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方法分子生物学。作者手稿；PMC 2014年8月20日提供。
以最终编辑形式发布为：
方法分子生物学。2011; 763: 237–252.
数字对象标识：10.1007/978-1-61779-191-8_16
预防性维修识别码：第138974页
NIHMSID公司：NIHMS611024
PMID：21874456

支持细胞血睾屏障动力学的体外研究系统

多洛雷斯·D·姆鲁克和C.严成
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

近年来，基于从大鼠睾丸分离出的支持细胞原代培养的体外系统的使用极大地促进了对血睾屏障的研究。在此，我们总结了从20天龄大鼠睾丸中分离未分化支持细胞的详细步骤，这些细胞在Matrigel-coated双室单位上单层培养，这些培养细胞的特性，以及使用支持细胞上皮监测支持细胞血液测试屏障的完整性。这些信息是基于我们实验室在过去二十年中常规使用该系统来研究Sertoli细胞血-试验屏障的结果，这应该对该领域的研究人员有所帮助。

关键词：睾丸、支持细胞、血睾屏障、紧密连接、胞质特化、锚定连接、精子发生

1.简介

血睾屏障（BTB）的概念早在一个多世纪前就有了描述，当时人们发现注射到动物体内的染料可以染色除大脑和睾丸生精小管外的所有器官(1,2)，说明这两个器官中存在血-组织屏障。随后的研究表明，BTB不同于其他血-组织屏障[例如，血-脑屏障（BBB）和血-视网膜屏障（BRB，也称为血-眼屏障）]，后者由内皮细胞之间的紧密连接（TJ）组成，几乎完全由邻近的支持细胞构成，其功能是在生精上皮的基底膜附近建立免疫屏障(2–5). 换句话说，在生精小管间质中发现的内皮细胞之间的TJ在维持BTB功能方面发挥的作用相对较小。同样重要的是，BTB不仅由TJ组成，还由共存的支持细胞之间存在基础胞质特化[基础ES，一种睾丸特异性非典型粘附连接（AJ）]、缝隙连接和桥粒连接(6–8)因此在这方面BTB是一种值得研究的独特超微结构。

近年来，由于一些重要原因，人们越来越关注使用支持细胞作为研究BTB动力学的模型。首先，自20世纪80年代以来，人们就知道体外高密度培养的支持细胞能够形成功能性上皮，在结构和功能上都与体内的BTB非常相似(9,10). 例如，当将这些支持细胞接种在细胞外基质（例如Matrigel™）上时，支持细胞发生极化(9,10)并创建了功能性TJ渗透屏障(11–14). 此外，通过电子显微镜，在相邻的支持细胞之间可以看到与体内紧密模拟BTB的TJs、基底ES、间隙连接和桥粒连接相对应的超微结构(15,16). 第二，尽管BTB是已知哺乳动物中存在的最紧密的血-组织屏障之一，但令人惊讶的是，它极易受到环境毒物（例如镉）的破坏，其破坏通常发生在检测到内皮TJ屏障受损之前(17,18). 事实上，最近的一项研究表明，幼年大鼠体内发育中的BTB对双酚a等有毒物质的敏感性甚至高于没有明显毒性迹象的整体动物(19). 因此，该体外系统提供了一个简单但合适的模型，可用于代替体内模型[例如，BTB完整性分析，其中染料通过颈静脉注射以监测屏障功能，类似于20世纪70年代发表的研究(1,20)]评估不同化合物对BTB功能的影响(21–23). 事实上，这一体外系统最近被用于检测黏着斑激酶（FAK）在BTB动力学中的作用，当发现FAK与封闭ZO-1蛋白复合物的结合在BTB破坏之前的镉处理后增加(24,25). 研究表明，FAK和闭塞素-ZO-1蛋白复合物之间的这种联系增加导致闭塞素的“不需要的”磷酸化，导致闭塞素从ZO-1中分离(24)从而破坏BTB处的细胞粘附。这些发现还表明，如果睾丸中的FAK可以作为治疗靶点，那么镉诱导的BTB破坏可能会得到“控制”(24). 第三，由于共存的TJ、基底ES、缝隙连接和桥粒连接共同促成了BTB的独特性质，该体外系统为研究这些连接在免疫屏障功能中的作用提供了一个有趣的模型。例如，最近的研究表明，缝隙连接(26)和桥粒(27)对保持BTB的完整性至关重要，因为它们不仅在它们之间，而且在基础ES和TJ之间调解串扰。最后，BTB是生精上皮中一个非常重要的结构，它隔离减数分裂I和II，以及减数分裂后生殖细胞发育的所有后续事件（如精子生成），在一个被称为顶端（或adluminal）的特殊微环境中这样宿主的免疫系统就不能产生针对精子特异性抗原的抗体，其中一些抗原在减数分裂和精子生成过程中会暂时产生。如果发生这种情况，就会导致不育。因此，体外高密度培养支持细胞为研究免疫屏障功能提供了良好的系统。

