*P（P）<0.05与车辆

第27页基普1是SE诱导的LIMK2介导的神经元死亡的调节器

第27页基普1是已知的与细胞周期蛋白D1/CDK4复合物结合的内源性CDK抑制剂。20因此，我们检查了p27之间的关系基普1和LIMK2在SE诱导的神经元死亡中的表达。

SE降低p27基普1SE易感CA1锥体细胞的免疫反应(图3a). 第27页基普1在SE后1-3天，mRNA下降至非SE水平的0.58–0.75倍(图3b). 第27页基普1SE后3天，蛋白表达也降低到非SE水平的0.48倍(图3c和d).LIMK2（极限状态2）siRNA不能阻止p27的下调基普1SE诱导的表达(图3c和d). 随着多西环素（DOX）增加p27基普1通过上调辅因子表达的基因启动子反式激活，21,22我们应用DOX来增加p27基普1SE诱导前表达。正如预期的那样，DOX显著增加了p27基普1mRNA/蛋白表达、cofilin表达、pLIMK2 T505和pCofilin水平(P（P）<0.05与车辆，图3e–g). 相反，DOX阻止了SE诱导的细胞周期蛋白D1、CDK4和LIMK2 mRNA/蛋白表达的上调(P（P）<0.05与车辆，图3e–g). 免疫荧光研究表明，DOX抑制了p27的减少基普1SE后CA1神经元cyclin D1的表达及诱导(图3h). 此外，DOX可减轻SE诱导的神经元死亡(P（P）<0.05与车辆，图3i和j). 这些发现表明p27减少基普1SE后通过cyclin D1诱导，LIMK2表达上调。

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p27的作用基普1LIMK2介导SE诱导的神经元死亡(一)SE减少p27基普1易受SE损伤的CA1锥体细胞的免疫反应。钢筋=400μ米(b条和c（c）)第27页基普1SE降低mRNA/蛋白表达*P（P）<0.05与非SE动物(n个分别=5）。(d日)LIMK2（极限状态2）siRNA不影响p27基普1SE后的蛋白质水平*P（P）<0.05与非SE动物(n个分别=5）。(e（电子）——克)DOX显著增加cofilin和p27基普1mRNA/蛋白质表达水平与LIMK2 T505和cofilin磷酸化(P（P）<0.05与载体），而降低SE诱导的细胞周期蛋白D1、CDK4和LIMK2 mRNA/蛋白表达水平*P（P）<0.05与车辆(n个分别=5）。(小时)DOX有效防止SE诱导的p27减少基普1表达并伴有细胞周期蛋白D1表达减少。条形=50μ米(我和j个)DOX可有效减少SE诱导的FJB阳性神经元数量。Bar=50μ米*P（P）<0.05与车辆(n个分别=5）

Rho激酶（ROCK），非NFκB、 通过减少p27增加cyclin D1的表达基普1SE诱导的表达

核因子κB（NFκB） 介导的信号调节细胞周期蛋白D1和p27基普1表达式。23,24此外，p65-Ser536 NFκB磷酸化与SE诱导的神经元死亡密切相关。25因此，我们研究了NF的作用κSE诱导B细胞周期蛋白D1和LIMK2表达。

SN50（纳滤κB抑制剂）处理不影响p27基普1SE诱导的细胞周期蛋白D1、CDK4和LIMK2 mRNA/蛋白表达水平(图4a、b和d). SN50增加了LIMK2 T505（不是S283或S291+293）和cofilin磷酸化(P（P）<0.05与车辆，图4b和d). 然而，SN50并没有减弱SE诱导的神经元死亡(图4e和f). 这些发现表明NFκB信号可能不参与SE诱导的神经元死亡，尽管它可能通过未知途径降低LIMK2和cofilin磷酸化。连同相关数据LIMK2（极限状态2）我们的数据表明，cofilin和LIMK2磷酸化可能不涉及神经元死亡。

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ROCK和NF的作用κLIMK2中的B介导SE诱导的神经元死亡(一——d日)Y-27632（岩石抑制剂），而非SN50（NF-κB抑制剂），增加p27基普1SE.Y-27632（而非SN50）后mRNA/蛋白表达降低了细胞周期蛋白D1、CDK4和LIMK2的表达水平。Y-27632还降低LIMK2 T505（不是S283或S291+293）和cofilin磷酸化*P（P）<0.05与车辆(n个分别=5）。(e（电子）和（f）)Y-27632而非SN50减弱SE诱导的FJB阳性神经元数量。Bar=50μ米*P（P）<0.05与车辆(n个分别为5）

