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.2006年8月23日；25(16):3900-11.
doi:10.1038/sj.emboj.7601253。 Epub 2006年7月27日。

一氧化氮诱导的线粒体分裂受神经元内动力相关GTPases的调节

马克·巴索姆 1, 华远, Akos A Gerencser公司, 盖拉尔丁狮子, 尤利娅·库什纳列娃, 西蒙·格拉伯, 伊姆雷·科瓦茨, 威尔逊·D·李, 詹娜·瓦格纳, 崔建坤, 安德鲁·怀特, 布莱斯·博西, Jean-Claude马蒂诺, 理查德·J·尤尔, 斯图亚特·利普顿, 马克·H·埃利斯曼, A Perkins先生, 埃拉·博西·韦策尔
附属公司

一氧化氮诱导的线粒体分裂受神经元内动力相关GTPases的调节

马克·巴索姆等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

线粒体是神经元投射中的管状细胞器。在这里，我们报道在原代培养的皮层神经元中，线粒体对一氧化氮（NO）的反应发生了深刻的裂变。NO引起的线粒体分裂早在神经突损伤和神经细胞死亡之前就发生了。此外，分裂还伴随着线粒体的超微结构损伤、自噬、ATP下降和自由基的产生。裂变有时是不对称的，可以是可逆的。引人注目的是，线粒体分裂也是体内缺血性中风的早期事件。丝裂原1（Mfn1）或显性负性动力蛋白相关蛋白1（Drp1（K38A））抑制NO、鱼藤酮和淀粉样β肽诱导的线粒体分裂。相反，Drp1或Fis1的过度表达会引发分裂并增加神经元的丢失。重要的是，Mfn1和Drp1（K38A）可以减轻NO诱导的神经元死亡。因此，持续的线粒体分裂可能在NO-介导的神经毒性中起到因果作用。