在此，我们提供了从大鼠幼崽中分离高纯度Sertoli细胞的详细方案，以及作为评估体外屏障功能的可靠方法的跨上皮阻力测量方案。过去三十年来我们一直使用的分离Sertoli细胞的方案是从Jennie Mather博士那里获得的(28,29)和之前发布的(30)稍作修改(31)，而我们用于溶解可能无意中污染了Sertoli细胞培养物的生殖细胞的程序（包括使用亚光子缓冲液）最初是由Mario Sefanini博士的实验室发布的(32). 我们通常从20日龄大鼠中分离出支持细胞，这有三个重要原因。首先，从这个年龄段的大鼠中分离出的支持细胞几乎可以忽略不计体细胞（即Leydig和肾小管周围肌样细胞）和生殖细胞污染，据报道支持细胞纯度>98%(33,34)当培养物经过低渗处理，细胞纯度通过RT-PCR和/或免疫印迹法监测时，使用睾丸中不同细胞类型的特异标记物(34). 第二，支持细胞产量（~180–200×106支持细胞）在使用10只20天大鼠幼崽时表现良好。第三，从20天龄大鼠睾丸分离出的支持细胞已分化，此时它们已停止分裂(35). 因此，它们与早期研究报道的成年支持细胞具有相似的生理特性(36,37). 值得注意的是，有一种程序可以使用BSA梯度从成年大鼠睾丸分离支持细胞(38). 然而，从成年大鼠睾丸中分离支持细胞的过程非常繁琐、耗时且昂贵。此外，由于培养物大多受到伸长/伸长精子细胞的污染，使用该技术分离的成年支持细胞的纯度为~85%，低渗缓冲液的多次处理似乎无法将细胞纯度提高到更可接受的水平(36,37). 在这种情况下，我们建议在大多数体外实验中使用20天龄的大鼠睾丸分离支持细胞。

下文分为两个主要部分。在第一部分中，我们提供了从20天龄大鼠睾丸分离支持细胞的方案。在第二节中，我们描述了用于评估TJ渗透屏障完整性的技术。

2.材料

2.1. 支持细胞的分离与培养

从大鼠睾丸中分离支持细胞是一个相对简单的过程，包括几个酶消化和洗涤步骤。

无菌、一次性50 ml和15 ml锥形瓶（15 ml锥形瓶中必须包含0.1至1 ml的刻度，这是确定电池组体积所需的刻度）。

带盖的125 ml无菌玻璃锥形烧瓶。

无菌巴斯德吸管。

无菌、单独包装、一次性10毫升移液管。组织培养处理的100毫米培养皿、多孔板（纽约州康宁市康宁市）和/或玻璃盖玻片（新泽西州斯威德斯伯勒市托马斯科学公司）。

Matrigel™（马萨诸塞州贝德福德BD Biosciences）。

根据规格表，使用电导率为18.2 MΩcm的Milli-Q级水（例如Millipore Advantage A10或西门子UltraGenetic Pure Lab水系统）制备约3L F12/DMEM。必须通过在经认证的细胞/组织培养罩内的0.2μM过滤装置对培养基进行过滤消毒。