ROCK活性调节细胞周期蛋白D1、p27基普1和LIMK2功能，26我们在SE诱导前应用Y-27632（一种ROCK抑制剂）来验证ROCK在SE诱导的神经元死亡中的作用。Y-27632输注增加p27的表达基普1SE后mRNA/蛋白质(P（P）<0.05与车辆，图4a、c和d). 相反，Y-27632降低了细胞周期蛋白D1、CDK4和LIMK2的表达水平(P（P）<0.05与车辆，图4a、c和d). Y-27632还降低了LIMK2 T505（不是S283或S291+293）和cofilin磷酸化(P（P）<0.05与车辆，图4a、c和d). 此外，Y-27632减轻了SE诱导的神经元死亡(P（P）<0.05与车辆，图4e和f). 这些发现表明，ROCK激活可能通过减少p27参与SE诱导的神经元死亡基普1表达式。

LIMK2介导的神经元死亡是受体相互作用蛋白激酶1（RIP1）非依赖性程序性坏死

细胞凋亡和坏死是两种主要的细胞死亡模式。27凋亡是一个涉及半胱氨酸蛋白酶caspase家族的高度调控过程。28相反，坏死是一种被动的、不受调控的细胞死亡形式。RIP1可以介导一些坏死，29,30这被称为程序性坏死或坏死下垂。31,32因此，我们进一步研究了神经元死亡过程中LIMK2过度表达与caspase介导的凋亡或RIP1介导的坏死的关系。

在本研究中，SE不影响Rb、pRb和活性caspase-3的表达，但增加了E2F1的表达(P（P）<0.05与非SE动物，图5a和b).LIMK2（极限状态2）siRNA、DOX、黄哌啶醇和Y-27632抑制了SE诱导的E2F1诱导，但增加了Rb表达，而Rb磷酸化没有改变(P（P）<0.05与载体或控制siRNA，图5a和b). 这些发现表明LIMK2介导的神经元死亡可能与细胞凋亡无关。

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LIMK2通过caspase-3或RIP1非依赖性途径介导神经元死亡。(一和b条)SE增加E2F1的表达，但不影响Rb、pRb和活性caspase-3的表达水平。极限2siRNA、DOX、flavopiridol和Y-27632增加Rb的表达，而LIMK2（极限状态2）siRNA、黄哌啶醇和Y-27632输注不会影响Rb S780磷酸化。此外，LIMK2（极限状态2）siRNA、DOX、flavopiridol和Y-27632降低SE增加的E2F1表达，并且不影响SE后活性caspase-3的表达。SE不影响RIP1的表达。LIMK2（极限状态2）siRNA、DOX、flavopiridol和Y-27632不影响SE诱导的RIP1表达。NEC-1（RIP1抑制剂）不改变SE诱导的LIMK2、Rb、pRb、活性caspase-3和RIP1的表达，而降低E2F1的表达*P（P）<0.05与非SE动物#P（P）<0.05与载体或控制siRNA(n个分别=5）。(c（c）和d日)NEC-1不影响SE诱导的神经元死亡(n个分别=5）。条形=50μ米

为了证实LIMK2在RIP1介导的坏死中的作用，我们研究了SE后RIP1的表达。SE不影响RIP1表达。LIMK2（极限状态2）siRNA、DOX、黄哌啶醇和Y-27632在SE后不影响RIP1的表达(图5a和b). 坏死抑素-1（NEC-1，一种RIP1抑制剂）不影响LIMK2、Rb、pRb、活性caspase-3和RIP1水平的变化，但抑制了SE后E2F1的诱导(P（P）<0.05与车辆，图5a和b). NEC-1没有减弱SE诱导的神经元死亡(P（P）<0.05与车辆，图5c和d). 这些发现表明LIMK2介导的神经元死亡可能不是RIP1介导的坏死视疲劳。再加上HMGB1移位到细胞质、肿胀的树突、微管解体和细胞核固缩，我们的发现表明LIMK2介导的神经元死亡可能是RIP1非依赖性程序性坏死。