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数字

图1
图1
NO触发线粒体分裂。(A类)神经元树突树突中发生分裂的线粒体的三维延时显微镜。用Mito-DsRed2转染神经元，用泛酶抑制剂zVAD-fmk甲酯（100μM）预处理，并暴露于SNOC（200μM）。图像采用3D等表面渲染。画面描绘了影片中的代表性时间点，展示了NO暴露后3小时内的线粒体碎片（上部画面；比例尺，15μm）和特写镜头（下部画面；比目尺，3μm）。参见补充视频1。(B类)（A）所示视野内的线粒体断裂导致线粒体数量增加。(C类)NO诱导线粒体分裂的剂量依赖性。表达Mito-DsRed2的神经元暴露于SNOC并固定在60分钟。显示破碎线粒体的神经元比例显示为平均值±标准差(D类)用1 mM硝基预处理Mito-DsRed2表达的皮层神经元-我-精氨酸（20分钟），暴露于25μM NMDA。NMDA治疗后60分钟出现线粒体碎片的神经元比例显示为代表性实验五份样本的平均值±标准差(†††重要性P（P）<0.001或不适用。†，与对照组相比不显著；***重要性P（P）与NMDA治疗相比<0.001）。
图2
图2
线粒体分裂发生在树突损伤之前，没有AIF或细胞色素c（c）从线粒体释放。神经元与编码载体共转染(A类)Mito-DsRed2和(B类)MyrPalm-mCFP plus公司(C类)采用三维延时成像技术记录AIF-GFP和SNOC的影响。投影图像放大到一个神经元（代表n个=42). 箭头表示树突棘。插图显示了处于适当灰度级的胞体。5小时时细胞核内AIF-GFP荧光明显变亮是由于细胞核和细胞体收缩，而不是AIF的核移位。比例尺，10μm。另请参阅补充视频2。转染Mito-DsRed2-plus细胞色素的（D–E）神经元c（c）-GFP暴露于300μM SNOC。采用荧光反褶积显微镜采集三维延时图像，并使用Volocity软件进行分析。(D类)线粒体和细胞色素的三维延时图像重建c（c）在添加SNOC后的指定时间点，在树枝状乔木中。比例尺，10μm。选择了五个线粒体，并在整个成像系列中跟踪运动。(E类)示踪显示每个线粒体的平均GFP与DsRed2发射强度的比值。每个痕迹颜色对应相同颜色的线粒体。（代表n个=9) (F–G公司). 免疫细胞化学用于在（F）老化SNOC或（G）SNOC（150μM；4 h）处理后对抗AIF抗体（红色）抗NeuN抗体（绿色）和用Hoechst 33342染料（蓝色）标记的细胞核进行染色。共焦图像堆栈的体积渲染三维重建如上图所示，下面是一个灰度共焦平面。网格，（F）为3.3μm，（G）为1.9μm，比例尺为5μm。(H（H）)细胞核与染色体AIF信号的比值测量为细胞核中心的平均荧光强度除以细胞体中的平均荧光密度，用NeuN染色法勾画（不包括细胞核）。条形图总结了282和262个神经元在n个=在三个独立实验中，分别针对老化SNOC和SNOC的19和20个图像堆栈(P（P）～0.99学生认为不重要t吨-测试）。(我)DEVDase活性。纯化的皮层神经元暴露于200μM SNOC或1μM staurosporine作为阳性对照。监测每分钟zDEVD AMC胱天蛋白酶底物切割的速率，并以任意荧光单位表达。数据显示四个独立实验的平均值±标准偏差(*重要性P（P）方差分析结果<0.01）。
图3
图3
缺血性卒中患者的线粒体分裂体内。大脑中动脉闭塞2小时后再灌注3小时的小鼠缺血半暗带或对侧大脑区域的薄片电子显微照片。(A类)未受影响半球（顶部）神经元过程中伸长的线粒体（箭头）。小线粒体片段（箭头）在缺血性脑区（底部）的神经元过程中彼此非常接近。图像代表了三只分析过的老鼠。比例尺，500 nm。(B类)对比对侧半球、对照半球（红色）和缺血半球（黑色）线粒体横截面长度的直方图。直方图的较低区间（<2000nm）与χ2-测试和没有不同。该表显示了对照半球存在长线粒体横截面（>2000 nm），而缺血半球没有线粒体横截面(P（P）<0.01; 费希尔精确测试）。(C类)比较对侧（红色）半球和缺血（黑色）半球的线粒体邻近程度。条形图显示了发现的小于或大于400纳米的线粒体邻近百分比。同一数据集汇总为右侧的列联表(P（P）<0.001; 双向费希尔精确测试）。
图4
图4