标准实验室显微镜。

大豆胰蛋白酶抑制剂（STI）IIS型（分类号T9128 Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）；在PBS中制备1%（即1 gm/100 ml）（10 mM磷酸钠，pH 22°C下pH 7.4，含0.15 M氯化钠）；在−20°C的温度下储存在0.4 ml等分样品中。

胰蛋白酶（来自牛胰腺）；I型——（目录号T8003西格玛-奥尔德里奇）；储存在−20°C下40 mg/0.4 ml等分样品中。

胶原酶；I型–（分类号C0130 Sigma-Aldrich）；储存在-20°C下含有0.1%STI的20 mg/0.2 ml和40 mg/0.4 ml小份中。

透明质酸酶（来自牛睾丸）；IS型（类别号H3506 Sigma-Aldrich）；在−20°C下，储存在含有0.1%STI的40 mg/0.4 ml小份中。

DNA酶（来自牛胰腺）（分类号DN25 Sigma-Aldrich）；在F12/DMEM中制备2 mg/ml。

EGF 10μg/ml储备液。

人转铁蛋白10 mg/ml储备。

牛胰岛素20 mg/ml储备。

杆菌肽10 mg/ml储备。

除非另有规定，否则上述所有酶和试剂均应在PBS中制备，并通过0.2μm低蛋白结合过滤器（例如0.2μm Nalgene注射器过滤器，Thermo Scientific，产品目录号190-2520）过滤以消毒。

按照供应商的指示，添加碳酸氢钠（1.2 gm/L）、庆大霉素（20 mg/L）和酚红（0.00863 gm/L。

2.2. 评估支持细胞TJ-渗透屏障功能

2.2.1. 材料

Millicell-HA培养板插入物（Millipore，Billerica，MA）（例如，类别号：PIHA01250，直径12-mm；~1.1304 cm2表面积）。

Millicell ERS系统（Millipore，分类号：MERS 000 01）：仪表和Ag/AgCl电极（Millipore，分类编号：MERSSTX01）。

3.方法

3.1、。预隔离设置

使用无菌剪刀和镊子，或在细胞分离的早晨将其放入70%乙醇中。

在细胞分离的早晨，在F12/DMEM中制备1 M甘氨酸、2 mM EDTA，pH 7.4（~100 ml），通过0.2-μM过滤器过滤消毒。

介质必须加热至37°C。

应将离心机设置在室温（~20°C）下，摇动水浴设置在37°C下，并保留细胞培养罩约5-6小时。

Matrigel™涂层的培养皿、平板和/或两院制单元应在细胞接种前24小时制备，方法是在F12/DEM中以1:7稀释Matrigel™。这些应在加湿CO中培养2培养箱温度为35°C，以使Matrigel™完全干燥。（注：MatrigelTM公司应在–20°C下取出，并在4°C下保存过夜，以使其液化，然后在F12/DEM中稀释，用于在培养皿、两院体单元和/或显微镜载玻片上电镀。

