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.2009年5月；119(5):1359-72.
doi:10.1172/jci37948。

大麻通过刺激内质网应激诱导人脑胶质瘤细胞自噬介导的细胞死亡

玛丽亚·萨拉扎 1, Arkaitz Carracedo公司, 伊尼戈·J·萨拉努埃瓦, 索尼娅·埃尔南德斯·蒂德拉, 马·洛伦特, 艾娜拉·埃吉亚, 帕特里夏·巴斯克斯, 克里斯蒂娜·巴兹奎斯, 索菲亚·托雷斯, 斯蒂芬·加西亚, 乔纳森·诺瓦克, 吉安·玛丽亚·菲米亚, 毛罗·皮亚琴蒂尼, 弗朗西斯科·塞科尼, 保罗·潘多尔菲码头, 路易斯·冈萨雷斯-费里亚, 胡安·利奥瓦纳, 曼努埃尔·古兹曼, 帕特里夏·博亚, 吉列尔莫·贝拉斯科
附属公司

大麻通过刺激内质网应激诱导人脑胶质瘤细胞自噬介导的细胞死亡

玛丽亚·萨拉扎等。 临床研究杂志. 2009年5月.

摘要

自噬可以促进细胞存活或死亡，但其在癌症中双重作用的分子基础尚不清楚。在这里，我们证明了大麻的主要活性成分δ（9）-四氢大麻酚（THC）通过刺激自噬诱导人脑胶质瘤细胞死亡。我们的数据表明，THC诱导神经酰胺积累和真核翻译起始因子2alpha（eIF2alpha）磷酸化，从而激活内质网应激反应，通过抑制雷帕霉素复合物1（mTORC1）轴的Akt/哺乳动物靶点的三联体同源3依赖（TRB3-dependent）促进自噬。我们还表明，在大麻素诱导的人和小鼠癌细胞死亡中，自噬是凋亡的上游，激活该途径对大麻素的体内抗肿瘤作用是必要的。这些发现描述了THC促进人类和小鼠癌细胞自噬死亡的机制，并提供了证据表明大麻素给药可能是针对人类癌症的有效治疗策略。

