雷帕霉素抑制剂的ATP竞争性哺乳动物靶点研究雷帕霉素耐药功能mTORC1型^*S⃞

摘要

雷帕霉素的哺乳动物靶点（mTOR）^三路径是被认为是细胞生长的主要调节器。mTOR丝氨酸/苏氨酸激酶是该途径的基础组成部分，也是两个途径的催化亚单位功能不同的蛋白质复合物，mTORC1和mTORC2。mTORC1包含大蛋白猛禽，以及mLST8/GβL和PRAS40，而mTORC2由蛋白质Rictor定义，还包括Sin1、Protor和mLST8/GβL(1). 增长胰岛素和IGF等因子激活这两种复合物，它们是PI3K/PTEN信号网络的重要下游效应器(2). 此外氨基酸和葡萄糖等营养物质的可用性调节mTORC1。

对mTOR信号的许多见解来自对雷帕霉素的作用机制雷帕霉素是一种细菌产生的大环内酯类抑制剂mTOR作为抗真菌药物具有多种临床应用，免疫抑制剂和抗癌药物(三). 雷帕霉素通过需要与细胞内结合的异常变构机制受体FKBP12，用于抑制其靶点。在急性治疗中，雷帕霉素被认为选择性抑制mTORC1，这通常被称为雷帕霉素敏感复合物。相反，考虑mTORC2雷帕霉素不敏感，尽管其组装可被长期抑制某些细胞类型的雷帕霉素治疗(4). 因为它的感知雷帕霉素的效力和选择性在研究实验中常用作mTORC1参与特定过程的测试。

两种下游mTORC1底物，部分通过其对雷帕霉素的敏感性是S6激酶（S6K1和S6K2）和翻译抑制剂4E-BP1。这两种蛋白质在mTORC1和细胞生长机制，主要通过其对cap相关翻译（参考文献。5). 所有核编码mRNA具有5′，7-甲基鸟嘌呤核苷帽，可被识别和结合小蛋白eIF-4E。在促生长条件下，eIF-4E也与大支架蛋白eIF-4G、eIF-4A解旋酶结合，以及eIF-4B调节蛋白，共同形成eIF-4F复合物。这个复合物与eIF3起始前复合物一起传递mRNA并启动翻译装置。4E-BP1型通过绑定到eIF-4E并阻止形成来干扰此过程功能性eIF-4F复合体。然而，它这样做的能力受到了以下因素的阻碍四个位点的磷酸化，其中两个被考虑雷帕霉素敏感。S6K1也在调节翻译通过磷酸化40S核糖体亚基的S6蛋白和通过刺激eIF-4A解旋酶活性(6-8).

尽管mTORC1与平移机械相连奇怪的是，雷帕霉素对哺乳动物细胞生长和增殖的影响，比它在酵母中的作用还轻。在酿酒酵母，雷帕霉素治疗会导致类似饥饿的状态，包括严重的G公司₁/S细胞周期阻滞和翻译起始抑制低于未处理细胞的20%(9). 此外，在酵母中雷帕霉素强烈促进自噬（自噬）的诱导，这一过程是通过哪些细胞消耗细胞质蛋白质、核糖体和细胞器，例如线粒体，以维持足够的氨基酸和其他营养素(10).

雷帕霉素在哺乳动物细胞中的作用与在酵母中的作用相似，但通常不太引人注目，而且高度依赖细胞类型。对于例如，雷帕霉素仅在有限数量的细胞中引起细胞周期阻滞类型和对蛋白质合成有适度影响(11-13).此外，雷帕霉素是一种相对较差的自噬诱导剂，通常是与PI3K和mTOR抑制剂LY294002联合使用(14). 这些不一致这些影响可能解释了为什么尽管人们对雷帕霉素寄予厚望，但它只起到了临床抗癌治疗的成功率有限。我们假设雷帕霉素对特定癌症的疗效可能是由其抑制mTORC2和mTORC1的能力决定(15). 为了验证这个假设，我们开发了ATP竞争抑制剂Torin1，它可以抑制这两种复合物。与雷帕霉素相比，Torin1治疗在哺乳动物细胞的许多表型是由酵母中TOR抑制引起的。然而，令人惊讶的是，我们发现这些效应与mTORC2无关而是由雷帕霉素抵抗功能的抑制引起的mTORC1。

