EMBO J。2012年3月7日;31(5): 1095–1108.
溶酶体-细胞核信号机制通过mTOR和TFEB感应和调节溶酶体
,1,2,三,* ,4,5,6,* ,1 ,1,2,三 ,2 ,2,三 ,2,三 ,7 ,7 ,8 ,9 ,4,5,6,10,11和a、,1,2,三,12
卡明·塞滕布雷
1意大利那不勒斯Telethon遗传与医学研究所(TIGEM)
2美国德克萨斯州休斯顿贝勒医学院分子与人类遗传学系
三Jan和Dan Duncan神经研究所,德克萨斯州休斯顿儿童医院,美国德克萨斯州休斯敦
罗伯托·宗库
4美国马萨诸塞州剑桥市九剑桥中心怀特海生物医学研究所
5美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院(MIT)生物系
6美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院大卫·H·科赫综合癌症研究所
迭戈·L·麦地那
1意大利那不勒斯Telethon遗传与医学研究所(TIGEM)
弗朗西斯科·维特里尼
1意大利那不勒斯Telethon遗传与医学研究所(TIGEM)
2美国德克萨斯州休斯顿贝勒医学院分子与人类遗传学系
三Jan和Dan Duncan神经研究所,德克萨斯州休斯顿儿童医院,美国德克萨斯州休斯敦
塞尔坎·埃尔丁
2美国德克萨斯州休斯顿贝勒医学院分子与人类遗传学系
SerpilUckac埃尔丁
2美国德克萨斯州休斯顿贝勒医学院分子与人类遗传学系
三Jan和Dan Duncan神经研究所,德克萨斯州休斯顿儿童医院,美国德克萨斯州休斯敦
Tuong Huynh公司
2美国德克萨斯州休斯顿贝勒医学院分子与人类遗传学系
三Jan和Dan Duncan神经研究所,德克萨斯州休斯顿儿童医院,美国德克萨斯州休斯敦
马修·费隆
7美国纽约哥伦比亚大学外科医生学院遗传与发展系
卡尔桑迪
7美国纽约哥伦比亚大学外科医生学院遗传与发展系
米歇尔·维拉德
8美国加利福尼亚州诺瓦托BioMarin Pharmaceutical Inc
瓦莱丽亚·法奇内蒂
9德克萨斯大学癌症免疫研究中心免疫学系MD Anderson癌症中心,德克萨斯州休斯顿,美国
大卫·M·萨巴蒂尼
4美国马萨诸塞州剑桥市九剑桥中心怀特海生物医学研究所
5美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院生物系
6美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院大卫·H·科赫综合癌症研究所
10美国马萨诸塞州剑桥市布罗德学院七剑桥中心
11霍华德·休斯医学院,麻省理工学院,美国马萨诸塞州剑桥
安德烈亚·巴拉比奥
1意大利那不勒斯Telethon遗传与医学研究所(TIGEM)
2美国德克萨斯州休斯顿贝勒医学院分子与人类遗传学系
三Jan和Dan Duncan神经研究所,德克萨斯州休斯顿儿童医院,美国德克萨斯州休斯敦
12意大利那不勒斯费德里科二世大学儿科医学遗传学系
1意大利那不勒斯Telethon遗传与医学研究所(TIGEM)
2美国德克萨斯州休斯顿贝勒医学院分子与人类遗传学系
三Jan和Dan Duncan神经研究所,德克萨斯州休斯顿儿童医院,美国德克萨斯州休斯敦
4美国马萨诸塞州剑桥市九剑桥中心怀特海生物医学研究所
5美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院(MIT)生物系
6美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院大卫·H·科赫综合癌症研究所
7美国纽约哥伦比亚大学外科医生学院遗传与发展系
8美国加利福尼亚州诺瓦托BioMarin Pharmaceutical Inc
9德克萨斯大学癌症免疫研究中心免疫学系MD Anderson癌症中心,德克萨斯州休斯顿,美国
10美国马萨诸塞州剑桥市布罗德学院七剑桥中心
11美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院霍华德·休斯医学研究所
12意大利那不勒斯费德里科二世大学儿科医学遗传学系
一意大利那不勒斯80131,Via Pietro Castellino 111,Telethon遗传与医学研究所(TIGEM)。电话:+39 081 6132207;传真:+39 081 579 0919;电子邮件:ti.megit@oiballab *这些作者对这项工作贡献均等
2011年12月22日收到;2012年1月27日接受。
这是一篇根据Creative Commons Attribution Non-commercial Share Alike 3.0 Unported License条款发布的开放存取文章,它允许读者修改、转换或构建文章,然后根据与此文章相同或类似的许可将生成的作品分发给此文章。作品必须归原作者所有,未经特别许可,不得用于商业用途。
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补充电影1
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摘要
溶酶体通过控制细胞清除率和能量生成来响应环境提示,在细胞内稳态中发挥关键作用。然而,调节溶酶体适应的机制在很大程度上尚不清楚。在这里,我们发现转录因子EB(TFEB)是溶酶体生物发生的主要调节因子,与溶酶体膜上的主要生长调节因子mTOR复合物1(mTORC1)共定位。当营养物质存在时,mTORC1对TFEB的磷酸化会抑制TFEB活性。相反,mTORC1的药物抑制,以及饥饿和溶酶体破坏,通过促进其核转位激活TFEB。此外,TFEB−/−细胞中溶酶体和自噬基因对溶酶体功能障碍或mTORC1药物抑制的转录反应受到抑制。有趣的是,Rag GTPase复合物感测溶酶体氨基酸并激活mTORC1,对于调节饥饿和应激诱导的TFEB核移位既必要又充分。这些数据表明,溶酶体通过涉及TFEB和mTOR的溶酶体-细胞核信号机制来感应其内容物并调节自身的生物发生。
关键词:自噬、细胞清除、内吞、饥饿
结果
TFEB对溶酶体状态作出反应
我们假设TFEB活性受溶酶体的生理状态调节。因此,我们测试了溶酶体功能的破坏是否对TFEB核转位有影响。用TFEB–3×FLAG质粒瞬时转染HeLa和HEK-293T细胞,并用几种溶酶体功能抑制剂处理过夜,分析TFEB亚细胞定位。这些治疗包括使用氯喹(CQ),一种溶酶体pH梯度的抑制剂,和水杨酰亚胺A(SalA),一个v-ATP酶的选择性抑制剂(谢等人,2004)以及PAT1的过度表达,PAT1是一种氨基酸转运体,可导致氨基酸大量运输出溶酶体腔(Sagne等人,2001年). 免疫荧光分析显示TFEB–3×FLAG在处理的细胞中有显著的核蓄积(). 我们使用检测内源性TFEB的抗体重复了这一分析(补充图S1). 与它们对外源性表达的TFEB的影响类似,氨基酸饥饿和溶酶体应激均诱导内源性TFEB核移位(). 核/细胞质分离后进行的免疫印迹证实了这些观察结果(). 免疫印迹还显示,TFEB核积累与TFEB–3×FLAG向较低分子量的转移有关,表明溶酶体应激可能影响TFEB磷酸化状态().