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数字

图1
图1。抑制自噬可防止THC诱导的癌细胞死亡。
(一个–C类)THC对U87MG细胞的影响形态学。显示了具有代表性的电子显微镜照片（6小时）。比例尺：500 nm。注意早期(一个、打开箭头和B类)而且很晚了(一个、填充箭头和C类)THC处理但非车辆处理（车辆处理）细胞中的自噬体。(D类)顶部：SR141716（SR1；1μM）和THC对LC3的影响U87MG细胞免疫染色（绿色）（18h；n个=3）。这个具有LC3点的细胞相对于总细胞数的百分比如所示每个面板的角（平均值±SD）。比例尺：20μm。底部：SR1和THC对U87MG细胞LC3脂质沉积的影响（18小时；n个=3）。(E类)E64d（10μM）和胃蛋白酶抑制素A（PA；10μg/ml）对U87MG中THC诱导的LC3脂质化的影响细胞（18h；n个=3）。(F类和G公司)效果THC治疗和转染对照siRNA（siC）或ATG1-选择性siRNA（siATG1）对细胞活性的影响(F类; 平均值±SD；n个=3），LC3免疫染色(G公司，左侧面板；18小时；带有LC3点的细胞相对于细胞总数的百分比与红色荧光对照siRNA共转染，平均值±SD；n个= 3; 比例尺：20μm）和LC3脂化(G公司，右侧面板；18小时；n个=3）在U87MG电池中。(H（H）和我)THC对细胞活力的影响(H（H）; 平均值±SD；n个=3），LC3免疫染色(我，左侧面板；18小时；含有LC3的细胞百分比点相对于总细胞数，平均值±SD；n个= 3; 比例尺：20μm）和LC3脂化(我，对面板；18小时；n个=3）英寸附件5+/+和附件5–/–Ras公司V12版本/T大抗原MEF*P（P）<0.05和**P（P）<与经THC处理的U87MG相比，0.01(D类)和附件5+/+(H（H）和我)并与siC转染、THC处理的U87MG进行比较单元格(F类和G公司). 四氢大麻酚浓度为6μM。
图2
图2。内质网应激在大麻素作用中先于自噬。
(一个)THC对U87MG细胞形态的影响。注意存在THC-但非载药处理细胞的ER扩张（6小时）。箭头指向ER。比例尺：500 nm。(B类)SR1（1μM）和THC对U87MG细胞PDI免疫染色（红色）（8h；n个=3）。这个带有PDI点的细胞相对于总细胞数的百分比如所示每个面板的角（平均值±SD）。比例尺：20μm。(C类)SR1（1μM）对THC诱导的影响U87MG细胞的eIF2α磷酸化（3小时；OD相对于车用处理细胞，平均值±SD；n个= 3).(D类)THC对PDI（红色）和LC3（绿色）免疫染色的影响U87MG电池(n个=3）。含有PDI或LC3点的细胞百分比显示了每个时间点相对于总细胞数的相对值（平均值±SD）。比例尺：20μm。(E类)THC对eIF2α的影响U87MG细胞的磷酸化和LC3脂质化(n个= 3).**P（P）<与THC治疗组相比，0.01(B类)或车辆处理(C类和D类)单元格。
图3
图3。THC通过内质网应激诱发的p8和TRB3上调诱导自噬。
(一个和B类)ISP-1（1μM）对THC诱导的eIF2α磷酸化(一个; 3小时；n个=3）和LC3免疫染色(B类，左侧面板；18小时；具有LC3点的细胞相对于总细胞数的百分比，平均值±SD；n个= 3; 比例尺：20μm），U87MG细胞。sip8，p8-选择性siRNA；siTRB3，TRB3-选择性siRNA(C类)THC对eIF2αWT的p8、ATF4、CHOP和TRB3 mRNA水平的影响实时定量PCR测定的eIF2αS51A MEF（8h；n个=3）。数字表示平均倍数增加±SD相对于车辆处理的eIF2αWT MEF。(D类)顶部：p8和TRB3 mRNA水平分析。代表性RT-PCR结果给出了实验结果。数字表示由以下因素决定的基因表达水平实时定量PCR（相对于siC转染细胞；n个= 5). 底部：THC对LC3的影响转染siC、sip8或siTRB3的U87MG细胞的免疫染色（绿色）（18小时；n个= 4). 带有LC3点的细胞相对于用红色荧光控制siRNA共同转染的细胞显示在每个面板中（平均值±标准偏差）。比例尺：20μm。(E类)的影响THC对转染siC、sip8或siTRB3的U87MG细胞LC3脂质化的影响（18小时；n个=6）。(F类)四氢大麻酚对LC3脂质化的影响（顶部；18小时；n个=5）和LC3免疫染色（底部；18小时；百分比具有LC3点的细胞相对于总细胞数，平均值±SD；n个= 4; 比例尺：40μm）英寸第8页+/+或第8页–/–MEF公司*P（P）<0.05和**P（P）<与相比0.01经THC处理的U87MG(B类)，eIF2αWT(C类)，或第8页+/+(F类)单元格并与之比较siC转染、THC处理的U87MG细胞(D类).
图4
图4。THC通过TRB3抑制Akt/mTORC1通路。
(一个)THC对U87MG细胞p70S6K和S6磷酸化的影响(n个=6）。(B类)THC对细胞活力的影响（左侧面板；24小时；平均值±标准差；n个=6）和LC3脂质沉积（右侧面板；18h；n个=4）英寸Tsc2型+/+和Tsc2型–/–MEF公司。(C类)THC对Akt、TSC2、PRAS40、p70S6K和S6的影响U87MG细胞的磷酸化（18小时；OD相对于载体处理细胞，平均值±SD；n个= 7). (D类)THC对细胞的影响存活率（左面板；24 h；平均值±SD；n个=4）和LC3脂质沉淀（右侧面板；18 h；n个=4）pBABE和肉豆蔻酰化Akt（myr-Akt）MEF。(E类)THC对Akt的影响在U87MG细胞提取物中与TRB3共同免疫沉淀（8小时；OD相对于车用处理细胞，平均值±SD；n个= 9; 输入：TRB3）。(F类和G公司)THC对Akt、TSC2、PRAS40、，p70S6K、S6磷酸化和LC3脂质化(G公司仅）siC-和siTRB3-转染(F类; 18小时；相对于处理车辆的ODsiC转染的U87MG细胞，平均值±SD；n个= 7; 上面的面板显示了TRB3 mRNA水平和EGFP（Ad-EGFP）或大鼠TRB3的分析（Ad-TRB3）腺病毒载体-感染(G公司; 18小时；外径相对于车用Ad-EGFP感染的U87MG细胞，平均±SD；n个= 4; 上部面板显示rTRB3的分析mRNA水平）U87MG细胞。(H（H）)THC对Akt、p70S6K和S6的影响磷酸化第8页+/+和第8页–/–MEF公司(n个=7）*P（P）<0.05和**P（P）<与THC治疗组相比，0.01Tsc2型+/+(B类)和pBABE(D类)MEF并与车辆处理的MEF进行比较(C类和E类)，经载体处理的siC转染(F类)或Ad-EGFP感染(G公司)U87MG电池。