实验程序

材料-试剂来自以下来源：磷酸化-Thr-389 S6K、磷酸化-Ser-473 Akt、磷酸化-Thr-308 Akt抗体，pan-Akt、磷酸化-Thr-36/47 4E-BP1、磷酸化-Ser-65 4E-BPl、磷酸化Thr-704E-BP1、4E-BPl、α-微管蛋白、猛禽、eIF-4E、磷酸化-S51 eIF2α、，细胞信号技术中的cyclin D1、cyclin D3和p27/Kip1（注：我们尚未确认磷酸化-Thr-70 4E-BP1抗体未检测到非磷酸化4E-BP1）；抗mTOR、S6K和辣根的抗体过氧化物酶标记的抗小鼠、抗山羊和抗兔二级抗体来自圣克鲁斯生物技术公司；来自Bethyl的抗立克次体抗体实验室；罗氏应用FuGENE 6和完整蛋白酶混合物科学；FLAG M2抗体、FLAG M2-糖和来自Sigma的ATP；来自GE Healthcare的7-甲基-GTP-Sepharose；Calbiochem的PI-103；NVP-BEZ235型来自Axon Medchem；LC实验室的雷帕霉素；PI3K-α来自Millipore/Upstate；CellTiter-Glo、DNA-PK和来自普罗米加；阿凡提极性脂质磷脂酰肌醇和磷脂酰丝氨酸；EasyTag™快递³⁵S蛋白标记混合物和ATP[γ-³²P] PerkinElmer生命科学公司的EasyTide；Dulbecco的SAFC Biosciences改良Eagle培养基；灭活胎牛血清来自Invitrogen。第53页^-/-/TSC2型^-/-MEF以及第53页^-/-/TSC2系统^+/+MEF由David提供Kwiatkowski（哈佛医学院），在Dulbecco的改良含有10%灭活胎牛血清的Eagle's培养基。第53页^-/-/最低有效温度8^-/-和第53页^-/-/里克托^-/-MEF已描述(16). 合成了Torin1并在格雷实验室进行纯化，可根据要求提供。

细胞裂解-用冰镇PBS冲洗一次的细胞被溶解冰冷的裂解缓冲液（40米米HEPES，pH 7.4，2 m米EDTA、，10米米焦磷酸盐，10 m米甘油磷酸和0.3%CHAPS或1%Triton X-100，每25片含1片EDTA-游离蛋白酶抑制剂ml）。细胞裂解物的可溶部分通过离心分离13000 rpm，在微型离心机中保持10分钟。

哺乳动物慢病毒shRNA-获得所有shRNA载体来自Broad Institute的RNAi联盟(17). 这些shRNAs被命名为RNAi联盟公共网站上的数字：老鼠猛禽shRNA，TRCN0000077472，{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_028898”，“term_id”：“807045913”，“term_text”：“NM_028899”}}NM_028898号.1-3729s1c1；和小鼠Rictor shRNA，TRCT0000037708，{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_030168”，“term_id”：“168480119”，”term_text“：”NM_030166“}}NM_030168号.2-867s1c1。shRNA编码质粒ΔVPR包膜和水泡性口炎病毒G共转染利用FuGENE 6转染将质粒包装成活性生长的HEK-293T上述试剂(18，19). 含病毒转染后48小时收集上清液并过滤至清除细胞，在8μg/ml浓度下感染靶细胞聚乙烯。24小时后，用嘌呤霉素筛选细胞，并在感染后第4天。

代谢标记-细胞接种在6孔板中一夜之间长大。然后用适当的化合物处理细胞2.5小时，用不含半胱氨酸/蛋氨酸的Dulbecco改良Eagle’s洗涤一次培养基，然后在2ml半胱氨酸/无蛋氨酸Dulbecco’s中培养改良Eagle's培养基，10%透析灭活胎牛血清，化合物，EasyTag™EXPRESS的165μCi（15μl，11 mCi/μl）³⁵S蛋白标记混合物。30分钟后，细胞被裂解通过13000 rpm离心10分钟分离可溶性部分沉淀蛋白、裂解物被发现在沃特曼滤纸上，用5%三氯乙酸沉淀，冷洗两次5分钟10%三氯乙酸，在冷乙醇中清洗两次2分钟，清洗在丙酮中一次2分钟并在室温下空气干燥。金额属于³⁵使用Beckman测量蛋白质中的SLS6500闪烁计数器。

mTORC1和mTORC2体外激酶分析-产生可溶性mTORC1，我们生成了稳定表达N末端的HEK-293T细胞系使用水疱性口炎病毒G-假型MSCV标记的猛禽逆转录病毒。对于mTORC2，我们同样生成了稳定表达HeLa细胞N端标记有FLAG的Protor-1。两种复合物都通过赖氨酸纯化50米内的电池米HEPES，pH 7.4，10 m米钠焦磷酸盐，10 m米β-甘油磷酸钠，100米米氯化钠，2米米乙二胺四乙酸，0.3%CHAPS。细胞在4时被裂解°C持续30分钟，通过以13000 rpm微离心10分钟。上清液与FLAG-M2单克隆抗体-葡萄糖1小时，然后用裂解缓冲液和一次含有最终浓度的裂解缓冲液0.5米氯化钠。用100μg/ml 3×洗脱纯化的mTORC150m内的FLAG肽米HEPES，pH 7.4，100 m米氯化钠。洗脱液可在-80°C下进行校准和储存。基底S6K1和Akt1为如前所述纯化(16，20). 激酶分析为在30°C下进行20分钟，最终体积为20μl，包括激酶缓冲液（25 m米HEPES，pH 7.4，50 m米氯化钾，10米米氯化镁₂, 500 μ米ATP）和150 ng非活性S6K1或Akt1作为基底。通过添加80μl样品缓冲液，煮沸5分钟。随后取样品通过SDS-PAGE和免疫印迹分析。