溶酶体应激诱导TFEB核易位。(一)表达TFEB–3×FLAG的HEK-293T细胞的免疫荧光,经过指定的处理,并用FLAG抗体和溶酶体标记LAMP2染色。合并中的FLAG和LAMP2通道分别为绿色和红色。合并中包括DAPI(蓝色)。比例尺表示10μm。(B类)用核TFEB–3×FLAG定量四种条件下的细胞数量(一). 每个值表示三个独立字段的平均值±标准差N个=300. (C类)按指示处理的HEK-293T细胞的免疫荧光,并用抗内源性TFEB和溶酶体蛋白RagC的抗体染色(合并中分别为绿色和红色)。DAPI包含在合并中。比例尺代表10μm。(D类)用二甲基亚砜、氯喹(CQ)或SalA处理表达TFEB–3×FLAG的HeLa细胞提取的蛋白质进行免疫印迹,进行核/细胞溶质分离,并用FLAG抗体进行印迹以检测TFEB。H3和微管蛋白分别用作细胞核和胞质标志物。印迹是三次重复实验的代表。
mTORC1调节TFEB亚细胞定位
根据mTORC1存在于溶酶体膜上的观察,其活性取决于营养物质和溶酶体功能(Sancak等人,2010年;Zoncu等人,2011年a)我们推测溶酶体应激对TFEB核转位的影响可能由mTORC1介导。与这一观点一致的是,通过已知mTORC1底物p-P70S6K的水平测量,氯喹或SalA抑制mTORC1活性(;Zoncu等人,2011年a). mTOR的参与与我们之前的观察结果形成对比,即已知的mTOR抑制剂雷帕霉素不影响TFEB活性。然而,最近的数据表明,雷帕霉素是mTOR的部分抑制剂,因为在该药物存在下,一些底物仍然有效磷酸化(Thoreen等人,2009年). 因此,我们使用了激酶抑制剂Torin 1和Torin2,它们属于一类新的分子,靶向mTOR催化位点,从而完全抑制mTOR活性(Feldman等人,2009年;Garcia-Martinez等人,2009年;Thoreen等人,2009年).
mTORC1调节TFEB。(一)溶酶体应激抑制mTOR信号传导。如图所示,对从HeLa细胞中分离的蛋白质提取物进行免疫印迹。用抗p-T202/Y204-ERK1/2、ERK1/2、p-T389-S6K和S6K抗体检测细胞膜,以测定ERK和mTORC1活性。(B类)Torin 1诱导TFEB去磷酸化和核移位。从TFEB–3×FLAG HeLa细胞中分离的细胞溶质和核组分的FLAG免疫印迹在无氨基酸介质中饥饿,随后按指示刺激至少3小时。H3和微管蛋白抗体验证了正确的亚细胞分馏。(C类)ERK和mTOR抑制剂对TFEB核转位的影响。将TFEB–GFP HeLa细胞接种在96个平板中,培养12 h,然后用指定浓度的ERK抑制剂U0126或mTOR抑制剂雷帕霉素、Torin 1和Torin 2处理。37°C下培养3小时后,使用OPERA自动共焦显微镜(Perkin-Elmer)处理细胞并采集图像。比例尺代表30μm。(D类)ERK和mTOR抑制剂对TFEB核转位影响的剂量-反应曲线。将TFEB–GFP HeLa细胞接种在384孔板中,培养12 h,并用10种不同浓度的ERK抑制剂U0126或mTOR抑制剂雷帕霉素、Torin 1和Torin 2处理,范围从2.54 nM到50μM。该图显示了每种化合物在不同浓度下的核移位百分比(以浓度的对数表示)。使用Prism软件计算每种化合物的EC50(详见材料和方法)。(E类)用二甲基亚砜或Torin 1处理的HEK-293T细胞的免疫荧光,并用抗内源性TFEB和溶酶体蛋白RagC的抗体染色(合并中分别为绿色和红色)。DAPI包含在合并中。比例尺代表10μM。(F类)Rag GTPase敲除诱导TFEB核移位。稳定表达TFEB–3×FLAG的HeLa细胞感染慢病毒,慢病毒编码靶向荧光素酶(对照)或RagC和RagD mRNA的短发夹(Sh-)RNA。在所有样本中,感染后96小时,细胞未经处理(N=正常培养基)、饥饿(S=饥饿培养基)或用Torin 1(T=Torin 2)处理4小时,然后进行核/细胞溶质分离。用FLAG抗体检测TFEB定位,而微管蛋白和H3分别用作细胞溶质和核部分的对照;S6K磷酸化水平用于测试RagC和RagD的敲除效率。(G公司)mTORC2缺失不影响TFEB磷酸化。从Sin1−/−或对照胚胎(E14.5)分离的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)感染编码TFEB–3×FLAG的逆转录病毒;感染后48小时,细胞用Torin 1(T)处理4小时(如有指示),进行核/胞浆分级,并进行FLAG、微管蛋白和H3的免疫印迹。(H(H))TFEB与mTORC1的结合。对表达TFEB–3×FLAG的HEK-293T细胞进行裂解并进行FLAG免疫沉淀,然后对mTOR、mTORC1亚单位raptor和mTORC2成分rictor和Sin1进行免疫印迹。FLAG–Rap2A作为阴性对照。
我们用富含氨基酸的培养基(补充Torin 1(250 nM)、雷帕霉素(2.5μM)或ERK抑制剂U0126(50μM))刺激饥饿细胞,其中TFEB脱磷并定位于细胞核。单独用营养物质刺激饥饿细胞可诱导TFEB分子量发生显著变化并重新定位到细胞质中(). 在50μm浓度的ERK抑制剂U0126存在下进行营养刺激,仅诱导部分TFEB分子量移动,表明ERK的磷酸化部分有助于TFEB细胞质定位。2.5μM雷帕霉素处理也导致部分分子量改变,但不影响TFEB亚细胞定位()与我们之前的观察结果一致(Settembre等人,2011年). 然而,Torin 1(250 nM)处理完全阻止了营养物质引起的分子量变化,进而导致大量TFEB核积累。这一结论与最近的一项研究相反,该研究表明,mTOR介导的TFEB磷酸化促进而非抑制其核转位(Pena-Llopis等人,2011年). 相反,我们的数据表明,mTOR是TFEB核转位的有效抑制剂,TFEB是mTORC1的雷帕霉素耐药底物。