3.2. Sertoli细胞分离

  1. 10只雄性Sprague-Dawley大鼠（纽约州金斯顿市查尔斯·里弗实验室）在使用当天达到20天大。可以预期常规隔离~180–200×10610只幼鼠的支持细胞。用一氧化碳窒息动物安乐死2使用类似于Braintree Scientific，Inc.（马萨诸塞州Braintere）商用设置的调节器，将调节器设置为约20 psi（约1.4巴）的二氧化碳储罐中放置约2–2.5分钟。
  2. 用70%乙醇冲洗阴囊区域。
  3. 取出睾丸，脱去包囊以去除白膜，然后将所有20个睾丸放入100毫米的培养皿中约10毫升F12/DMEM中。从这一步骤开始，所有剩余的培养步骤都将在通风的、经过认证的细胞培养罩内进行，除非另有规定，否则在室温下，在专门的组织培养室内有适当的气流。
  4. 将所有睾丸（共20个）转移到另一个含有约10 ml F12/DMEM的100 mm培养皿中。用手术级的弯曲剪刀，如Miltex的剪刀，将睾丸切成约1毫米的碎片。
  5. 将睾丸转移到50毫升的锥形管中，并添加高达50毫升的F12/DMEM。轻轻搅拌清洗睾丸，去除污染的血细胞，然后在800×克在室温下保持2分钟。
  6. 用巴斯德吸管吸取F12/DMEM。再次加入高达50 ml的F12/DMEM并清洗，直到培养基清澈，通常两次。
  7. 在含有40 mg胰蛋白酶和0.8 mg DNA酶的40 ml F12/DMEM中重新培养睾丸。将睾丸转移到带盖的无菌125 ml锥形烧瓶中。在60–90 osc/min的摇动水浴中放置30分钟。此步骤将释放莱迪格细胞和其他间质细胞（例如成纤维细胞）。
  8. 将生精小管转移到50毫升的锥形管中。添加F12/DMEM至50 ml，并在800×克持续2分钟。
  9. 用巴斯德吸管吸取F12/DMEM。
  10. 在40 ml含有0.01%STI和0.8 mg DNase的1 M甘氨酸、2 mM EDTA、pH 7.4中重新培养生精小管。在室温下培养10分钟，并定期轻轻搅拌。这一步将溶解莱迪格细胞。
  11. 将生精小管转移到50毫升的锥形管中。添加F12/DMEM至50 ml，并在800×克持续2分钟。
  12. 用巴斯德吸管吸取F12/DMEM。
  13. 800×离心洗涤细胞克两次或直到F12/DMEM清除。
  14. 用巴斯德移液管在含有20 mg胶原酶和0.2 mg DNA酶的40 ml F12/DMEM中轻轻移液（约20–25次），使细胞重新悬浮。将细胞转移到Erlenmeyer烧瓶中，并将其置于60–90 osc/min的摇动水浴中5分钟。
  15. 将细胞转移到50毫升的锥形中。添加F12/DMEM至50 ml，并在800×克持续2分钟。
  16. 用巴斯德移液管在含有40 mg胶原酶和0.2 mg DNA酶的40 ml F12/DMEM中轻轻移液（如上所述），使细胞重新悬浮。将细胞转移到锥形烧瓶中，并以60–90 osc/分钟的速度置于振荡水浴中30分钟。这两个连续步骤将去除管周类肌细胞。
  17. 将细胞转移到50毫升的锥形中。添加F12/DMEM至50 ml，并在800×克持续2分钟。
  18. 800×离心洗涤细胞克三次（两次离心之间，细胞在新鲜F12/DMEM中轻微再悬浮）。
  19. 用巴斯德移液管在含有40 mg透明质酸酶和0.2 mg DNA酶的40 ml F12/DMEM中轻轻移液（如上所述），使细胞重新悬浮。将细胞转移到Erlenmeyer烧瓶中，置于60–90 osc/min的摇晃水浴中30分钟。这一步将分解细胞外基质的主要成分透明质酸。
  20. 将细胞转移到50毫升的锥形中。添加F12/DEM至50ml，并在800×克持续2分钟。
  21. 800×离心洗涤细胞克五次。
  22. 将细胞转移到15 ml锥形中。添加F12/DMEM至15 ml，并在800×克2分钟。根据细胞组体积和实验设计，重新悬浮细胞如下（以获得0.5×106细胞/ml）：
    电池组（ml）电池数量（106)培养基体积（ml）
    0.3108216
    0.4144288
    0.5180360
    0.6216432
    0.7252504
    0.8288576
  23. 在含有10μg/ml胰岛素、5μg/ml人转铁蛋白、2.5 ng/ml EGF和5μg/ml杆菌肽的F12/DMEM中重新培养细胞。低水平平板电池（5×104细胞/厘米2)或高（0.5×106细胞/厘米2)密度。对于高密度的100毫米培养皿、多孔板、玻璃盖玻片或培养板插入物，应涂上Matrigel™以提高细胞活力。为了制备用于量化TJ渗透屏障功能的细胞，细胞密度为1–1.2×106细胞/厘米2应该使用。
  24. 在增湿CO中的培养皿/双室装置中培养细胞2培养箱温度35°C，95%空气和5%CO2（v/v）。由于不可能分离单个支持细胞，支持细胞将以五到十个细胞组成的小簇。一旦这些细胞簇附着在基质上，细胞就会迅速扩散形成上皮。