PI3K和hVps34分析-蜂窝IC₅₀的值用p53测定PI3Kα^-/-/最低有效温度8^-/-MEF公司。用载体或增加化合物浓度处理细胞1h，然后溶解。Akt Thr-308的磷酸化由使用磷酸特异性抗体进行免疫印迹。体外集成电路₅₀PI3Kα的值如前所述确定(21). 简单地说，氯仿磷脂酰肌醇（PI）和磷脂酰丝氨酸的库存被合并到等摩尔比，在氮气下干燥，在50 m内重悬米HEPES，pH 7.4，100 m米KCl，使用浴缸进行声音处理以达到清晰效果声波仪，并在-80°C下校准和储存。用于激酶分析，纯化PI3Kα与100μ米磷脂酰丝氨酸/磷脂酰肌醇，化合物和10μCi[γ-³²P] ATP（100μ米最终浓度）in激酶缓冲液并在37°C下培养20分钟。反应停止带有1n个盐酸。脂质用氯仿：甲醇，在硅胶TLC板上分离。³²P标记磷脂酰肌醇3-磷酸通过磷成像仪定量。hVps34是提纯为谷胱甘肽S公司-HEK-293T的转移酶融合蛋白单元格(22)并使用同样的程序。

ATM和DNA-PK-对于DNA-PK激酶分析，纯化的DNA-PK-与DNA-PK肽底物结合（源自N末端序列p53）、化合物和10μCi/反应[γ-³²P] ATP（100μ米最终浓度）在激酶缓冲液中培养1037°C时最小值。用1停止反应n个HCl和斑点在P81磷酸纤维素方块上。P81方块洗了三次，每次5次在0.75%磷酸中放置至少一次，在丙酮中放置5分钟，干燥后用闪烁计数器测量。自动取款机在体外激酶分析根据先前发布的协议执行(21).

细胞大小测定-细胞接种在10-cm培养基中过夜种植并经过适当处理的菜肴。24小时后，用胰酶消化法收集细胞，体积为5ml，用1:20稀释计数溶液（同位素II稀释剂，Beckman Coulter）和细胞直径使用粒度计数器（Coulter Z2，Beckman Coulter）和Coulter Z2 AccuComp软件。

细胞增殖/活性测定-细胞存活率为通过CellTiter-Glo-发光细胞活性测定进行评估。第0天，96-well板每孔接种500个细胞，隔夜培养。当天1，用适当的化合物处理细胞，然后进行分析第3-5天。为了进行分析，将平板在室内培养60分钟温度；向每个孔中添加50μl CellTiter-Glo试剂，并且将平板在轨道振动筛上混合12分钟。荧光定量在标准板光度计上。

细胞周期分析-细胞接种在15厘米的培养皿中隔夜生长。然后对48个细胞进行适当的处理h，然后胰蛋白酶化，在PBS+2%FBS中洗涤两次，然后固定过夜在4°C乙醇中。然后在PBS+1%BSA中清洗细胞三次在PBS、1%BSA、50μg/ml碘化丙啶和100μg/ml核糖核酸酶中培养37°C下30分钟。然后在PBS+1%BSA中清洗细胞1倍，在1ml PBS中重新悬浮，并使用FACS-Calibur流式细胞仪（BD）进行分析生物科学）。使用ModFit LT测定细胞周期分布软件包。

结果

Torin1是一种有效的选择性mTOR抑制剂-要识别mTOR的小分子ATP-竞争性抑制剂杂环文库中mTOR激酶活性抑制剂的筛选化合物。从这个屏幕上，我们识别出一种铅化合物通过药物化学研究进一步阐述了Torin1吡啶酮喹啉类激酶的成员抑制剂。⁴在在里面体外使用免疫纯化的mTORC1或mTORC2、Torin1进行激酶分析用IC抑制两种含mTOR的复合物₅₀值介于2之间和10 n米(图。1A类)并通过ATP竞争机制采取行动(图1B类). 我们还测量了Torin1在细胞中的效力。MEF治疗增加Torin1或mTOR/PI3K双抑制剂PI-103和NVP-BEZ235的量，以及通过监测磷酸化来测定每个复合物的活性S6K在Thr-389和Akt在Ser-473、mTORC1和mTORC2基板上的状态，分别(图。1C类). 作为在体外、IC₅₀对于Torin1细胞内也在2到10n之间米与雷帕霉素不同，Torin1有对mTORC1或mTORC2的稳定性无影响。