在之前的研究中,我们表明ERK2磷酸化TFEB,饥饿和ERK2抑制促进TFEB核移位(Settembre等人,2011年). 我们测试了溶酶体应激是否也通过ERK抑制导致TFEB核移位。用氯喹或SalA隔夜处理HeLa细胞对ERK活性没有任何影响()表明mTOR介导的调控是主要的。为了量化ERK和mTOR对TFEB亚细胞定位的影响,我们开发了一种基于细胞的高含量检测方法,使用稳定的HeLa细胞,该细胞过度表达TFEB并融合到绿色荧光蛋白(TFEB–GFP)(有关详细信息,请参阅材料和方法)。我们测试了每种抑制剂(U0126、雷帕霉素、Torin 1和Torin 2)的10种不同浓度,范围从2.54 nM到50μM。显示了每种化合物每种浓度的TFEB核/细胞质分布,一式两份,用非线性回归拟合表示为剂量-反应曲线(详见材料和方法)。与上述数据一致,激活TFEB核转位的最有效化合物是Torin 1(EC50;147.9 nM)及其类似物Torin 2(EC50,1666 nM)。ERK抑制剂U0126仅显示出部分作用,而雷帕霉素在常规使用的任何浓度(10 nM–10μM)下均无作用。此外,Torin 1处理能有效诱导HEK-293T细胞内源性TFEB的核积累(),证实了TFEB–GFP构造获得的观察结果。
由于Torin 1同时抑制mTORC1和mTORC2复合物,我们接下来评估了每个复合物对TFEB调节的贡献。三个主要观察结果表明,TFEB主要受mTORC1的调节:(1)用氨基酸刺激饥饿的细胞,激活mTORC2,但不激活mTORC 2,引起广泛的TFEB分子量变化,这极有可能是磷酸化事件(补充图S2); (2) RagC和RagD基因的敲除可以向mTORC1传递氨基酸信号,即使在全营养培养基中的细胞中也会导致TFEB核的积累(); (3) 在mTORC2信号中断的细胞中(Sin1−/−小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs))(Frias等人,2006年;哈辛托等人,2006年;Yang等人,2006年)在Torin 1处理后,TFEB发生了与对照细胞相似的分子量变化和核移位(). 总之,这些数据表明,mTORC1而不是mTORC2通过阻止其核移位来调节TFEB。最后,在表达TFEB–3×FLAG的HEK-293T细胞中进行的联合免疫沉淀试验表明,TFEB与mTOR和mTORC1亚单位猛禽结合,但与mTORC2亚单位rictor和mSim1不结合,表明TFEB和mTORC 1在功能和物理上相互作用().
mTORC1通过S142的磷酸化控制TFEB的亚细胞定位
我们之前确定丝氨酸142的磷酸化是饥饿期间TFEB核移位的关键事件(Settembre等人,2011年). 为了测试mTORC1是否在S142磷酸化TFEB,我们产生了一种磷酸特异性抗体,该抗体只有在S142磷酸化时才能识别TFEB。该抗体在过度表达S142A突变型TFEB的细胞中未检测到信号,从而证实了其特异性(补充图S3). 使用该抗体,我们观察到在稳定过表达TFEB–3×FLAG并在营养耗尽的培养基中培养的HeLa细胞中,TFEB在S142不再磷酸化,这与我们之前的结果一致().
mTORC1在丝氨酸142处磷酸化TFEB(S142)。(一)Torin 1诱导S142去磷酸化。按照指示处理HeLa细胞,用TFEB p-S142磷酸抗体和抗FLAG抗体探测总提取物和核提取物。饥饿或Torin 1处理后TFEB S142磷酸化消失与TFEB在核部分的积累相关。(B类)mTORC1型体外激酶分析。高纯度FLAG–S6K1、TFEB–3×FLAG或TFEBS142A系列–3×FLAG与不含激酶的放射性标记ATP、纯化的mTORC1或mTORC1+Torin 1孵育,并通过放射自显影分析。下面板显示底物的FLAG免疫印迹。(C类)TFEB蛋白结构与预测的mTORC1磷酸化位点及其在脊椎动物中的保守性的示意图。编号依据人类亚型1。(D类)磷酸位点的序列保守性得分以及mTOR共有基序和TFEB磷酸位点周围序列之间的定量一致性。(E类)S142和S211规定了TFEB定位。表达丝氨酸-丙氨酸突变型TFEB–3×FLAG的HeLa细胞的FLAG免疫染色(红色)。细胞核用DAPI(蓝色)染色。值是包含至少50个转染细胞的五个字段的平均值。学生的t吨-测试(未配对)***P(P)<0.001. 比例尺代表30μm。
随后,我们分析了补充有或没有Torin 1或Rapamycin的正常培养基的饥饿细胞中S142磷酸化水平。虽然Torin 1明显减弱了营养素诱导的S142磷酸化,但雷帕霉素没有,这表明S142代表了雷帕霉素耐药的mTORC1位点(). 事实上,mTOR激酶分析显示mTORC1磷酸化高度纯化的TFEB在体外与其他已知的mTORC1底物具有可比的效率,并且当mTORC2与S142A突变型TFEB孵育时,这种磷酸化显著下降(). 这些结果清楚地表明,TFEB是mTOR底物,S142是mTOR磷酸化TFEB的关键残基。
最近的研究表明,mTORC1在多个位点磷酸化其靶蛋白(Hsu等人,2011年;Peterson等人,2011年;Yu等人,2011年). 为了识别可能被mTOR磷酸化的其他丝氨酸残基,我们搜索了mTORC1的共有磷酸受体基序(Hsu等人,2011年)在TFEB的编码序列中().