LIMK2介导的动态相关蛋白-1（DRP1）抑制通过线粒体分裂功能障碍诱导神经元死亡

剩下的问题是效应器参与LIMK2介导的程序性坏死神经元死亡。最近，肌动蛋白丝的过度稳定抑制了分裂蛋白DRP1与线粒体的结合，导致线粒体伸长和随后的神经毒性。33与神经元相反，HT-29和HeLa细胞的坏死诱导通过去磷酸化S637位点激活DRP1。34DRP1是一种可溶性细胞溶质蛋白，在线粒体小管周围聚集成螺旋丝。S637通过蛋白激酶A磷酸化DRP1，通过增强DRP1与线粒体的分离来抑制分裂。S616的DRP1磷酸化通过细胞周期蛋白B–CDK1–RALA结合蛋白1（RALBP1）复合体激活线粒体分裂。35因此，我们研究了LIMK2介导的神经元死亡是否与线粒体分裂功能障碍有关。

在本研究中，SE降低了DRP1的表达和DRP1 S616/S637的磷酸化比率，尽管它提高了RALBP1的表现(P（P）<0.05与非SE动物，图6a–d).LIMK2（极限状态2）siRNA、DOX、黄哌啶醇和Y-27632治疗有效地阻止了SE诱导的这些变化(P（P）<0.05与载体或对照siRNA，图6a–d). 此外，SE增加了CA1神经元的线粒体长度和球体形成(P（P）<0.05与非SE动物，图7a和b).LIMK2（极限状态2）siRNA、DOX、黄哌啶醇和Y-27632处理有效地阻止SE诱导的线粒体伸长和球体形成(P（P）<0.05与载体或控制siRNA，图7a和图b).

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LIMK2介导SE后DRP1表达下调(一——d日)SE显著升高RALBP1，但降低DRP1表达和DRP1 S616/S637磷酸化。LIMK2（极限状态2）siRNA、DOX、黄哌啶醇和Y-27632有效地阻止SE诱导的这些变化*P（P）<0.05与非SE动物#P（P）<0.05与载体或控制siRNA(n个分别=5）

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LIMK2介导SE诱导的线粒体分裂功能障碍(一和b条)SE显著增加线粒体长度和球体形成。Mdivi-1（5和50μM） 有效增加SE诱导的线粒体长度。LIMK2（极限状态2）siRNA阻止SE诱导的线粒体长度延长。Bar=6.25μ米*P（P）<0.05与非SE动物。#P（P）<0.05与载体或控制siRNA(n个分别=5）。(c（c）和d日)Mdivi-1（5和50μM） SE.Bar=100后死亡神经元数量显著增加μ米*P（P）<0.05与车辆(n个分别=5）

为了解决线粒体分裂减少是否促进神经元细胞死亡以应对SE的问题，我们在SE之前应用了Mdivi-1（DRP1抑制剂）和WY 14643（线粒体分裂事件增强剂）。36,37与车辆相比，Mdivi-1（5和50μM） SE诱导的线粒体延长和神经元死亡增加。Mdivi-1的最低剂量（0.5μM） 没有影响他们(图7c和d). Mdivi-1（50μM） 不影响SE诱导的LIMK2过表达(图7a). 这些发现表明，由于DRP1活性的进一步降低，Mdivi-1可能恶化LIMK2介导的线粒体任务功能障碍。与Mdivi-1相比，WY 14643（150μM） 与载体相比，非SE动物线粒体长度减少(P（P）>0.05与车辆；图8a和图b). 低剂量（50和100μM） WY 14643对非SE动物的线粒体长度没有影响（数据未显示）。此外，WY 14643增加了DRP1 S616磷酸化和DRP1 S416/S637磷酸化比率，而没有改变DRP1表达及其S637磷酸化(P（P）<0.05与车辆；图8c–e). WY 14643有效阻止SE诱导的线粒体伸长和球体形成(P（P）<0.05与车辆；图8a和b). WY 14643减轻了SE诱导的神经元损伤，并伴有DRP1表达和S616磷酸化的降低(P（P）<0.05与车辆；图8c–g). WY 14643还抑制SE诱导HMGB1向细胞质的移位(补充图S3a–c). 这些发现表明，LIMK2-DRP1介导的线粒体断裂功能障碍可能在程序性坏死细胞死亡中起重要作用。