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图1。

Torin1是一种有效的选择性mTOR抑制剂。 A、，托林1抑制mTORC1和mTORC2在体外.纯化了mTORC1和mTORC2来自稳定表达FLAG-Raptor的HEK-293T和表达分别为FLAG-Protor-1。在FLAG纯化后，每个复合物受到在体外使用S6K1作为底物进行激酶分析mTORC1和Akt1作为mTORC2的底物。分析结果由所示蛋白质和磷酸化状态的免疫印迹。B、，Torin1是一种ATP竞争性抑制剂。这个在体外纯化的mTORC1对S6K1的激酶活性在20个米Torin1和ATP浓度增加，如图所示。然后通过免疫印迹分析所示蛋白质和磷酸化状态。C、，Torin1是一个强大的mTORC1和mTORC2细胞中的抑制剂。MEF（p53^-/-)接受了越来越多的治疗Torin1或双mTOR/PI3K抑制剂PI-103和BEZ-235的浓度1h，然后通过免疫印迹分析指示的蛋白质和磷酸化状态。D、，Torin1对PI3K几乎没有影响mTOR被完全抑制的浓度。实验是按中的方式执行C类使用mLST8-null MEF和Akt磷酸化用免疫印迹法测定Thr-308。在mLST8-null MEF中，mTORC2为无活性，Akt Ser-473被组成性去磷酸化，因此PDK1介导的Thr-308磷酸化仅反映PI3K活性。E、，Torin1对相关激酶的mTOR具有选择性。集成电路₅₀Torin1的值由以下公式确定在体外激酶分析mTOR（3个米)，hVps34（3μ米)，PI3K-α（1.8μ米)，DNA-PK（1.0μ米)和ATM（0.6μ米). 集成电路₅₀mTOR的PI-103值（120n个米)，PI3K-α（100 n米)，DNA-PK（40 n米)通过相同的分析测定。集成电路₅₀PI-103的值hVps34（10μM）和ATM（1.0μ米)之前已确定(21).F、，Torin1是相对于其他PI3K亚型，mTOR具有选择性。欧盟委员会₅₀值为使用Invitrogen Adapta测定指示的PI3K亚型平台。欧盟委员会₅₀mTOR使用基于细胞的LanthaScreen平台。

接下来，我们确定了Torin1对mTOR的选择性高于其他激酶。因为mTOR属于PI3K-like激酶家族，是一个蛋白质家族由PI3K的高度同源性定义的激酶催化域，许多PI3K抑制剂，如沃特曼、LY294002、，PI-103和BEZ-235也是合理的mTOR抑制剂(21，23，24). 测量PI3K我们利用观察到的磷酸化Thr-308的Akt取决于直接反映PI3K的两个过程活性：磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸依赖性靶向AktPDK1的质膜和活化磷酸化这个位点。在野生型细胞中，Thr-308的磷酸化是也受Ser-473磷酸化的影响(19，25，26). 要删除后者变量，我们测试了MEF中的化合物，其中mLST8是一种重要的mTORC2组分被删除，Akt Ser-473组成性去磷酸化。因为Ser-473在这些细胞系中是以单一状态固定的，Thr-308的磷酸化仅反映PI3K活性。使用这个系统，我们确定了蜂窝IC₅₀PI3K为～1.8时，Torin1的μ米(图。1D类)，几乎与我们的在体外IC的测量₅₀对于PI3Kα(图1E类). 我们还使用Adapt将我们的化合物与其他PI3K亚型进行比较在里面体外证实mTOR具有高度选择性的分析方法(图1F类).

抑制PI3K和mTOR的化合物也可能抑制其他PI3K样激酶，包括DNA损伤反应激酶ATM和DNA-PK.对于DNA-PK和ATM，我们测量了IC₅₀使用Torin1的在体外化验(图。1E类). 我们还测量了III类PI3K的抑制作用一些报告提出hVps34作用于mTORC1的上游，我们希望确保与该激酶的交叉反应不是间接的影响细胞中mTORC1活性(22). Torin1至少是每种激酶对mTOR的选择性为200倍。最后，我们筛选了Torin1，浓度为10μ米对着353块板子使用Ambit Biosciences KinomeScan筛选平台的多种激酶，它测量目标分子与每个激酶的相对结合，以及我们没有发现明显的离靶效应（数据显示于补充材料）。这些结果表明，Torin1是一个高度mTOR的选择性抑制剂丝氨酸/苏氨酸、酪氨酸和脂质激酶。

