Autophagy regulates turnover of lipid droplets via ROS-dependent Rab25 activation in hepatic stellate cell

doi:10.1016/j.redox.2016.12.021

.2017年4月：11:322-334。

doi:10.1016/j.redox.2016.12.021。 Epub 2016年12月21日。

自噬通过ROS依赖性Rab25激活肝星状细胞调节脂滴周转

Zili Zhang先生¹, 赵世峰¹, 甄瑶¹, 王玲（Ling Wang）¹, 邵江娟², 陈安平^三, 张峰（音）¹, 郑世忠⁴

附属公司

¹南京中医药大学药学院药理学系，南京210023，中国。
²南京中医药大学药学院药学系，南京210023。
^三圣路易斯大学医学院病理学系。，美国MO 63104。
⁴南京中医药大学药学院药理学系，南京210023；南京中医药大学中药药理与安全性评价江苏省重点实验室，南京，中国。电子地址：nytws@163.com。

PMID： 28038427
PMCID公司： PMC5199192
内政部： 2016年10月10日/j.redox.2016.12.021

自噬通过ROS依赖性Rab25激活肝星状细胞调节脂滴周转

Zili Zhang先生等。氧化还原生物. 2017年4月.

.2017年4月：11:322-334。

doi:10.1016/j.redox.2016.12.021。 Epub 2016年12月21日。

作者

Zili Zhang先生¹, 赵世峰¹, 珍耀¹, 王玲（Ling Wang）¹, 邵江娟², 陈安平^三, 张峰（音）¹, 郑世忠⁴

附属公司

¹南京中医药大学药学院药理学系，南京210023，中国。
²南京中医药大学药学院药学系，南京210023。
^三圣路易斯大学医学院病理学系。，美国MO 63104。
⁴南京中医药大学药学院药理学系，南京210023；南京中医药大学中药药理与安全性评价江苏省重点实验室，南京，中国。电子地址：nytws@163.com。

PMID： 28038427
PMCID公司： PMC5199192
内政部： 2016年10月10日/j.redox.2016.12.021

摘要

肝星状细胞（HSC）的激活是肝纤维化的关键事件，其特征是脂滴（LD）急剧消失。尽管LD消失一直被认为是HSC激活的标志之一，但其潜在的分子机制基本上尚不清楚。在这项研究中，我们试图研究自噬在LD消失过程中的作用，并进一步研究这种分子背景下的潜在机制。我们发现在HSC激活期间LD的消失与自噬的协同增加有关。Atg5 siRNA对自噬的抑制或耗竭可损害静止HSC的LD消失，也可恢复活化HSC的脂肪细胞表型。相反，Atg5质粒诱导的自噬加速了静止HSC的LD丢失。重要的是，我们的研究还确定了活性氧（ROS）在促进自噬激活中的关键作用。抗氧化剂，如谷胱甘肽和N-乙酰半胱氨酸，可显著抑制活性氧的生成，进而阻止HSC激活期间自噬体的生成和自噬通量。此外，我们发现HSC激活触发Rab25过度表达，并促进Rab25和PI3KCIII的结合，从而引导自噬识别、包裹和降解LDs。使用Rab25 siRNA下调Rab25活性，阻断LDs自噬的靶点识别，并抑制静止HSC的LD消失。此外，清除过多的ROS可以破坏自噬与Rab25之间的相互作用，并增加细胞内脂质含量。总的来说，这些结果为揭示肝星状细胞激活过程中LD消失的分子机制提供了新的启示，也确定了ROS-Rab25依赖性自噬是治疗肝纤维化的潜在靶点。

关键词：自噬；肝星状细胞；脂滴；ROS；Rab25。

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数字

图1。 — 图1
**在HSC激活期间，LDs在细胞质中消失**新鲜分离的HSC培养7天。**（A）**α-SMA、前胶原1α1、Desmin和GFAP免疫染色显示HSC经历激活过程*体外试验。***（B）**尼罗河红染色显示从静止的原代HSC到激活的HSC的脂滴含量变化。**（C）**油红O（ORO）染色细胞的代表性图像和从静止的原代HSC到激活的HSC的ORO吸光度。**（D、E）**从静止的原发性HSC到激活的HSC的视黄醇、甘油三酯和胆固醇测量。对于本图中每个面板的统计数据，数据表示为平均值±SD（n=3）*与第0天相比P<0.05，**P<0.01与第0天相比较，***P<0.001与第0日相比较。

图2。 — 图2
**HSC激活期间，自噬体生成和自噬通量增加。**新鲜分离的HSC培养7天。**（A）**免疫印迹和密度分析显示LC3-II从静止的原代HSC对激活的HSC的反应。**（B）**Western blot和密度分析显示自噬指标从静止的原发性HSC到激活的HSC的变化。**（C、D）**Atg5和LC3-II免疫染色显示HSC激活期间自噬体生成增加。**（E）**P62免疫染色显示HSC激活期间自噬流量增加。**（F）**Western blot和密度分析显示HSC激活期间p62水平。**（G）**使用溶酶体抑制剂氯喹（CQ）评估自噬通量。**（H）**透射电镜（TEM）显示与原代HSC相比，活化HSC中的自噬体和自溶体增加。黑色箭头表示自噬体或自溶体结构。对于本图中每个面板的统计数据，数据表示为平均值±SD（n=3）*与第0天相比P<0.05，**P<0.01与第0天相比较，***P<0.001与第0日相比较。^##与第5天相比，P<0.01。