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WY 14643（150）的影响μM） SE后线粒体分裂和神经元死亡(一和b条)WY 14643治疗有效防止SE诱导的线粒体长度延长。Bar=6.25μ米*P（P）<0.05与非SE组中的车用动物#P（P）<0.05与SE组中的车用动物(n个分别=5）。(c（c）——e（电子）)WY 14643阻止SE诱导的DRP1表达和DRP1 S616/S637磷酸化的改变，但不阻止LIMK2表达的改变*P（P）<0.05与非SE组中的车用动物。#P（P）<0.05与SE组中的车用动物(n个分别=5）。(（f）和克)WY 14643减轻了SE后死亡神经元的数量。Bar=100μ米*P（P）<0.05与车辆(n个分别=5）

讨论

在此，我们描述了LIMK2在DRP1介导的线粒体动力学功能障碍中诱导程序性坏死神经元死亡的先前未被怀疑的作用。LIMK2是通过辅肌动蛋白磷酸化进行肌动蛋白聚合的调节剂之一。LIMK2也在与肌动蛋白无关的事件中发挥作用，例如抑制细胞周期蛋白D1。17在本研究中，SE增加了濒死神经元中LIMK2的表达，作为抑制SE诱导的细胞周期蛋白D1表达的负反馈反应。此外，LIMK2（极限状态2）siRNA可减轻SE引起的坏死性神经元损伤。这些结果表明LIMK2可能是细胞周期蛋白D1/CDK4介导的神经元死亡的重要分子之一。

细胞周期蛋白D1/CDK4复合体在有丝分裂后神经元中的调控信号通路尚不清楚。无论潜在机制如何，已有报道称，ROCK抑制剂对各种神经元损伤具有神经保护作用。38,39在本研究中，ROCK抑制剂通过增强p27下调SE诱导的细胞周期蛋白D1、CDK4和LIMK2的表达基普1表达式。此外，p27升高基普1DOX的表达阻止了SE诱导的神经元死亡。这些发现首次证明了p27通过异常细胞周期重新进入ROCK介导的神经元死亡的潜在机制基普1抑制。另一方面，cofilin磷酸化对p27诱导的影响基普1尽管cofilin表达增加诱导p27，但其表达未知基普1基因启动子反式激活。21,22在本研究中，DOX增加了cofilin磷酸化/表达，同时增加了p27基普1表达式。然而，SN50增加了cofilin磷酸化，但没有改变cofillin和p27基普1表达水平。这些发现表明，cofilin的表达，而不是磷酸化，可能会影响其对p27的效率基普1基因启动子反式激活。因此，我们的发现表明p27的恢复基普1通过调节ROCK活性或cofilin表达可能是一种新的治疗cyclin D1/CDK4介导的神经退行性变的策略。

预防SE的低氧、低血压、低血糖和高热等并发症并不能抑制神经元死亡。40,41SE诱导的神经元死亡是形态学上的坏死，而不是凋亡。9,10,11,12然而，退化的神经元也表现出凋亡事件。42因此，是否坏死或凋亡是癫痫发作诱导神经元死亡的主要过程尚存在争议。在本研究中，SE增加了LIMK2和HMGB1从细胞核到细胞质的易位，但不影响Rb、pRb、活性caspase-3或RIP1的表达。LIMK2（极限状态2）siRNA减弱了SE诱导的坏死变性，其特征是HMGB1移位到细胞质，树突肿胀，微管解体，细胞核固缩。总之，我们的发现表明LIMK2可能参与RIP1非依赖性程序性坏死细胞死亡，但不参与细胞周期蛋白D1-Rb-E2F-caspase依赖性凋亡。

本研究中最有趣的发现是，LIMK2通过下调DRP1表达和DRP1 S616/S637磷酸化比率来调节线粒体肿胀和线粒体分裂，这与程序性坏死期间肌动蛋白聚合无关。最近，据报道，由于抑制DRP1，tau对F-actin的过度稳定对神经毒性至关重要。33因此，LIMK2过表达可能通过增加肌动蛋白的稳定性来抑制线粒体分裂。然而，在本研究中，SE降低了F-actin含量、DRP1表达和DRP1 S616/S637磷酸化比率，而增加了线粒体长度和球体形成。LIMK2（极限状态2）siRNA、flavopiridol、Y-27632和DOX可阻止SE诱导的这些病理变化。此外，WY 14643显著减弱SE诱导的线粒体延长和神经元死亡，而Mdivi-1则增加了这些变化。线粒体分裂的丢失会导致线粒体分离不当，ATP水平降低。33抑制DRP1诱导的延长线粒体不能正确定位于树突或轴突，并抑制外周部位的ATP供应。41,42DRP1缺失也会导致线粒体呼吸功能受损，这是由于氧化应激导致活性氧的产生进一步增加。43,44在培养的出生后小鼠皮层神经元中，DRP1过表达增强了神经元的活力，并在DNA损伤后恢复了线粒体形态的正常模式。45此外，DRP1是细胞色素正常率所必需的c（c）凋亡过程中的释放和caspase激活。46因此，我们的研究结果表明，LIMK2过度表达可能通过DRP1介导的线粒体分裂功能障碍导致神经元死亡，DRP1表达下调可能加速坏死而非凋亡。