Torin1通过抗雷帕霉素机制引起细胞周期阻滞这也与mTORC2无关-我们的下一个目标是测试mTOR信号在正常生长细胞中的作用。雷帕霉素介导的mTORC1抑制作用减缓细胞增殖并缩小细胞大小，因此我们怀疑双mTORC1/2抑制将产生类似但更严重的影响(22). 事实上，野生型MEF处理量高达500 n米雷帕霉素继续增殖，尽管速度有所降低(图。2A类和补充图S2）。相比之下，250n个米Torin1完全抑制增殖(图2A类和补充图S2）并导致G₁/S细胞周期阻滞(图2B类). 此外，250牛顿米Torin1使细胞大小减小到大于50n个米雷帕霉素(图。2C类). 基于雷帕霉素完全禁用mTORC1激酶活性，我们假设Torin1是因为mTORC2抑制。

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图2。

mTOR抑制通过mTORC2-依赖机制。 A、，Torin1抑制mTOR，但雷帕霉素不能阻止野生型MEF的增殖。MEF公司（第53页^-/-)细胞在载体存在下生长(蓝色)，50牛顿米雷帕霉素(橙色)，或250n个米托林1(绿色)持续4天。细胞增殖使用CellTiterGlo在指定的时间点测量三次活性测定。B、，Torin1导致G₁/S细胞周期阻滞在野生型MEF中。MEF（p53^-/-)细胞用载体处理（二甲基亚砜），50 n米雷帕霉素(拉帕)，或250 n米Torin1持续48小时。然后收集细胞，用碘化丙啶染色，并流式细胞仪分析。C、，标准化细胞大小分布Torin1和雷帕霉素治疗的野生型MEF。MEF（p53^-/-)单元格用车辆进行治疗(蓝色，平均17.81μm），50 n米雷帕霉素(橙色，平均值17.58），或250 n米托林1(绿色，24小时平均16.46μm）。使用粒子计数器和显示为直方图。D、，实验是按中的方式执行A类使用Rictor^-/-，p53^-/-MEF公司。E、，实验的执行方式如下B类使用里克托^-/-，p53^-/-中小微企业。F、，实验是按中的方式执行C类使用Rictor^-/-，p53^-/-MEF公司。用载体处理细胞(蓝色，平均直径17.85μm），50n个米雷帕霉素(橙色，平均直径17.33μm），或250n个米托林1(绿色，平均直径16.24μm）。

为了验证这个假设，我们使用MEF进行了相同的实验缺少mTORC2活动，因为Rictor已被删除(16). 我们推断Torin1应具有与雷帕霉素相同的增殖和生长作用因为mTORC2已经被抑制。与野生型MEF一样，雷帕霉素减少但不阻止增殖(图2D类). 然而，我们惊讶地发现，Torin1继续戏剧性地压制增殖和缩小细胞大小(图。2,D类-F类)，表示差速器该化合物对雷帕霉素的影响不是由于mTORC2抑制。因此，mTOR具有细胞绝对需要的功能生长和增殖依赖于激酶，雷帕霉素耐药，与mTORC2无关。

Torin1对mTORC1依赖性表型的干扰比雷帕霉素-尽管普遍持有相反的假设对我们结果的解释是雷帕霉素抑制了部分但不是全部mTORC1的函数。为了探索这种可能性，我们研究了Torin1对生长和增殖以外的其他过程与mTORC1信号传导相关。其中一个过程是宏观自噬，通常简称为自噬。通常被认为是对饥饿的反应条件下，自噬涉及形成封闭的大双层膜吞噬细胞质内容物的小泡，包括蛋白质和细胞器（参考文献。27). 这些小泡然后融合溶酶体形成自噬体，消化其内容物，提供含有氨基酸和其他营养物质的细胞可从环境中获得。

在酵母中，雷帕霉素是一种有效的自噬激活剂(10). 情况就不那么严重了在哺乳动物系统中很明显，雷帕霉素本身充其量是一种不一致的自噬激活剂，经常需要与其他物质结合PI3K/mTOR抑制剂，如LY294002，或伴随饥饿营养物。我们怀疑自噬也可能在一定程度上受到mTORC1的雷帕霉素耐药功能。一种常用的自噬标记是蛋白质轻链3（LC3），它从细胞质转移到诱导自噬时降解的自噬体(28). 使用绿色荧光蛋白标记的LC3构建物，我们发现Torin1导致两种野生型LC3从细胞质到自噬体的再定域和Rictor^-/-MEF，而雷帕霉素仅引起轻微变化(图3A类).此外，我们发现Torin1治疗，如氨基酸饥饿，导致LC3B（LC3B-I）劣化和更快的MEF和HeLa细胞中的流动脂形态（LC3B-II）(图3B类和补充图S4A类). RNA干扰导致猛禽的表达以与Torin1治疗相似的方式影响LC3（补充图S4B类). 总的来说，这些结果表明mTORC1抑制足以诱导自噬。虽然信号将mTORC1与自噬联系起来的机制目前尚不清楚，ATP-竞争性抑制剂，如Torin1，可能会揭示mTORC1，由于其对雷帕霉素不敏感而被遗漏。