图5
图5。在大麻素诱导的癌细胞死亡中，自噬是凋亡的上游。
(一个)THC和泛酶抑制剂ZVAD（10μM）的可行性附件5+/+和附件5–/–MEF（36小时；活细胞相对于相应细胞的百分比附件5+/+车辆处理细胞，平均值±SD；n个=3）。(B类)THC对细胞凋亡的影响钡/钡WT和钡/钡确定的DKO MEF通过Annexin V/碘化丙啶（PI）的细胞荧光分析（24小时；平均值±SD；n个=3）。平均值±标准偏差百分比膜联蛋白V-阳性/PI阳性和膜联蛋白V-阳性，PI-阴性细胞分别显示在上角和下角。(C类)THC对eIF2α磷酸化的影响（3h；n个=3）和LC3脂质化（18小时；n个=4）第页，共页钡/钡WT和DKO MEF。(D类)左图：THC的影响转染siC或siATG1的U87MG细胞的自噬和凋亡。绿色条形图、带有LC3点的单元格；红条，活性caspase-3阳性细胞；白色条，细胞同时具有LC3点和活性caspase-3染色。数据对应于LC3点（绿色条）激活的单元格百分比胱天蛋白酶-3阳性细胞（红条），以及具有LC3点和活性caspse-3染色（白条）与转染总数的关系每个时间点的细胞数（平均值±SD；n个=3）。正确的：代表性显微照片（36小时；比例尺：20微米）。(E类和F类)THC对细胞凋亡的影响(E类; 24h；n个=3）和线粒体膜电位损失由DiOC确定6（3） 染色(F类; 24小时；n个=4）第页，共页附件5+/+和附件5–/–MEF公司。在E类，Annexin的平均±SD百分比V-阳性/PI-阳性和Annexin V-阳性，PI-阴性单元格分别显示在上角和下角**P（P）<与THC治疗组相比，0.01附件5+/+(一个,E类、和F类)和钡/钡重量(B类)MEF和来自THC处理的siC转染细胞(D类).
图6
图6。THC激活体内自噬细胞死亡途径。
(一个)瘤周注射THC对TRB3和p-S6的影响U87MG肿瘤的免疫染色。TRB3-或p-S6-染色区域标准化每个截面的核总数；数字表示平均折叠改变±SD；对3个解剖的肿瘤中的每一个进行了18个切片的计数针对每个条件。比例尺：50μm。(B类)左：效果瘤周注射THC对U87MG中LC3和活性caspase-3免疫染色的影响肿瘤。箭头指向带有LC3点的单元格。数字表示百分比活性caspase-3阳性细胞相对于每个节段的细胞核±SD。3个节段中每个节段计数10个针对每种情况解剖肿瘤。比例尺：20μm。右：效果U87MG肿瘤的瘤周THC给药对LC3脂质化的影响。图中显示了来自1个车辆治疗肿瘤和1个THC治疗肿瘤的代表性样本。数字表示与车辆治疗肿瘤相关的LC3-I和LC3-II OD值（平均值±标准偏差）。n个=3。(C类)左：效果THC对LC3免疫染色（绿色）和TUNEL（红色）的给药Ras公司V12版本/E1A公司第8页+/+和第8页–/–肿瘤异种移植物。箭头指向带有LC3点和TUNEL阳性细胞核的细胞。右：条形图显示TUNEL阳性细胞核或具有TUNEL阴性细胞核的细胞的百分比和LC3点相对于每个部分中的核总数（平均值±标准差）。分别从3个解剖肿瘤中计算出18个切片条件。比例尺：50μm。插图显示1的放大倍数所选单元格（箭头指向LC3点；比例尺：10μm）*P（P）<0.05和**P（P）<与相比0.01车辆治疗的肿瘤。
图7
图7。自噬对大麻素抗肿瘤作用至关重要。
(一个)瘤周注射THC对肿瘤生长的影响附件5+/+（上面板）和附件5–/–（下面板）Ras公司V12版本/裸鼠体内产生的T大抗原MEF肿瘤异种移植瘤（平均值±SD；n个=每种情况7）。照片显示载药和THC治疗肿瘤的代表性图像。(B类)左图：THC给药对LC3免疫染色（绿色）和细胞凋亡的影响由TUNEL（红色）确定附件5+/+和附件5–/–MEF肿瘤异种移植。来自1辆车处理和1辆THC处理的代表性图像附件5+/+和附件5–/–肿瘤是展示。右：条形图显示TUNEL阳性细胞核和细胞的百分比TUNEL阳性核和LC3点相对于总核数每个截面（平均值±SD）。从3个截面中计算出18个截面每种情况下的解剖肿瘤（车辆治疗和THC治疗）。比例尺：50微米。(C类)拟议机制示意图THC诱导的细胞死亡（详见正文）**P（P）<0.01与载体治疗的肿瘤相比。
图8
图8。2例胶质母细胞瘤患者服用THC促进自噬。
2例多形性胶质母细胞瘤患者术前不同参数分析以及颅内THC治疗后（估计给药部位达到6–10μM）。(一个)TRB3和p-S6免疫染色。代表性显微照片如图所示。数字表示TRB3或p-S6染色区域标准化每个截面的核总数（平均折叠变化±SD）相对于相应的预处理样品。计算了15个部分针对每种肿瘤和每种情况（治疗前后）。比例尺：50微米。(B类)LC3的代表性显微照片二氨基联苯胺免疫染色。带有LC3点的细胞的平均百分比注意相对于每个切片中细胞核总数的±SD在每个面板的角落。从每个活检中计算出10个切片条件。箭头指向带有LC3点的单元格。比例尺：20μm。(C类)活性半胱天冬酶-3的代表性显微照片二氨基联苯胺免疫染色。数字表示具有活性caspase-3染色±SD相对于细胞核总数在每个部分中。对每种情况的每次活检进行十次切片计数。箭头指向caspase-3染色活跃的细胞。比例尺：20微米*P（P）<0.05和**P（P）<与治疗前比较0.01。
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参考文献

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