在本研究中，我们无法直接探讨LIMK2抑制DRP1表达水平的机制。然而，LIMK2可能通过细胞周期相关事件来调节DRP1的表达，这一点目前尚不清楚。喇叭等。47据报道，当细胞进入G1期时，DRP1水平下降，反过来，在G1/S期阻滞释放后，DRP2水平逐渐升高。由于细胞周期蛋白D1是G1/S转换所必需的，并且LIMK2抑制细胞周期蛋白D1的表达，17细胞周期蛋白D1的过度表达和LIMK2的过度表达可导致神经元出现G1/S阻滞样状态，使DRP1水平持续下降。需要进一步研究来阐明LIMK2介导的DRP1抑制的确切机制。

RALBP1是磷酸化DRP1 S616的关键参与者，DRP1是线粒体断裂的效应器。33在本研究中，SE增加了RALBP1的表达，尽管它减少了线粒体分裂。此外，LIMK2（极限状态2）siRNA、flavopiridol、Y-27632和DOX有效地阻止了SE诱导的坏死性神经元死亡和RALBP1表达上调。这些发现表明RALBP1可能与DRP1相关的神经元死亡无关。RALBP1是一种具有多特异性转运活性的应激反应性多功能蛋白。48RALBP1占谷胱甘肽结合物运输的80%。48此外，阻断RALBP1功能细胞会导致4-羟基壬醛（脂质过氧化的产物）及其GSH-结合物的积累，从而发生大规模凋亡。14,49因此，上调RALBP1可能是氧化应激反应中常见的代偿现象之一，而非线粒体分裂。

总之，我们提供了新的证据证明ROCK-p27基普1-细胞周期蛋白D1-CDK4-LIMK2-DRP1介导的信号通过微软骨功能障碍与神经元坏死而非凋亡相关(补充图S4). 据我们所知，本研究首次提出RIP依赖性程序性坏死在神经元变性中的作用。除了对神经元死亡的新见解外，这种调节途径将成为与程序性坏死或异常细胞周期有关的各种疾病的一个有趣而重要的治疗靶点。

材料和方法

实验动物和化学品

本研究使用的雄性Sprague-Dawley大鼠（7周龄）来自韩国春川哈利姆大学实验动物中心。这些动物被提供了商业饮食和水随意在受控温度、湿度和照明条件下（22±2°C、55±5%和12:12光/暗循环）。动物实验方案由Hallym大学（韩国春川）动物护理和使用委员会批准。在所有情况下，使用的动物数量和它们的痛苦都降到了最低。除注明外，所有试剂均来自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。

手术、药物输注和LIMK2击倒

将动物分为六组进行侧脑室内药物输注：（1）溶媒，（2）Flavo（50μM） （3）Y-27632（10）μM） ，（4）NEC-1（900μM） ，（5）Mdivi-1（0.5、5和50μM） ，或（6）WY 14643（50、100和150μM） 1组腹腔注射DOX（50 mg/kg）。将动物麻醉（Zolritil，50 mg/kg，I.M.Virbac Laboratories，Carros，France）并置于立体定位架中。对于渗透泵植入，在颅骨中钻孔，用于将脑灌注试剂盒1（Alzet，Cupertino，CA，USA）引入右侧脑室（后部1mm；横向1.5 mm；−3.5 mm深）。50输液盒用牙科粘接剂密封，并连接到渗透泵（1007D，Alzet）。泵被放置在背部的皮下袋中。动物接受0.5μ车辆或化合物超过1周的l/h。51为了击倒LIMK2，我们在目标上应用了一组四个LIMK2（极限状态2）使用大鼠siRNA和非靶向对照。其中，一个21-nt siRNA序列靶向LIMK2（极限状态2）对应编码区（5′→3′）：意义：GCACCUUACGCAAGAGAGUGUU，反义：UCACUCUUGCGUAAGGUGCUU被选为最佳探针（还原效率，在对照条件下为79.41%），并用于最终实验。使用非沉默RNA作为对照siRNA。使用1002个渗透微型泵（0.35 mg/天盐水中的siRNA，ALZET渗透泵，加利福尼亚州库比蒂诺，美国）在2周内注入siRNA。药物和siRNA的剂量是根据初步研究选择的，研究表明，达到所选剂量的给药耐受性良好，没有观察到神经毒性迹象（后肢麻痹、发声、进食或神经解剖损伤）。在初步研究中，每种化合物和siRNA的剂量被确定为不影响癫痫发作阈值的最高剂量。手术后立即开始注入这些化合物或siRNA。在SE诱导前，允许大鼠从手术过程中恢复3天。