我们将所有被认为是mTORC1靶标的TFEB氨基酸残基突变为丙氨酸。然后我们测试了每个突变对TFEB亚细胞定位的影响,发现与S142A类似,211位(S211A)的丝氨酸-丙氨酸突变导致TFEB的组成性核定位(). 其他丝氨酸残基的突变体表现出与野生型TFEB相似的行为(;补充图S4;Settembre等人,2011年). 总之,这些数据表明,除S142外,S211还在控制TFEB亚细胞定位中发挥作用,并表明S211代表mTORC1的另一个靶位点。
mTORC1和TFEB在溶酶体表面相互作用
根据TFEB是mTORC1的底物的观察()这两种蛋白质在物理上相互作用(),我们测试了TFEB和mTORC1是否在溶酶体膜上发生相互作用。对表达TFEB–GFP的HeLa细胞的仔细检查表明,在正常生长条件下,大多数细胞显示出以细胞质为主的TFEB定位,而一部分细胞显示出清晰可辨的细胞内TFEB-GFP荧光斑点,表明存在溶酶体定位(补充图S5). 这些观察结果在瞬时表达TFEB–GFP和晚期内体/溶酶体标记物mRFP–Rab7的MEF中得到证实(). 在一组细胞中,TFEB–GFP明显与mRFP–Rab7阳性溶酶体共定位,并且随着溶酶体在细胞内流动,这种关联会持续一段时间(;补充电影S1).
mTORC1结合并磷酸化溶酶体表面的TFEB。(一)共表达TFEB–GFP和mRFP–Rab7的MEF细胞的旋转盘共焦图像(合并中分别为绿色和红色)。(B类)年装箱区TFEB-和Rab7-阳性溶酶体的时间推移(一). 时间间隔以秒为单位。(C类)表达TFEB–GFP的MEF细胞Torin 1治疗的时间推移分析。箭头表示添加Torin 1的时间。黄色箭头表示Torin 1诱导的TFEB–GFP溶酶体积聚。时间间隔以分钟为单位。(D类)二甲基亚砜处理后表达TFEB–3×FLAG的HEK-293T细胞的免疫荧光(顶部)或Torin1(底部)并用FLAG和mTOR抗体染色(合并处分别为绿色和红色;DAPI为蓝色)。(E类)对来自对照MEF(蓝色)或经Torin 1处理的MEF(红色)的TFEB–GFP阳性溶酶体进行FRAP分析。每个数据点代表五个独立点的平均值±标准差。(F类)对照处理MEF中TFEB–GFP阳性溶酶体光漂白和荧光恢复的时间进程(顶部)或用Torin 1处理的MEF(底部). 红色箭头表示光漂白时间。时间间隔以秒为单位。(G公司)Torin 1增加TFEB与mTORC1的结合。表达TFEB–3×FLAG以及HAGST-Rap2A或HAGST-Rags的HEK-293T细胞DN(公称直径)用载体或Torin1处理,裂解并进行FLAG免疫沉淀,然后对mTOR和猛禽进行免疫印迹。FLAG–Metap2作为阴性对照。(H(H))表达TFEB–3×FLAG和Rap2A的HEK-293T细胞的免疫荧光(顶部)或碎布DN(公称直径)突变体(底部)用Torin 1处理,并用FLAG和LAMP2抗体染色(合并处分别为绿色和红色;DAPI为蓝色)。在所有图像中,比例尺代表10μm。
我们推断,TFEB在溶酶体中的部分定位可能是由于与mTORC1的短暂结合,随后是mTORC1依赖性磷酸化和TFEB向细胞质的易位。为了验证这一想法,我们用Torin 1处理TFEB–GFP HeLa细胞,作为将TFEB的结合态“陷阱”到非活性mTORC1的一种方法。证实了我们的假设,Torin 1在溶酶体上引起了TFEB–GFP的大量和显著积累(补充图S5). 类似地,Torin 1对MEFs的治疗导致TFEB–GFP在给药几分钟内在溶酶体上的时间依赖性积累,随后逐渐积累到细胞核中(;补充电影S2和第3章). 有趣的是,我们还注意到,与未处理的细胞相比,Torin 1处理导致溶酶体上内源性mTOR的显著积累(). 因此,两种机制有助于在Torin 1处理后TFEB在溶酶体上聚集:(1)将mTORC1-TFEB复合物捕获在非活性状态,(2)增加与溶酶体表面结合的mTORC1数量。非活性mTORC1在溶酶体表面的积累可能反映了一种反馈机制,通过其激酶活性mTORC调节其自身对溶酶体膜的靶向(Zoncu等人,2011年b).
为了动态定量地研究TFEB溶酶体捕获,我们对TFEB–GFP阳性溶酶体进行了光漂白后荧光恢复(FRAP)实验(;补充电影S4). 在对照细胞中,TFEB–GFP阳性溶酶体的光漂白后,快速(t吨1/2=0.35 min)和初始荧光的实质性(60%)恢复。相反,在经Torin 1处理的细胞中,TFEB–GFP阳性溶酶体更加突出且数量众多,荧光恢复较慢(t吨1/2=0.57 min)和更小(初始荧光回收率30%)。因此,大部分TFEB通过与非活性mTORC1结合而被捕获到溶酶体表面,并且不再能够与细胞质交换。
总之,这些数据表明,TFEB和mTORC1在溶酶体表面上相互结合,在那里发生了TFEB的磷酸化。
mTORC1通过Rag GTPases调节TFEB
TFEB受mTORC1调控的观察促使我们确定Rag GTPases的激活状态是否在控制TFEB亚细胞定位中起作用,Rag GTPases与v-ATP酶一起通过氨基酸介导mTORCl激活。Rags的点突变体是可用的,它完全模拟氨基酸的存在(“Rags加利福尼亚州')或他们的缺席('拉格DN(公称直径)’) (Sancak等人,2008年). 我们利用这些突变体直接测试将TFEB隔离到溶酶体中对mTORC1的需求,并询问RagsDN(公称直径)导致溶酶体表面mTORC1缺失的突变体(Sancak等人,2010年),能够抑制Torin 1诱导的TFEB溶酶体积累以及TFEB-mTORC1结合。在联合免疫沉淀分析中,Torin 1明显增强了猛禽和mTOR与TFEB–3×FLAG的结合(). 然而,Rags的共同表达DN(公称直径)突变体将对照细胞和Torin 1处理细胞中TFEB–3×FLAG与mTORC1组分的结合降低到背景水平(). 与这些结果一致,HEK-293T共表达TFEB–3×FLAG和Rags的免疫荧光实验DN(公称直径)突变体显示,经Torin 1处理后,TFEB未能在溶酶体上聚集(). 总之,这些数据强烈表明,TFEB和mTORC1只有在溶酶体表面发现时才会相互作用。
接下来,我们测试Rags的激活状态是否控制TFEB核转位。在共表达TFEB–3×FLAG和对照小GTPase(Rap2A)的HEK-293T细胞中,氨基酸缺失导致TFEB大量移位至细胞核(),如前所述(Settembre等人,2011年). 与mTORC1再激活一致,用氨基酸对饥饿的细胞进行短暂(20分钟)的再刺激,将TFEB从大多数细胞的细胞核中排出(). 相反,在同时表达TFEB–3×FLAG和Rags的细胞中加利福尼亚州突变体,无论细胞的营养状态如何,TFEB的定位始终是完全细胞质的(). 最后,在同时表达TFEB和Rags的细胞中DN(公称直径)突变体TFEB几乎只存在于细胞核中,在氨基酸刺激下不会移位到细胞质(). 因此,Rags的激活状态完全覆盖了细胞的营养状态,足以确定TFEB的定位。
Rag GTPases控制TFEB亚细胞定位。(一–C类)表达TFEB–3×FLAG以及对照GTPase或指示Rag突变体的HEK-293T细胞的免疫荧光。细胞被剥夺了氨基酸(顶部)或者被剥夺然后被刺激(底部)用于指示的时间,并为FLAG和mTOR染色(合并中分别为绿色和红色;DAPI为蓝色)。(D类)量化每种情况下带有核TFEB的细胞数量(一–C类). (E类,F类)表达TFEB–3×FLAG和Rap2A的HEK-293T细胞的免疫荧光(E类)或碎布加利福尼亚州突变体(F类),接受指定的处理,并用抗FLAG和mTOR的抗体染色(合并物中分别为绿色和红色;DAPI为蓝色)。(G公司)DMSO和CQ处理的场中带有核TFEB的细胞数量的量化(E类)和(F类). 在所有字段中,比例尺代表10μm。在所有直方图中,每个值代表三个独立字段的平均值±标准差N个=300.