3.3. 低渗治疗

在将Sertoli细胞镀在100 mm培养皿、多孔培养皿或玻璃盖玻片上36–48小时后执行此步骤，以去除Sertoli电池中的残余生殖细胞，从而使这些Sertoli手机受到可忽略不计的生殖细胞和Leydig细胞的污染（见注4.1）。对于低张治疗：

  1. 根据需要处理的盘子/盘子的数量，制备20 mM Tris，pH 7.4（100-500 ml）。
  2. 过滤上述缓冲液进行消毒。
  3. 缓冲液必须通过0.2-μm过滤装置过滤消毒。
    1. 用巴斯德吸管吸出培养基。
    2. 在每个培养皿中添加适量的上述缓冲液（例如，每100-mm培养皿约10毫升；在六孔培养皿中每孔约2毫升），持续2.5分钟，以溶解污染的生殖细胞。
    3. 用巴斯德吸管吸取缓冲液。
    4. 用F12/DMEM清洗两次，以去除残留的Tris缓冲液。
    5. 添加F12/DMEM，并补充上述四个因素。
    6. 在加湿CO中培养细胞235°C、95%空气和5%一氧化碳的培养箱2（v/v）。
    7. 每3-4天（低细胞密度）或每1-2天（高细胞密度）喂食一次细胞，补充生长因子-F12/DMEM。

3.4. 体外测定TER评估屏障功能

当Sertoli细胞在0.5–1.2×10的Matrigel™涂层双室培养基上培养时6细胞/厘米2，它们能够形成具有功能性TJ通透性屏障的完整上皮，并且这些细胞能够抵抗穿过上皮的电流（即约20μa的~2s脉冲）的通过(图1)带有Millipore Millicell-ERS测量仪，两个电极放置在双腔装置的顶腔和底腔中(图2)（另见注4.2）。TJ-屏障功能以欧姆（Ω）为单位记录（即细胞上皮对流经上皮的电流的电阻），该值乘以双室单位的表面积（cm2)产生跨上皮电阻（TER）(图1)（有关从本实验中获得可重复且可靠数据的预防性说明，请参见注4.2）。Sertoli细胞中的TJ屏障在第3天形成，此时TER值达到峰值（约50–70Ωcm2)然后是高原(图1). 支持细胞之间功能连接的组装可以通过荧光显微镜进一步表征，在本例中，荧光显微镜用于观察肌动蛋白丝(图3a)以及闭塞素（TJ整合膜蛋白）(图3b)和ZO-1（已知与闭塞素形成1:1化学计量比的TJ-相关适配器）(图3c)相邻支持细胞之间。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms-611024-f0001.jpg

通过量化上皮上的TER，评估在Matrigel™涂层培养单元上培养的Sertoli细胞中TJ通透性屏障的组装的典型实验。从四倍双腔培养箱中记录TER（参见图2A)其中Sertoli细胞的密度为1×106细胞/厘米2如文中所述。

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图示支持细胞（Nu，支持细胞的细胞核）在接种在两院体培养单元上并用于记录TER后形成完整上皮的示意图。Millicell ERS电极的一根筷子（即较长的一端）插入基底室，而另一根筷（即较短的一端）放置在培养单元的顶端室。然后，短脉冲电流通过支持细胞上皮发送，并记录电阻（单位：Ω）。该技术监测TJ渗透屏障的完整性。支持细胞顶端的细胞质突起清晰可见(参见星号)这是体外培养支持细胞的典型特征。

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(一–c（c）)通过荧光显微镜评估支持细胞TJ屏障的功能特征。支持细胞培养在0.025×106细胞/厘米2在Matrigel™涂层玻璃盖玻片上，以使用FITC-结合的指骨肽可视化肌动蛋白(一，分子探针，尤金，俄勒冈州），使用抗闭塞素抗体的闭塞素(b条，Invitrogen，San Francisco，CA）和使用抗ZO-1抗体的ZO-1(c（c），Invitrogen）。对于(b条)和(c（c）)使用与FITC结合的二级抗体观察闭塞素和ZO-1。支持细胞核用DAPI染色。Bar=10μm英寸(一)，适用于(b条)和(c（c）).