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图3。

Torin1抑制耐雷帕霉素。 A、，Torin1但不是雷帕霉素(拉帕)导致LC3从细胞质重新定位到自噬体。野生型（第53页^-/-)或Rictor-null（p53^-/-)MEF是短暂的转染GFP-LC3并用载体处理(车辆)（二甲基亚砜），50n个米雷帕霉素，或250n米Torin1 3小时后已修复并处理。细胞也用Hoechst染色以显示细胞核并在×63处成像。B、，氨基酸饥饿和Torin1，但不是雷帕霉素会导致LC3降解。野生型（p53^-/-)和里克托-努尔（p53^-/-)MEF用载体（DMSO）治疗，50n个米雷帕霉素，250 n米Torin1或生长在氨基酸中(AA公司)-自由条件下0、1、3或6小时。细胞在指示时间点并进行免疫印迹分析。自噬的诱导导致本机LC3B降级(LC3B-I型)蛋白质和快速运行的lipidated版本的瞬态累积(LC3B-II型).C、，Torin1抑制全局蛋白质合成通过雷帕霉素耐药和mTORC2依赖性过程。野生型（第53页^-/-)和Rictor无效（p53^-/-)MEF用车辆（DMSO），50 n米雷帕霉素(说唱)，250牛顿米Torin1或10μg/ml环己酰亚胺(Chx公司)2.5小时，然后脉冲具有³⁵S-标记蛋氨酸和半胱氨酸30分钟³⁵通过闪烁计数测定S的掺入。测量一式三份误差线表明标准偏差。

mTORC1通路也与调节与cap相关的翻译。然而，雷帕霉素通常对蛋白质合成速率。测试Torin1是否可以抑制蛋白质合成更全面，我们使用³⁵S公司在Torin1或雷帕霉素存在下的蛋氨酸/半胱氨酸。令人惊讶的是，虽然雷帕霉素的作用很小，但Torin1几乎引起了野生型和里克托^-/-MEF公司(图。三C类). 与自噬一样，这些结果表明与实验相比，mTORC1是蛋白质合成的重要调节因子与雷帕霉素有指示。

mTORC1的抗雷帕霉素功能是Cap-dependent所必需的翻译-因为已知的mTORC1基板S6K和4E-BP1mRNA翻译的重要调节器，我们接下来考虑是否两者都是参与mTORC1依赖但雷帕霉素耐药的转导功能。雷帕霉素完全抑制S6K活性因此，我们认为它不太可能成为任何mTORC1的雷帕霉素耐药活性。然而，4E-BP1受到更多复杂的监管过程。4E-BP1结合和抑制eIF-4E的能力主要由四个残基的磷酸化调节：Thr-37，Thr-46、Ser-65和Thr-70。Thr-37和Thr-46的磷酸化被认为是是允许其他两个磷酸化的启动事件，因此促进与eIF-4E的分离并允许形成功能性eIF-4F复合体(29). mTORC1已经牵涉到4E-BP1的监管，但对这种联系的重要性以及潜在的机制。对于例如，mTORC1磷酸化Thr-37和Thr-46位点在体外，但这些位点被认为是细胞中雷帕霉素不敏感的(30-32).相反，mTORC1几乎没有影响在体外关于磷酸化雷帕霉素敏感位点的Ser-65和Thr-70。此外，4E-BP1中的一个C末端基序，称为TOR信号基序，被认为与mTORC1的中介结合，以及N末端RAIP基序是必需的所有位点的磷酸化(33-35).最后，尽管雷帕霉素导致整体蛋白质的大幅下降某些单元格类型中的翻译(36)，它几乎没有对他人的影响(13). A类可能的解释很简单，雷帕霉素不能完全抑制4E-BP1的mTORC1依赖性磷酸化。