之前的研究表明,Rags加利福尼亚州挽救不同溶酶体应激源对mTORC1激活的抑制作用(Zoncu等人,2011年a). 因此,我们问Rags加利福尼亚州突变体能够阻止这些应激源促进的TFEB核移位(和). 在同时表达TFEB–3×FLAG和Rags的细胞中加利福尼亚州突变体,经氯喹和SalA处理后TFEB完全保持细胞质()而绝大多数表达对照GTPase的细胞都是核细胞,并且接受同样的药物治疗(). 重要的是,联合表达TFEB–GFP和Rag的细胞的治疗加利福尼亚州Torin 1恢复了Rag加利福尼亚州-诱导TFEB的细胞质定位并将TFEB大量驱动至细胞核,进一步证明Rag突变体对TFEB所起的作用是由mTORC1介导的(补充图S6).
总之,这些结果表明,TFEB定位是通过Rag GTPases的激活状态由氨基酸-mTORC1信号通路直接调节的。
溶酶体通过TFEB调节基因表达
由于TFEB与溶酶体膜上mTORC1的相互作用控制着TFEB的核转位,我们测试了TFEB调节基因表达的能力是否也受到这种相互作用的影响。显示为TFEB靶点的几个溶酶体/自噬基因的表达(Palmieri等人,2011年)在肝脏中TFEB被删除的条件敲除小鼠系的原代肝细胞中进行测试(Tcfeb公司flox/flox;alb-CRE),并在控制鼠标行中(Tcfeb公司flox/flox)。细胞用氯喹或Torin 1处理,或不处理。这些处理抑制了通过p-S6K水平测量的mTOR,而p-ERK水平则不受影响(). 在常规培养基中培养的TFEB条件敲除小鼠的原代肝细胞与对照肝细胞相比,几个TFEB靶基因的表达水平没有显著差异(补充图S7). 然而,尽管用氯喹治疗后,对照小鼠肝细胞中TFEB靶基因的表达上调,但TFEB条件敲除小鼠肝细胞的这种上调明显减弱(). 同样,在TFEB条件敲除小鼠的肝细胞中,Torin 1治疗后的转录反应显著降低(). 总之,这些结果表明TFEB在溶酶体通过mTOR诱导的转录反应中起着关键作用。
溶酶体通过TFEB调节基因表达。(一)氯喹治疗抑制原代肝细胞中的mTORC1活性。从2个月大的婴儿身上分离的原代肝细胞Tcfeb公司flox/flox(控制)和Tcfeb公司flox/flox;Alb-Cre公司(Tcfeb公司−/−)小鼠未经治疗,或使用Torin 1、U0126或氯喹治疗过夜。随后,对细胞进行裂解,并用所示抗体对蛋白提取物进行免疫印迹。(B、 C类)TFEB介导对氯喹和Torin 1的转录反应。对照(flox/flox)和Tcfeb公司−/−小鼠。用氯喹(左)或Torin 1(右)处理细胞。图表显示,与相应的未经处理的样本相比,经过处理的样本中的表达相对增加。数值代表三种独立肝细胞制剂(三只小鼠/基因型)的平均值±标准差。学生的t吨-测试(双尾)*P(P)-值⩽0.05。
讨论
我们的研究表明,TFEB是溶酶体生物发生的主基因,由溶酶体通过mTOR途径调节。mTORC1和TFEB在溶酶体膜上相遇,其中mTORC1-磷酸化TFEB。
我们之前报道过ERK2磷酸化TFEB,并且在用MEK抑制剂处理的细胞中,TFEB核分数增加(Settembre等人,2011年). 在同一研究中,我们报道了mTOR抑制剂雷帕霉素对TFEB亚细胞定位几乎没有影响。在此,我们比较了三种不同类型的激酶抑制剂-MEK抑制剂U0126和mTOR抑制剂雷帕霉素、Torin 1和Torin 2引起TFEB分子量改变和诱导TFEB核转位的能力。如所示与U0126相比,Torin 1和Torin 2诱导TFEB核移位的效率更高。在用Torin 1处理的细胞中观察到的TFEB分子量更明显的变化表明,mTORC1直接或间接地在多个位点诱导TFEB磷酸化。
在最近的高通量质谱研究中,TFEB被预测在11个不同的残基处磷酸化,因此表明其活性的复杂调节可能涉及几个磷酸化位点(Dehoure等人,2008年). 这里,我们使用了mTORC1体外激酶分析和磷酸化抗体证明我们之前发现由ERK2磷酸化的丝氨酸S142也被mTOR磷酸化,并且这种磷酸化在控制TFEB亚细胞定位和活性方面具有关键作用。此外,我们还将12个不同的丝氨酸突变为丙氨酸,这些丝氨酸是mTOR磷酸化的候选位点,从而消除了相应的TFEB磷酸化位点。通过测试这些突变对TFEB亚细胞定位的影响,确定了另一个残基丝氨酸S211,该残基在TFEB的亚细胞定位中起作用,证实了通过磷酸化调节TFEB预测的复杂性。
先前的一项研究已经报道了通过mTOR对TFEB进行磷酸化(Pena-Llopis等人,2011年). 然而,在该研究中,作者得出结论,mTOR促进而非抑制TFEB活性。一些证据表明,mTOR抑制TFEB活性。首先,当细胞饥饿或用Torin1治疗时,TFEB是完全核的,在这两种情况下,mTOR活性受到严重抑制。第二,用营养物处理饥饿的细胞,这是一种提高mTORC1活性的条件,导致TFEB细胞质积聚,而在细胞核部分无法检测到TFEB。第三,使用氯喹或SalA等抑制mTORC1功能的药物治疗,可诱导TFEB核积聚。第四,转染抑制mTORC1的突变Rag蛋白导致TFEB的核积累,相反,组成性激活mTORC1的突变Rag在饥饿、氯喹和SalA治疗时阻止了TFEB的核积累。第五,TFEB以低磷酸化形式存在于细胞核中,这一观察结果与激酶抑制而非激活诱导TFEB核移位的模型一致。很难解释我们的观察结果与佩纳-洛皮斯报告的结果之间的差异等。我们考虑了在该研究中使用的TSC2缺陷细胞在所进行的测定中可能与其他细胞系统表现不同的可能性。为了测试这种可能性,我们分析了TSC2−/−细胞中氨基酸、氯喹和Torin 1对TFEB的调节,但得到了与我们在其他类型细胞中观察到的外源性TFEB–GFP和内源性TFEBs的相同结果(补充图S8和S9)。