在使用之前，用于量化整个Sertoli细胞上皮的TER的电极（见下文）应在分离的早上放入70%乙醇（~5 ml）中，然后在记录TER前3小时放入F12/DMEM（~5 ml）中。

  1. 用于TER实验的Sertoli细胞必须首先以0.5–1.2×10的密度涂布在Matrigel™涂层培养基上6将剩余的Sertoli细胞镀在其他基底上（即100 mm培养皿、多孔板或玻璃盖玻片）之前，细胞数/cm。每个实验还必须包括无培养Sertoli细胞（即空白细胞）的Matrigel™涂层培养单元，以进行背景减影。
  2. 在电镀细胞时，应注意避免在培养单元的内侧（即硝化纤维素膜与塑料接触的地方）捕获气泡。如果发生这种情况，请使用带有1ml吸管尖端的Gilson吸管重新悬浮Sertoli细胞，同时去除气泡。
  3. 每个双腔培养单元放置在24个多孔板的一个孔中。每个培养单元应位于24孔的中心。每个培养单元室中培养基的最大体积应为500μl（基底室和顶端室）。补充生长因子的F12/DMEM应每天更换。
  4. 重要的是，支持细胞均匀地贴在培养基上。在电镀Sertoli细胞后，将含有培养单元的24孔板在室温下放置在罩中约5-10分钟，然后将其放入CO中2孵化器。播种后立即将培养皿放入培养箱中，会使培养皿/培养孔/培养单元中心的细胞聚集，导致一个培养单元内的TER发生变化。
  5. Millicell ERS流量计以及电极应首先按照供应商的指示进行测试。量程应设置为2000Ω，仪表上的模式应设置为电阻。
  6. 第一次TER测量应在电镀细胞后约24小时进行，然后每天将一个电极放置在心尖腔中，另一个电极放在基底腔中。值得注意的是，在将Sertoli细胞电镀到培养单元上后，不能立即获得可靠的TER读数，因此必须在获得第一个读数之前培养细胞24小时。每个两院制培养单元应在12、3、6和9点钟位置记录总共四个读数，并将这些读数平均为一个TER读数。
  7. 含有培养基的多孔板在记录TER之前必须在室温下，以避免TER读数出现波动。从培养箱中取出培养板，让它们在室温下放置20分钟，然后记录TER。
  8. 记录TER时，Millicell ERS电极应直立在井内，培养单元应位于24井的中心。一个约2s的电流脉冲（约20μA）应通过细胞上皮，并应记录这个数字。
  9. F12/DMEM应在记录TER之后（而不是之前）更换。
  10. 无需冲洗培养单元之间的电极。然而，如果实验涉及用不同的化学物质/化合物处理Sertoli细胞，则可以将电极浸入含有F12/DMEM的井中，以冲洗电极。每个治疗组或对照组应包含至少四个重复的两院制单位，以获得足够的数据进行统计分析。每个实验应至少重复三次，以评估再现性。
  11. TER记录如下：电阻未知的−电阻空白的=电阻计算的×有效表面积=Ωcm2。

4.注意事项

4.1. 支持细胞培养物的制备

值得注意的是，从20日龄大鼠分离并在体外培养的支持细胞是分化细胞(35)因为它们在出生后第15-17天停止分裂，此时体内建立了血液-试验屏障。此外，这些细胞建立了TJ的超微结构，即基础外质特化[睾丸特异性非典型粘附连接类型(39)]48小时内用电子显微镜检查缝隙连接和桥粒连接(15)模拟体内BTB的超微结构特征。这些形态学观察结果也与图1，说明了将Sertoli细胞镀到Matrigel-coated双腔单元后约24–48小时内TJ-屏障的建立。下面列出了监测Sertoli细胞TJ-通透性屏障功能的成功实验的一些注意事项。