为了验证这一假设，我们用越来越高浓度的Torin1或雷帕霉素，并评估Thr-36的磷酸化状态，免疫印迹法测定Thr-47、Ser-65和Thr-70(图4A类). 雷帕霉素完全阻止S6K1的磷酸化，导致4E-BP1的Ser-65磷酸化，但对即使在高浓度下，Thr-37/46或Thr-70的磷酸化作为500 n米，大于其IC的500倍₅₀价值用于抑制mTORC1(图。4A类). 与此形成鲜明对比的是，Torin1在很大程度上在低浓度下抑制Thr-37/46和Ser-65的磷酸化10个米在250海里彻底废除米(图4A类). Torin1已经Rictor-null MEF中几乎相同的效应，与假设一致这些影响是由于mTORC1的抑制(图4A类).令人惊讶的是，Thr-70不受Torin1或雷帕霉素的影响，支持早期预测它可能是另一种激酶的靶点，例如Erk2号机组(37). 或者，它Thr-70 4E-BP1抗体可能不是磷特异性的。这个PI3K/mTOR双抑制剂PI-103和NVP-BEZ235引起的效果与Torin1 on 4E-BP1磷酸化（补充图S3）。此外，Torin1在多种情况下，对4E-BP1磷酸化的影响比雷帕霉素大得多表明mTORC1对雷帕霉素的耐药性为可能是大多数（如果不是所有）哺乳动物系统的一般特征(图4E类). 我们接下来被问及Torin1增加4E-BP1去磷酸化是否导致增加与eIF-4E的关联。用7-甲基-GTP-乙脑纯化从细胞裂解物中提取的eIF-4E，我们发现Torin1导致更多与雷帕霉素相比，4E-BP1与eIF-4E的结合(图4，B类和F类). Torin1不影响eIF2的磷酸化（补充图S5）。

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图4。

mTORC1调节4E-BP1磷酸化并与eIF-4E结合揭示了雷帕霉素耐药功能。 A、，磷酸化Thr-37/46和Ser-65的4E-BP1依赖于mTORC1，但对雷帕霉素。野生型（p53^-/-)和Rictor-null（p53^-/-)用指定浓度的Torin1或雷帕霉素处理MEF1小时，然后溶解。细胞裂解物通过抗体免疫印迹分析特定于指示的蛋白质或磷酸化状态。B、，Torin1使与eIF-4E结合的4E-BP1的量增加到一定程度超过雷帕霉素的作用。野生型（p53^-/-)和里克托-努尔（p53^-/-)MEF用载体（DMSO）治疗，50n个米雷帕霉素，或250n米Torin1在裂解前1小时。使用7-甲基-GTP-Sepharose从裂解物中纯化eIF-4E，并通过所示蛋白质的免疫印迹。C、，磷酸化4E-BP1上的Thr-36/47需要Raptor，但不需要Rictor。MEF（p53^-/-)感染了表达对照、Raptor特异性或蓖麻毒素特异性shRNAs。细胞生长4天，然后用车辆（DMSO），50 n米雷帕霉素，或250n米Torin1代表1h.然后使用特异性抗体通过免疫印迹分析细胞裂解产物指示的蛋白质或磷酸化状态。D、，延长mTOR抑制改变关键细胞周期调节因子的表达。野生型（第53页^-/-)和Rictor-null（p53^-/-)MEF用载体（DMSO），50 n米雷帕霉素，或250n米Torin1代表48h.然后使用特异性抗体通过免疫印迹分析细胞裂解物用于指示的蛋白质。E、，Torin1阻止人类肿瘤细胞系中的雷帕霉素耐药位点。MCF7、HCT116、HeLa和用载体处理HEK-293T细胞系(车辆)，雷帕霉素(说唱)（50或250牛顿米)，或Torin1（50或250 n米)1小时，然后通过免疫印迹分析指示的蛋白质和磷酸化状态。F、，Torin1增加4E-BP1的量在人类癌症细胞系中与eIF-4E结合。处理MCF7和HCT116细胞带车辆（DMSO），50 n米雷帕霉素，50 n米Torin1，或250牛顿米Torin1裂解前48小时。eIF-4E纯化自使用7-甲基-GTP-脑葡萄糖裂解产物并通过免疫印迹分析指示蛋白质。

因为Torin1在野生型和Rictor-null MEF，我们得出结论，它们不能依赖于mTORC2。然而，仍有可能是mTOR单独或未知的mTORC3负责。为了证明mTORC1抑制足以解释Torin1对4E-BP1磷酸化的影响，我们使用RNA干扰敲除在野生型MEF中，向下猛禽是强制性的mTORC1组件(图4C类). 消耗这些细胞中的猛禽抑制了Thr-37/46和Ser-65的磷酸化4E-BP1迁移率达到了与Torin1效应相等的程度，并超过了雷帕霉素，从而支持mTORC1或至少含有Raptor的mTOR复合物，通过雷帕霉素敏感性激酶依赖机制。

已知帽依赖性翻译的缺陷也会导致细胞周期逮捕。这被认为主要是由于编码促进细胞周期进展因子的cap依赖性mRNA，如cyclin D1和cyclin D3，以及增加cap依赖性蛋白的翻译编码抑制因子的mRNA，如p27Kip1(38-40).此外，最近的研究表明，细胞周期蛋白D1的耗竭通过氨基酸饥饿和雷帕霉素处理由4E-BP1介导(41). 我们怀疑Torin1引起的细胞周期阻滞可能是由于这些因素的丰富性。与此一致，野生型和用Torin1而非雷帕霉素治疗48小时的里克托-努尔MEF，其疗效显著细胞周期蛋白D1和D3水平的降低以及p27/Kip1的强烈诱导(图4D类). 能力Torin1被移除后，从这次被捕中恢复的细胞数量非常高取决于单元格类型（未显示数据）。