我们的数据表明,mTORC1通过氨基酸/Rag GTPase途径负调控TFEB。TFEB的磷酸化状态及其亚细胞定位完全取决于Rag GTPases的激活状态,Rag GTPases调节氨基酸下游的mTORC1活性(Kim等人,2008年;Sancak等人,2008年). 特别是,组成活性Rags挽救了因饥饿和溶酶体应激引起的TFEB的核移位,而非活性Rag突变体导致TFEB即使在完全喂养的细胞中也在细胞核中积累。这些结果表明,在mTORC1的许多调节输入中,氨基酸途径在控制TFEB活性方面尤其重要,并且不仅起着许可的作用,而且还起着指导作用。我们的观察进一步支持了这一观点,即TSC2−/−细胞中对mTORC1的生长因子输入的结构性激活不能阻止饥饿和溶酶体应激引起的TFEB核积聚。未来的工作将需要解决mTOR的每个上游输入如何促进TFEB调节。然而,最近的证据表明,v-ATPase/Rag-GTPase/mTORC1对氨基酸的感应可能始于溶酶体腔(Zoncu等人,2011年a)我们的发现证实了TFEB作为溶酶体感应和信号通路终点的作用。
我们的数据揭示了TFEB本地化控制背后的逻辑。在完全喂养的细胞中,一部分TFEB始终可以在溶酶体上发现,尽管大多数TFEB似乎在细胞质中自由扩散。如联合免疫沉淀分析所示,TFEB的溶酶体定位与其物理结合mTORC1的能力有关。此外,用Torin 1处理的细胞中TFEB–GFP的延时分析表明,TFEB在药物治疗开始后不久聚集在溶酶体上,然后逐渐出现在细胞核中(补充电影S2和S3)。总之,这些结果表明TFEB亚细胞定位和活性的控制模式如下(). 在任何给定的时间,一部分TFEB都会快速而短暂地结合到溶酶体表面,在那里它被mTORC1磷酸化,从而保存在细胞质中。营养提取、v-ATP酶抑制和溶酶体应激使Rag GTPase失活,导致溶酶体mTORC1丢失,导致TFEB不能再磷酸化。未磷酸化的TFEB在细胞核中逐渐积累,激活溶酶体基因表达程序,以纠正溶酶体的营养缺陷和/或pH状态。在这个模型中,溶酶体代表了一个瓶颈,其中mTORC1严格调节了到达细胞核的TFEB数量。
TFEB和mTOR的溶酶体传感和溶酶体-细胞核信号传递模型。(一) (左侧)在充分营养和没有溶酶体应激的情况下,由v-ATP酶、Ragulator和Rag GTPases形成的复合物处于活性状态,并将mTORC1招募到溶酶体表面,在那里mTORCl被激活。在溶酶体,mTORC1结合并磷酸化TFEB,TFEB在细胞质和溶酶体表面之间循环。mTORC1的磷酸化作用维持了细胞质中的TFEB并阻止其转移到细胞核。(赖特)饥饿、v-ATP酶抑制或溶酶体应激使Rags关闭,导致mTORC1从溶酶体分离并失活。TFEB不能再被磷酸化并转移到细胞核,在那里它激活基因表达程序,从而促进溶酶体功能和自噬。(B类)健康细胞和饥饿/应激细胞的侧面图,显示了mTORC1和TFEB在溶酶体、细胞质和细胞核中的各自分布。
mTORC1可能调节溶酶体中尚未发现的TFEB功能。观察到,用Torin 1阻断mTORC1活性不仅导致TFEB在细胞核中,而且在溶酶体上大量积累,这一现象支持了这种可能性,在co-IP分析中可以看到与mTORCl的结合增加,在FRAP实验中可以看到流动性降低。未来的工作将讨论TFEB在溶酶体表面上的功能(如果有的话)。有趣的是,最近的证据表明TFEB调节溶酶体动力学的多个方面,包括溶酶体与质膜融合的倾向(Medina等人,2011年)提示TFEB的生物学功能范围仍需充分阐明。
我们的数据进一步强调了溶酶体作为关键信号中心的新兴作用。特别是,将溶酶体腔中氨基酸的存在与mTORC1的激活联系起来的分子机制表明溶酶体在营养传感和细胞生长控制中发挥了新的作用(拉比诺维茨和怀特,2010年;Singh和Cuervo,2011年;Zoncu等人,2011年a). 它还表明mTORC1参与了溶酶体适应机制,使细胞能够应对饥饿和溶酶体应激条件(Yu等人,2010年). 这种机制对传递细胞代谢状态以及各种应激刺激的广泛信号作出反应。例如,由于能量耗竭或病理条件引起的溶酶体质子梯度的丧失,可能通过阻断营养物质进出溶酶体的质子耦合运输,或直接影响v-ATP酶,抑制mTORC1活性(Marshansky,2007年). 同样,在某些LSD和神经退行性疾病中观察到的溶酶体膜通透性可能导致营养泄漏和mTORC1抑制(Dehay等人,2010年;Kirkegaard等人,2010年).
我们发现,在携带TFEB肝脏特异性条件敲除小鼠的肝细胞中,溶酶体和自噬基因对饥饿和Torin 1抑制mTOR的转录反应受到阻碍,表明TFEB是这种反应的主要介体。因此,TFEB将溶酶体信号转化为转录程序。
这种溶酶体到细胞核的信号传递机制对溶酶体功能进行反馈调节,与内质网中的固醇感应途径呈现出有趣的相似之处,胆固醇耗竭和内质网应激导致固醇反应元件结合蛋白(SREBP)的核移位转录因子,激活增强胆固醇合成和ER功能的基因表达程序(Wang等人,1994年;Peterson等人,2011年). 另一个例子是线粒体逆行信号通路,线粒体功能障碍通过改变Ca激活NFκB、NFAT和ATF等因子2+动力学(Butow和Avadhani,2004年).