  1. 在Matrigel-coated双腔装置上镀上适当的Sertoli细胞密度对于获得可靠且可重复的TER读数至关重要，因为双腔装置的整个表面积必须覆盖Sertoli电池，以防止TJ屏障“泄漏”。我们注意到，使用0.75-1.2×10范围内的Sertoli细胞密度6支持细胞/cm2如前所述，获得了这类实验的最佳数据(40)因为在这个细胞密度范围内，两房单位上的细胞上皮由一个柱状的支持细胞层组成(41–43)与体内观察到的Sertoli细胞相似。然而，当使用更高的支持细胞密度时，例如1.5–2×106细胞/厘米2，支持细胞开始堆积成多层(41). 尽管这种情况只发生在两房单元上的少数补丁区域，但在这些高细胞密度培养物中检测到坏死(41)从而导致细胞溶解，产生一小块没有健康支持细胞的区域，导致TJ屏障“渗漏”(22,40). 为了制备Sertoli细胞进行免疫印迹以评估治疗组与对照组稳态蛋白水平的变化，我们建议使用0.5×10的细胞密度6细胞/厘米2，这将产生足够的蛋白质裂解物用于探测不同的标记蛋白。
  2. 如果打算使用这些支持细胞培养物从形态学上评估不同治疗和/或药物/化学品/试剂对支持细胞TJ-屏障的影响，例如使用荧光或共焦显微镜的双标记免疫荧光分析，细胞密度约为0.02–0.05×106细胞/厘米2建议使用(27,44–46)（请参见图3). 如果使用更高的细胞密度，当DAPI染色观察细胞核时，支持细胞会变得过于紧密，从而难以观察支持细胞-支持细胞界面处蛋白质定位的变化，特别是蛋白质的重新分布。然而，在这种较低的细胞密度下，培养皿、玻片或盖玻片上的一些选定区域可能不会被支持细胞覆盖，但由于分析仅限于使用荧光显微镜或共焦显微镜来评估支持细胞-支持细胞界面上蛋白质定位和/或重新分布的变化，这既不会影响数据分析，也不会影响实验的目的。
  3. 同样重要的是，应不时（例如每2–3个月）使用精原细胞、精母细胞、，精子细胞和Leydig细胞，如前所述(33,34). 还需要通过电子显微镜监测TJ、基底ES、桥粒样连接的超微结构，以及通过生理技术建立功能性TJ通透性屏障，以评估所述的整个支持细胞上皮的TER(15,47,48).

4.2. 通过记录支持细胞上皮的TER来评估支持细胞TJ-通透性屏障

为了在给定实验中获得可重复且可靠的TER读数，以评估Sertoli细胞TJ-通透性屏障功能，以下是需要采取的一些额外预防措施。

  1. 如上所述，支持细胞密度为0.75–1.0×106细胞/厘米2建议评估Sertoli细胞TJ-渗透屏障。在这个范围内，Matrigel-coated双腔单位的整个表面积将覆盖一层柱状支持细胞。这将在细胞上皮上产生稳定的TER读数。使用前应注意让Matrigel-coated单元干燥过夜（至少8-10小时），以便为Sertoli细胞上皮提供支架支撑。
  2. 如果低张治疗(32)用于获得纯度>98%的Sertoli细胞培养物，在用F12/DMEM清洗步骤中，必须轻轻处理Matrigel-coated双腔单元上的细胞上皮，以避免扰动细胞上皮，造成人为“泄漏”，导致整个Sertoli上皮细胞的TER损失。我们还使用胶原蛋白凝胶涂层的双腔单位来替代Matrigel，但这些实验的结果无法与Matrigel的使用相媲美，因为TER读数不太稳定。
  3. 由于Millipore ERS系统将使用数天（至少5-7天），因此检查系统是否正确校准、电池电量是否最佳以及电极对是否正常工作非常重要。这一点很重要，因为ERS系统和电极的任何不必要的变化都会导致基线TER读数的人为偏移，从而导致实验中不同时间点之间的TER读数波动。
  4. 同样重要的是，与对照组相比，每个治疗组至少有一套三联的两院制单位。如果实验由经验不足的研究人员进行，可以考虑每个治疗组（包括对照组）使用五个重复。

工具书类

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