SE感应

术后3天，在甲基东莨菪碱（5 mg/kg，i.p.）作用20分钟后，用毛果芸香碱（380 mg/kg，i.p.）治疗大鼠。在SE发病2小时后给予安定（10 mg/kg，i.p.），并根据需要重复。

组织加工

在指定的时间点，在氨基甲酸乙酯麻醉（1.5 g/kg，i.p.）下，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）经心灌注动物，然后在0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中灌注4%多聚甲醛。将大脑取出并在同一固定液中固定4小时。大脑用30%蔗糖浸泡过夜，冷冻并在30℃用冷冻器切片μm、 并将连续切片保存在含有PBS的六孔板中。整个海马的序列中的每六个切片用于体视学研究。52

免疫组织化学

表1提供了使用的主要抗体的列表。切片在含有0.3%Triton X-100的PBS抗血清混合物中在室温下培养过夜。在用PBS清洗三次10分钟后，切片也在FITC-和Cy3-结合次级抗血清（或链霉亲和素，1:250，Amersham，Piscataway，NJ，USA）的混合物中在室温下培养2小时。部分切片用于常规免疫组化研究。用PBS清洗切片三次，每次10分钟，并将其安装在涂有明胶的载玻片上。所有图像都是使用Axio Imager M2显微镜和AxioVision Rel.4.8软件（韩国首尔卡尔蔡司）拍摄的。为了定量分析荧光强度，通过CCD摄像机（韩国卡尔蔡司）连接到PC显示器（韩国首尔三星）的显微镜观察切片（每只动物15个切片）。通过使用Adobe PhotoShop v.8.0（加利福尼亚州圣何塞，美国）调整图像的黑白范围，对每个图像进行标准化。此后，使用NIH Image 1.59软件将强度测量值表示为256灰度级的数量(http://rsb.info.nih.gov/nih-image/download.html). 通过减去从五个图像输入获得的背景噪声的平均值来校正光学密度值。然后通过设置阈值水平来标准化光密度。

表1

本研究中使用的初级抗体
抗原主机制造商（目录号）使用的稀释
活性半胱天冬酶-3兔子Abcam（ab13847，马萨诸塞州剑桥，美国）IF 1:200，WB 1:1000
川东北4鼠标阿比奥泰克（251727，加利福尼亚州圣地亚哥，美国）如果1:200，WB 1:500
肌动蛋白解聚因子兔子西格玛（C8736，密苏里州圣路易斯，美国）WB 1:20k
细胞周期蛋白D1鼠标阿布卡姆（ab6152）IF 1:2000，WB 1:1000
DRP1（DRP1）兔子Thermo（美国新罕布什尔州哈德逊市PA1-16987）工作分解结构1:1000
E2F1系列鼠标Abcam（ab4070）工作分解结构1:1000
直线电机1兔子阿布卡姆（ab81046）工作分解结构1:1000
LIMK2（极限状态2）兔子西格玛（HPA008183）如果1:100，WB 1:1000
线粒体标记鼠标阿布卡姆（ab14705）如果1:500
第27页基普1兔子阿布卡姆（ab7961）如果1:100，WB 1:500
pCofilin蛋白兔子阿布卡姆（ab47281）工作分解结构1:2000
pDRP1 S616系列兔子细胞信号（4494，丹弗斯，马萨诸塞州，美国）工作分解结构1:1000
pDRP1 S637系列兔子细胞信号传导（4867）WB 1：1000
pLIMK2 S283型兔子Assay Biotech（美国加利福尼亚州桑尼维尔A8045）如果1:100，WB 1:1000
pLIMK2 S291+293兔子阿布卡姆（ab76284）如果1:100，WB 1:500
pLIMK2 T505型兔子阿布卡姆（ab38499）如果1:100，WB 1:1000
pRb S780型兔子Abcam（ab47763）如果1:100，WB 1:1000
RALBP1型兔子阿布卡姆（ab133549）如果1:200，WB 1:5000
卢比兔子Abcam（ab85607）IF 1:200，WB 1:1000
安息兔子阿布卡姆（ab106393）工作分解结构1:1000
β-肌动蛋白鼠标西格玛（A5316）工作分解结构1:5000
HMGB1标准兔子阿布坎（ab18256）如果1:100