最后,由于TFEB过度表达能够促进底物清除并挽救LSD中的细胞空泡化(Medina等人,2011年)基于溶酶体、mTOR介导的调节TFEB活性的机制的鉴定为促进健康和疾病中的细胞清除提供了一种新的工具。
材料和方法
细胞培养
HeLa和HEK-293T细胞购自ATCC,并在补充有10%胎牛血清的DMEM中培养,200 mML(左)-谷氨酰胺、100 mM丙酮酸钠、青霉素100单位/ml、链霉素100 mg/ml、5%一氧化碳237°C时。原代肝细胞生成如下:2个月大的小鼠用Avertin(240 mg/kg)进行深度麻醉,首先灌注25 ml HBSS(Sigma H6648),补充10 mM HEPES和0.5 mM EGTA,然后再灌注含有100 U/ml胶原酶(Wako)和0.05 mg/ml胰蛋白酶抑制剂(Sigma-)的类似溶液。在有盖培养皿中分离肝脏,在HBSS中清洗细胞颗粒,并以5×105个细胞/35mm培养皿的密度进行培养,并在补充有10%FBS、2 mm谷氨酰胺、0.1μM胰岛素、1μM地塞米松和pen/strep的William’s培养基E中培养。第二天,细胞按文中所述进行处理。如前所述,生成Sin1−/−和控制MEF(哈辛托等人,2006年)并在补充有10%FBS、谷氨酰胺和pen/strep的DMEM中保存。由David Kwiatkowski(哈佛医学院)善意提供的TSC2+/+p53−/−和TSC2−/–p53−/−MEF,在补充了10%热失活FBS、谷氨酰胺和pen/strep的DMEM中保存。
生成Tcfeb公司flox鼠标线
我们使用了公开的胚胎干细胞克隆(网址:http://www.eucomm.org/)其中Tcfeb公司通过外显子4和5的同源重组进行靶向性。将重组ES细胞克隆注射到囊胚中,用于生成携带工程等位基因的小鼠系。将Flox/Flox小鼠与在Jackson实验室获得的白蛋白启动子(ALB-CRE)下表达CRE的转基因株系杂交,产生了肝特异性KO。所有涉及小鼠的程序都得到了贝勒医学院动物护理和使用委员会的批准。
质粒和细胞转染
用DNA质粒pRK5-mycPAT1、pRK5-HAGST-Rap2A、pRK-5-HAGST-RagB及其Q99L(CA)和T54N(DN)突变体、pRKW-HAGST-RagD及其Q121L(DN)和S77L(CA”突变体瞬时转染细胞;pTFEB-GFP和pCMV-TFEB-3×FLAG,根据制造商的协议使用脂质体2000或LTX(Invitrogen)。根据制造商说明书(Stratagene)进行位点直接诱变,通过测序验证正确的诱变。
药物和细胞治疗
使用以下药物:来自Sigma的雷帕霉素(2.5μM,另有说明);来自Biomarine的Torin 1和Torin 2(250 nM,另有说明);来自Cell Signaling Technology的U0126(50μM);来自Sigma的氯喹(100μM);水杨酸甲酰胺A(2μM)是Jeff De Brabander(犹他州西南部)赠送的一份礼物。
免疫印迹和抗体
小鼠抗TFEB单克隆抗体购自My Biosource目录号MBS120432。为了产生抗pS142特异性抗体,用以下与KLH偶联的肽免疫兔子:AGNSAPN{pSer}PMAMLHIC。第四次免疫后,处死兔子并收集血清。通过含有非磷酸化抗原的柱循环,从血清中清除非磷酸化抗体。接下来使用含有磷酸化肽的柱对磷酸化抗体进行亲和纯化。
用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Sigma)的M-PER缓冲液(Thermo)溶解细胞;如前所述分离核/细胞溶质部分(Settembre等人,2011年). 蛋白质通过SDS–PAGE(Invitrogen;还原NuPAGE 4–12%双三凝胶,MES SDS缓冲液)分离。如果需要,在室温下使用20 ml帝国蛋白染色剂(Thermo Fisher)对凝胶染色1 h,并用水进行脱色。通过使用I-Blot(Invitrogen)将蛋白质转移到硝化纤维素膜上进行免疫印迹分析。在TBS-T缓冲液(TBS含有0.05%吐温-20)中用5%的非脂肪乳封闭膜,并在室温下用一级抗体抗FLAG和抗TUBULIN(Sigma;1:2000)、抗H3(Cell Signaling;1:10000)孵育2小时,而以下抗体在5%BSA中孵育为ON:抗TFEB(My Biosource;1:1000),抗P TFEB(1:1000)ERK1/2、P-ERK1/2,P-P70S6K、P70S6K(细胞信号;1:1000)。
用TBS-T缓冲液清洗膜三次,并在室温下用碱性磷酸酶结合IgG(Promega;0.2 mg/ml)孵育1 h。用TBS缓冲液清洗薄膜三次,通过添加10 ml Western Blue®稳定底物(Promeca)观察表达的蛋白质。
柠檬酸激酶分析
FLAG–S6K1、TFEB–3×FLAG和TFEBS142A系列从用250 nM Torin 1处理1 h的瞬时转染HEK-293T细胞中纯化–3×FLAG,并在RIPA裂解缓冲液中进行裂解。将清除的裂解物与FLAG亲和珠(Sigma)孵育2 h,在含有500 mM NaCl的RIPA中洗涤4次,并使用竞争的FLAG肽在4℃洗脱1 h。利用FLAG亲和珠从稳定表达FLAG raptor的HEK-293T细胞中纯化出mTORC1。
在添加ATP之前,激酶分析在4°C下预培养10分钟,然后在30°C下在最终体积为25μl的激酶缓冲液中培养30分钟(25 mM HEPES,pH 7.4,50 mM KCl,10 mM MgCl2)活性mTORC1,250–500 nM底物,50μM ATP,1μCi[γ-32P]ATP,当指示为250 nM Torin 1时。通过添加6μl样品缓冲液停止反应,煮沸5分钟,然后通过SDS-PAGE进行分析,然后进行放射自显影。
免疫沉淀分析
表达FLAG标记蛋白的HEK-293T细胞用冰镇PBS冲洗一次,并在冰镇裂解缓冲液中溶解(150 mM NaCl,40 mM HEPES(pH 7.4),2 mM EGTA,2.5 mM MgCl20.3%CHAPS和每25 ml一片不含EDTA的蛋白酶抑制剂(罗氏))。通过在微离心机中以13000r.p.m.离心10分钟来分离来自细胞裂解物的可溶性级分。对于免疫沉淀,将35μl 50%的抗FLAG亲和凝胶(Sigma)浆液添加到每个裂解液中,并在4°C下旋转培养2-3小时。免疫沉淀物用裂解缓冲液洗涤三次。通过加入35μl样品缓冲液并煮沸5分钟使免疫沉淀的蛋白质变性,通过8-16%SDS-PAGE进行解析,并通过免疫印迹进行分析。