讨论

雷帕霉素在整个TOR的历史中一直是不可或缺的工具研究并作为“完整”的mTORC1广泛使用研究和临床环境中的抑制剂。事实上，在酵母中，它是一种TORC1基因失活的令人信服的模拟。在哺乳动物系统中，大多数已知的mTOR底物是使用雷帕霉素作为药理学探针。雷帕霉素与细胞内蛋白质FKBP12，然后与mTOR的FRB结构域结合并抑制底物的磷酸化通过一种特征不明确的机制。虽然雷帕霉素的结构信息可用于与FKBP12和mTOR的FRB域，尚不清楚其如何防止直接mTOR激酶底物的磷酸化(42). 一个模型来解释我们的研究结果表明，雷帕霉素只阻断mTORC1的一个特定亚群基质，而Torin1由于其ATP-竞争作用模式，阻止所有蛋白的磷酸化。此外，由于Torin1比FKBP12-雷帕霉素，它可能在含有mTOR的比FKBP12-雷帕霉素更容易复合。

对最近几项研究的重新解释支持这样一种观点：相当多的mTORC1功能对雷帕霉素耐药。肖尔et（等）阿尔。(13)发现有那么高浓度（10μ米)雷帕霉素直接抑制mTOR通过FKBP12独立机制，抑制mTORC1和mTORC2。与常用的“低剂量”（10-50 n米)和与Torin1类似，“高剂量”雷帕霉素能有效抑制cap依赖性翻译和抑制多种细胞增殖肿瘤细胞系。尽管这些作者得出结论，这些影响是由于mTORC2抑制，我们的发现表明它们更可能因为雷帕霉素抗性mTORC1依赖性功能受到抑制。A类Averous的研究等。(41)发现氨基酸饥饿导致细胞周期蛋白D1比雷帕霉素更彻底的耗竭这种效应是通过4E-BP1介导的。基于这些作者得出结论，假设雷帕霉素完全禁用mTORC1氨基酸饥饿通过其他途径向4E-BP1发出信号除了mTORC1。我们认为氨基酸更有可能饥饿导致mTORC1功能比饥饿更完全的抑制雷帕霉素。最后，周等。(43)发现4E-BP1上对雷帕霉素敏感的磷酸化位点变得雷帕霉素长期作用后，某些细胞系发生再磷酸化治疗。此外，4E-BP1磷酸化的恢复取决于mTORC1组分猛禽，导致作者得出结论雷帕霉素治疗使mTORC1具有磷酸化4E-BP1的能力抗雷帕霉素的时尚。我们发现mTORC1可能有雷帕霉素在所有细胞系中的耐药功能(图4E类). 因为众所周知，长期雷帕霉素治疗会过度激活PI3K通路，这是mTORC1的上游，这是Choo结果的一个可能解释等。(43)是那个吗雷帕霉素导致抗雷帕霉素药物过度激活mTORC1的功能，有效克服由雷帕霉素。

因为TOR信号的许多重要特征在酵母和哺乳动物，我们发现mTORC1具有细胞必要性，但雷帕霉素耐药功能出乎意料。同时，我们的结果表明TORC1信号在维持蛋白质中的要求合成和促进细胞分裂在酵母和哺乳动物系统。虽然我们关注的是雷帕霉素对4E-BP1的不敏感调节，我们认为存在类似的mTORC1底物，尤其是在自噬。Torin1和磷酸蛋白质组学的未来联合应用很可能允许对所有mTOR基板进行更全面的评估。鉴于目前对雷帕霉素作为潜在治疗药物的热情，很可能是mTOR的ATP-竞争性抑制剂也将具有临床应用价值。

补充材料

致谢

笔记

^*这项工作得到了National的全部或部分支持卫生拨款研究所R01 AI47389和R01 CA103866。这项工作还得到了Dana启动资金的支持巴尔法伯癌症研究所基金会和Damon Runyon癌症凯克研究基金会（N.S.G.）基金会、LAM基金会和国防部拨款W81XWH-07-1-0448（给D.M.S.），以及来自美国癌症协会（致S.A.K.）。这个这篇文章的出版费用部分由下列款项支付页面费用。因此，必须在此标记此物品“广告“根据《美国法典》第18卷第1734节只是为了表明这一事实。

本文的在线版本（可在http://www.jbc.org)包含补充实验程序，图S1-S5，以及参考。

脚注

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