图3。 — 图3
**抑制自噬可阻止静止HSC的LD消失，并逆转活化HSC的脂肪细胞表型。**用对照siRNA或Atg5 siRNA处理新鲜分离的HSC，然后培养5天。**（A）**Western blot和密度分析显示LC3-I/II水平。**（B）**ORO吸光度显示脂滴含量的变化。**（C）**视黄醇和甘油三酯测量显示脂滴含量的变化。**（D）**尼罗河红染色显示细胞脂质含量的变化。用对照siRNA、对照病毒、Atg5-siRNA、3-MA或Bafilomycin A1处理活化的HSC。**（E）**TEM显示脂滴的含量。**（F、G）**ORO吸光度、视黄醇、甘油三酯和胆固醇测量显示脂滴含量的变化。对于本图中每个面板的统计数据，数据表示为平均值±SD（n=3）*与对照组相比P<0.05，**P<0.01与对照组，***P<0.001与对照组。

图4。 — 图4
**自噬的诱导加速了静止HSC中LD的消失。**用控制载体或Atg5质粒处理新鲜分离的HSC，然后培养5天。**（A）**Western blot和密度分析显示LC3-I/II水平。**（B）**ORO吸光度和视黄醇测量显示脂滴的含量。**（C）**尼罗河红染色和橄榄脂A免疫染色显示细胞脂质含量的变化。对于本图中每个面板的统计数据，数据表示为平均值±SD（n=3）*与对照组相比P<0.05，**P<0.01与对照组，***P<0.001与对照组。

图5。 — 图5
**在HSC激活期间，Rab25的过度表达是自噬降解LDs所必需的。（A）**新鲜分离的HSC培养7天。然后，用Western blot和密度分析检测Rab25的表达。用对照siRNA或Rab25-siRNA处理新鲜分离的HSC，然后培养5天。**（B）**ORO吸光度显示脂滴含量的变化。**（C）**视黄醇和甘油三酯测量显示脂滴含量的变化。**（D）**尼罗河红和Bodypy 493/503染色显示细胞脂质含量的变化。**（E）**新鲜分离的HSC培养7天。免疫沉淀分析显示PI3KCIII和Rab25的相互作用。**（F）**PI3KCIII和Rab25从静止的原发性HSC到激活的HSC的共同定位。**（G）**用Rab25-siRNA+控制载体或Rab25-siRNA+Atg5质粒处理新分离的HSC。采用ORO吸光度、视黄醇测定和尼罗红染色法测定脂滴含量。对于本图中每个面板的统计数据，数据表示为平均值±SD（n=3）*与对照组相比P<0.05，**P<0.01与对照组，***P<0.001与对照组。

图6。 — 图6
**ROS的产生在HSC激活过程中触发自噬激活和Rab25过表达。（A）**将新鲜分离的HSC培养7天。分别检测细胞内活性氧水平。新鲜分离的HSC培养5天，然后用NAC或GSH处理1小时。**（B）**测定细胞内ROS含量。**（C）**Western blot和密度分析检测LC3-I/II的表达。**（D）**P62免疫染色显示自噬流量。**（E）**免疫沉淀分析显示PI3KCIII和Rab25的相互作用。**（F）**尼罗河红染色和ORO吸光度显示细胞脂质含量的变化。对于本图中每个面板的统计数据，数据表示为平均值±SD（n=3）*与第0天相比P<0.05，**P<0.01与第0天相比较，***P<0.001与第0日相比较。

图7。 — 图7
线粒体H₂O（运行）₂GSH/GSSG比率的产生和降低在体外激活HSC期间触发自噬激活和LD消失。新鲜分离的HSC培养7天。（A）在37°C下用10 mM MitoPY1处理细胞（第0天和第5天）60分钟。将培养基换成含有DAPI的新鲜培养基（1.5 ml；10 mg/ml储备液）·H₂O（运行）₂（1 mM）作为阳性对照。Na-Py（10 mM）预处理1 h。处理后，用荧光显微镜检测MitoPY1（绿色）和DAPI（蓝色）的荧光，（B）用Western blot分析测定LC3-II转化率，（C）用Wester blot分析检测P62的表达。（D）用Cat（5000单位）和SOD（1000单位）预处理细胞1小时。治疗后，用免疫荧光法评估LC3-II的表达。（E）在培养7天的新鲜分离HSC中测量GSH/GSSG比率。此外，用Na-Py（10 mM）或Cat（5000单位）预处理细胞（第0天和第5天）1小时。治疗后，测量GSH/GSSG比值。对于本图中每个面板的统计数据，数据表示为平均值±SD（n=3）*与对照组相比P<0.05，**P<0.01与对照组，***P<0.001与对照组。（有关此图例中颜色参考的解释，请读者参阅本文的web版本。）

图8。 — 图8
**Rab25依赖性自噬调节体内HSC的LD转换。**40只小鼠被随机分为四组，每组10只，平均体重相当。在CCl的4周期间，分别给四组小鼠注射Vehicle control、Ad.Fc、Ad.shAtg5或Ad.shRab25₄治疗。**（A）**通过肉眼检查，比例尺，1cm观察肝脏的病理变化。肝脏切片用苏木精、伊红、马森试剂和天狼星红染色。**（B）**分离原代HSC以检测Rab25、Atg5和LC3-I/II的表达。**（C）**P62免疫染色用于显示分离的HSC中的自噬流量。**（D）**使用视黄醇和甘油三酯测量显示分离HSC中脂滴含量的变化。**（E）**尼罗河红染色显示细胞脂质含量的变化。对于本图中每个面板的统计数据，数据表示为平均值±SD（n=6）**与CCl相比P<0.01₄治疗，***P<0.001与CCl₄治疗；^##与车辆控制相比P<0.01，^###与车辆控制相比，P<0.001。

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