HEK-293T细胞的免疫荧光分析
在35mm组织培养皿中将HEK-293T细胞以300000个细胞/皿的速度接种在纤连蛋白包被的玻璃盖玻片上。总之,12–16小时后,用100 ng TFEB–3×FLAG以及200 ng Rap2A或Rag GTPase突变体转染细胞。第二天,对细胞进行药物处理或饥饿处理,用PBS冲洗一次,然后用4%多聚甲醛在室温下的PBS中固定15分钟。用PBS清洗载玻片两次,用0.05%Triton X-100在PBS中渗透细胞5分钟,将载玻片与5%正常驴血清中的一级抗体在室温下孵育1h,用PBS冲洗四次,与驴产生的二级抗体(在5%正常驴血中稀释1:1000)在室温下在黑暗中孵育45min,再用PBS洗涤四次。使用Vectashield(Vector Laboratories)将载玻片安装在玻璃盖玻片上,并在旋转圆盘共焦系统(Perkin-Elmer)上成像。
高含量核易位分析
将TFEB–GFP细胞接种在384孔板中,孵育12 h,并用10种不同浓度的ERK抑制剂U0126(Sigma-Aldrich)和mTOR抑制剂雷帕霉素(Sigma Aldrich)、Torin 1(Biomarin)和Torin 2(Biomerin)处理,范围从2.54 nM到50μM。在37°C的RPMI培养基中培养3小时后,对细胞进行清洗、固定,并用DAPI染色。为了获取图像,使用共焦自动显微镜(Opera高内容系统;Perkin-Elmer)对384孔板的每个孔拍摄了10张照片。开发了一个专用脚本来分析不同图像上的TFEB定位(Acapella软件;Perkin-Elmer)。该脚本计算核TFEB–GFP荧光平均强度除以TFEB-GFP荧光细胞溶质强度平均值所得的比值。在同一个平板中使用阴性(RPMI培养基)和阳性(HBSS饥饿)对照样品对结果进行标准化。使用Prism软件(GraphPad软件),数据由每种化合物在不同浓度下的核移位百分比表示。使用非线性回归拟合(Prism软件)计算每个化合物的EC50。
活细胞成像和光漂白协议
通过核感染(Lonza)将TFEB–GFP和mRFP–Rab7瞬时转染MEF。细胞以30万个细胞/皿的密度被镀在玻璃底35 mm皿(MatTek Corp.)上。第二天,将细胞转移到生理成像缓冲液中(130 mM NaCl,5 mM KCl,2.5 mM CaCl2,2.5 mM氯化镁2,25 mM HEPES)补充5 mM葡萄糖,并在旋转圆盘共焦显微镜(Andor Technology)上用488-nm和561-nm激光通过×63物镜成像。为了实现单个TFEB–GFP阳性溶酶体的光漂白,在选定的点周围绘制感兴趣的区域,并开始电影采集。60秒后,使用Andor FRAPPA装置用高功率(50 mM)488 nm脉冲(100μs/像素照明)对斑点进行光漂白。
FRAP分析
使用ImageJ(美国国立卫生研究院)中定制的插件分析光漂白TFEB-GFP阳性溶酶体的荧光恢复。在要分析的斑点周围画出感兴趣的圆形区域,并在整个电影中测量这些区域内的综合荧光。将每个条件下5到10个点的荧光强度迹线归一化为初始值并对齐时间,并使用Microsoft Excel计算其平均值和标准差。使用Prism(GraphPad)绘制最终绘图和曲线拟合。
RNA提取、定量PCR和统计分析
使用TRIzol(Invitrogen)从细胞中提取总RNA。使用TaqMan逆转录试剂(Applied Biosystems)进行逆转录。此前曾报道过溶酶体和自噬基因特异性引物(Settembre等人,2011年). 使用DDCt方法计算折叠变化值。简单地说,GAPDH和嗜环细胞素被用作“正常化”基因来计算DCt值。接下来,计算“对照”组和“实验”组之间的DDCt值。最后,使用2(-DDCt)计算折叠变化。在倍数变化值的计算中对生物重复进行分组。未付款T型-测试用于计算统计显著性。图中的星号表示P(P)-值<0.05。
mTORC1磷矿预测
为了确定可能被mTORC1靶向的磷酸化位点,我们开发了一种简单的方法,量化TFEB中丝氨酸或苏氨酸位点周围区域与mTORC 1磷酸化基序之间的一致性(Hsu等人,2011年). 该方法根据氨基酸在距感兴趣的磷酸位点给定距离处的位置特异性得分矩阵计算得分。该位置从−5开始,一直到+4。磷灰石设置在位置0。如果在这个间隔中有另一个丝氨酸或苏氨酸,则该残基的分数在总和中被跳过。
我们使用prosite/expasy.org中的MyDomains工具来绘制TFEB的功能域。已从UniProt/SwissProt数据库检索到域信息。人类TFEB及其同源序列由ClustalW(2.0.12版)使用默认参数对齐。
致谢
我们感谢G Diez-Roux批判性阅读手稿,感谢S Long测试TFEB抗体;I Peluso在高含量分析中提供帮助;T Kang和C Thoreen帮助进行mTORC1激酶分析。我们感谢意大利电视马拉松基金会(CS、DM和AB)的支持;Beyond Batten疾病基金会(CS、DM、FV、SUE、TH和AB);欧洲研究委员会高级研究员批准号250154(AB);Dimes三月拨款#6-FY11-306(AB);美国国立卫生研究院(R01 CA129105、R01 CA103866和R37 AI047389)的拨款以及美国老龄联合会、斯塔尔基金会、科赫研究所前沿研究计划和埃里森医学基金会对DMS的奖励,以及简·科芬儿童医学研究纪念基金会(Jane Coffin Childs Memorial Fund for Medical Research)和LAM基金会(LAM Foundation)向霍华德·休斯医学研究所(Howard Hughes Medical Institute)研究员RZ DMS提供的研究金。
作者贡献:CS、RZ、DS和AB设计了实验。CS和RZ进行了大部分实验。DM使用激酶抑制剂进行高含量筛选。FV进行了诱变分析。SE进行生物信息学分析。SU和TH提供了技术支持。MF和GK产生了TFEB磷酸化抗体。MV检测的TFEB抗体。心室颤动产生SIN1−/−MEF。CS、RZ和AB撰写了论文。
03/07/2012
自Advance Online Publication以来,倒数第二位作者的姓名已被更正。
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