缩写：IF，免疫荧光；WB、western印迹

TUNEL染色

根据制造商的方案，使用TUNEL凋亡检测试剂盒（Upstate，Lake Placid，NY，USA）进行TUNEL染色(http://www.upstate.com). TUNEL反应后，进行LIMK2或cyclin D1免疫荧光染色。对于细胞核反染色，我们使用了带有DAPI（Vector，Burlingame，CA，USA）的Vectashilder安装介质。所有图像都是使用Axiocam HRc相机和Axio Vision 3.1软件（韩国卡尔蔡司）拍摄的。

FJB染色

FJB染色鉴定变性神经元。简单地说，切片在蒸馏水中冲洗，然后装在涂有明胶的载玻片上，然后在载玻片加热器上干燥。将载玻片浸泡在100%乙醇中3分钟，然后将70%乙醇浸泡2分钟，将蒸馏水浸泡2分钟。然后将载玻片转移到0.06%高锰酸钾中15分钟并轻轻搅拌。在蒸馏水中冲洗2分钟后，将载玻片在0.001%FJB（Histo Chem Inc.Jefferson，AR，USA）中孵育30分钟，FJB是通过将20毫升0.01%的FJB储备溶液添加到180毫升0.1%的乙酸中而新鲜制备的，在黑暗中轻轻摇动在三次更换蒸馏水的过程中，每次更换min，将载玻片干燥，在二甲苯中脱水，并用DPX覆盖玻片。在体视学研究中，使用了整个海马体的序列中的每六个部分（见下文）。

体视学

海马体积(V（V）)根据基于改良卡瓦列里法的公式进行估算：V（V）=∑a×t吨标称×1/ssf，其中一是AxioVision Rel.4.8软件测量的描绘子场区域的面积，t吨笔名是标称截面厚度（30μm），ssf是采样截面的分数或截面采样分数（本研究为1/6）。体积报告为mm三用2.5倍物镜描绘出副视野区域。52光学分馏器用于估计细胞数。光学分馏器（与光学分离机进行计数和分馏取样相结合）是一种体视学方法，其基础是设计合理的系统随机取样方法，根据定义，该方法可对种群数量进行无偏估计。采样过程是通过聚焦组织的深度来完成的（光学分光器高度，小时; 第页，共15页μ在本研究的所有情况下均为m）。每个单元类型的数量(C类)在每个分区中，估计如下：C类=∑Q−×t吨/小时×1/asf×1/ssf，其中问−是在采样截面上所看到的子区域截面轮廓内，在分割器中实际计数的细胞数，asf是由分割器计数框面积a（框）（50×50）计算的面积采样分数μ米2以及与每个x，y运动、网格（x，y步长）（250×250）相关的面积μ米2在本研究中）（asf=（a（帧）/a（x，y步长））。用×40物镜计数细胞。CA1锥体细胞的单个线粒体长度(n个=20/节），也使用AxioVision Rel.4.8软件用×100物镜进行测量。细胞计数和线粒体长度的测量由两名不同的研究人员进行，他们对组织的分类一无所知。52

蛋白质印迹

将组织裂解物蛋白装入10%的聚丙烯酰胺凝胶中。电泳后，将凝胶转移至硝化纤维素转移膜（Schleicher and Schuell BioScience Inc.，Keene，NH，USA）。为了减少背景染色，过滤器在含有0.1%吐温20的TBS中与5%脱脂奶粉孵育45分钟，然后首先与一级抗体孵育(表1)随后与HRP结合的二级抗体结合。使用ECL Western blotting检测试剂盒（Amersham）进行Western blotting。强度测量值表示为256灰度级上的平均灰度值。51

RNA提取、逆转录和实时定量PCR

根据制造商的方案（Ambion，Austin，TX，USA），将脑组织匀浆，并使用Trizol试剂提取总RNA。使用PrimerScript第一链cDNA合成试剂盒（日本志贺县塔卡拉）将总RNA反向转录成第一链cDNA。使用SYBR Green SuperMix（Bioneer，大田，韩国）在两步PCR反应程序中对mRNA表达进行三次定量，并使用MyiQ单色实时PCR检测系统（Bioner，大田）进行。使用来自RT反应的10微升cDNA作为定量实时PCR反应的模板，最终PCR反应体积为50μl.5′和3′基因特异性PCR引物浓度分别为10 pM。根据每个目标基因的编码序列，使用Primer3软件（美国马萨诸塞州剑桥市怀特黑德研究所）设计实时PCR引物(表2). 在95°C下初始变性3分钟后，在60°C下进行40个周期的引物退火和延伸45秒，然后在95°C下变性10秒。捕获荧光发射数据，并使用阈值循环值（Ct）量化mRNA水平。为了补偿输入RNA量和逆转录效率的变化，将每个样品的mRNA的qPCR数据标准化为管家蛋白GAPDH（GenBank no。BC063166号)由相同的实验确定。

表2

本研究中使用的每个靶基因的编码序列
目标基因序列（5′→3′)
川东北4转发：GCCTGTGGTGTTACGCTCT
 反向：CTGGTCAGCTCCAGAGTTCC
肌动蛋白解聚因子转发：TTCTGGTAGAGAGATGTGGG
 反向：ACCAGGTCCTCCTTCTTGCT
细胞周期蛋白D1转发：GCACAACGCACTTTTTCC
 反面：TCCAGAAGCGCTCAATCTG
DRP1（DRP1）转发：GGTGGAATTGAGATGGTGGTCGGA
 反面：TTCGTGCAACTGAACTGGCCACA
LIMK2（极限状态2）转发：CTTCCTGTGTTGTCCGCGCC
 反向：AGGCCTCGTTGGCTGTCTG
第27页基普1转发：GGTGGACCAAAATGCCTGACT
 反面：GCCCTTTTGTTGCGAAGA
RALBP1型转发：AAGGTTCCTCGAGGTGAGA
 背面：GGAGTCAGACGTGCAAGA
半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3转发：CATGACCCGTCCCTT
 反向：CCGACTTCCTGTATGCTT
图纸-1转发：GGTGGAATTGAGATGGTGGTCGGA
 反向：TTCGTGCAACTGGAACTGGCACA
安息转发：GCTCACCTCCGTGAGTC
 反向：GGAGCTAGGTGCTGGAAGTGG
GAPDH公司转发：TGGAGTCTACTGGTCTTT
 背面：TGTCATTTTCGTGGTTCA

数据分析

使用单因素方差分析对定量测量所得的所有数据进行分析，以确定统计显著性。Bonferroni的测试用于事后的，事后的比较。A类P（P）-值<0.05被认为具有统计学意义。51

致谢

这项工作得到了韩国政府（MEST）资助的韩国国家研究基金会（NRF）的资助（编号：2012R1A2A1A01001775和2009-0093812）。

词汇表

CDK公司细胞周期蛋白依赖激酶
卢比视网膜母细胞瘤蛋白
E2F（E2F）E2启动子结合因子
LIMK公司LIM激酶
东南方癫痫持续状态
DOX公司强力霉素
法国试验标准κB类核因子-kappa B
岩石Rho激酶
独立电源1受体相互作用蛋白激酶1
NEC-1号机组坏死抑制素-1
美国公共广播电视公司磷酸盐缓冲盐水
FJB公司荧光翡翠B
DRP1（DRP1）动态相关蛋白-1
RALBP1型RALA结合蛋白1
HMGB1标准高移动性分组盒1

笔记

作者声明没有利益冲突。

脚注

补充信息附在细胞死亡和分化网站上的这篇论文(http://www.nature.com/cdd)

L Greene编辑

补充材料

补充图S1

补充图S2

补充图S3

补充图S4

补充图形图例

工具书类

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文章来自细胞死亡与分化由以下人员提供自然出版集团