分裂与线粒体的超微结构变化有关。培养皮层神经元线粒体的EM断层扫描显示线粒体分裂引起的损伤。将皮层培养物暴露于老年SNOC对照组(A–D)或200μM SNOC(E–L公司)在80μM zVAD-fmk甲酯存在下保持6小时。图中显示了每个倾斜序列的切片（A、E和I），然后是OMM（蓝色）和IMM（灰色）分割后的3D重建正交视图，以及脊（各种任意颜色）（B–D、F–H和J–L）。为了清楚起见，10个代表性的嵴显示在（B、D、F、G、J和K）中，而所有嵴都显示在（C、H和L）中。对照线粒体（A–D）被黑色基质拉长，表明没有肿胀，有34个嵴。（E–H）中暴露于NO的线粒体正在分裂，对偶的下部线粒体显示出严重损伤，表现为外膜破裂、局部局限的内膜爆裂、基质轻度肿胀和嵴断裂。每个子线粒体都比对照组短而圆。与上女儿不同，嵴很少延伸到下线粒体。此外，嵴要小得多，区域性局限。对联的下部线粒体包含82个嵴，而上部仅包含39个，表明前者的嵴碎裂。（I–L）中暴露于NO-的线粒体三联体显示出进一步的损伤，包括膜降解、电子致密物质积累、嵴更大的断裂和明显的线粒体断裂。所有嵴均小于对照组，线粒体顶部73个，中部112个，底部47个。比例尺，400 nm。参见断层重建补充视频3、4和5。
图5
图5
可逆线粒体分裂和自噬。年轻神经元（DIV 8–10）对SNOC（200μM）反应的线粒体动力学的延时荧光显微镜观察。(A类)表达Mito-DsRed2（红色）和MyrPalm-CFP（蓝色）的两个神经元的投影图像。对图像进行高质量过滤，并在最大强度上投影z堆栈。(B类)线粒体动力学的变化以线粒体的平均骨骼长度或(C类)线粒体数量。(D类)（A）的白色矩形内区域的延时记录的放大代表帧表示时间0、20分钟和1小时的线粒体形态。这些时间点在（B）和（C）中用红色箭头描绘。数据代表了26个神经元，共有55个分析神经元出现可逆线粒体分裂（6个实验）。比例尺，10μm。参见补充视频6。(E类)SNOC暴露后6小时神经突自噬。箭头表示，在左图中，自噬体吞噬受损线粒体旁边的完整线粒体。右侧面板中的箭头表示具有自噬体特征的膜包装物。插图中的白色箭头显示了自噬体的双层膜和自噬体内线粒体的双层膜。比例尺，500 nm。
图6
图6
裂变与生物能量衰竭和自由基有关。(A类)线粒体分裂与ATP下降有关。纯化的皮层神经元暴露于增加的SNOC浓度或线粒体抑制剂（2μM鱼藤酮加2μg/ml寡霉素；Rot/Olig）。ATP浓度显示为平均值±标准化的标准化神经元板密度(n个=6) (B类)暴露于增加SNOC浓度的纯化皮层神经元中的[ATP]/[ADP]比率(n个=4). (C类)条形图显示了2.5小时时，SNOC处理的老化和新鲜神经元的任意单位中的乙炔荧光密度(D类)将表达Mito-GFP（绿色）的皮层神经元暴露于老化或新鲜的200μM SNOC溶液中。2.5小时后，用氢乙硫胺装载培养物。图像代表了至少三个独立实验中针对每种情况分析的20多个神经元（D）。比例尺，10μm。(E类)还原型谷胱甘肽（GSH）部分阻断线粒体分裂。用用2 mM GSH单乙酯预处理2 h的Mito-DsRed2转染神经元，洗涤一次，然后暴露于35μM SNOC。1小时后对线粒体分裂进行评分。数据是来自总共三个代表性实验的五份样本的平均值±s.e.m(†††重要性P（P）<0.001或不适用。，†与对照组相比不显著；*重要性P（P）<0.05).
图7
图7
线粒体分裂是神经元细胞死亡所必需的，由Drp1和Mfn1介导。用Mito-DsRed2和编码所示蛋白的质粒共同转染神经元。(A类)SNOC（175μM；7 h）或鱼藤酮（30 nM；2 h）处理前后线粒体形态的代表性荧光显微照片，以及aβ25–35与Aβ35-25岁（10μM，6小时），如图所示。比例尺，20μm。(B类)18小时线粒体分裂和细胞死亡百分比(†和†††重要性P（P）与对照pcDNA3转染相比，<0.05和0.001；*,**和***重要性P（P）与SNOC处理的pcDNA3转染神经元相比，分别<0.05、0.01和0.001；n个=3个独立实验）。Hoechst 33342染色后，死亡神经元被其萎缩和浓缩的细胞核识别。(C类)强制的Drp1或Fis1表达（60小时）引发裂变和神经元细胞死亡(*,**和***重要性P（P）与pcDNA3转染神经元相比，分别<0.05、0.01和0.001；n个=3个独立实验）。(D类)鱼藤酮诱导线粒体分裂的剂量依赖性。显示分裂线粒体的神经元比例显示为平均值±标准差(*重要性P（P）<0.05时，n个=4). (E类)Mfn1或Drp1K38A公司抑制100 nM鱼藤酮诱导的线粒体分裂（4小时）和细胞死亡（48小时）。数据表明三次测量的平均值±s.e.m(††和†††重要性P（P）与未经治疗的对照组相比，<0.01和0.001；***重要性P（P）与鱼藤酮治疗pcDNA3转染相比<0.001；n个=3）。(F类)Aβ引起的线粒体分裂35–25或Aβ25–35暴露。线粒体破碎的神经元比例显示为平均值±标准差(††重要性P（P）与转染pcDNA3相比，Aβ35−25处理对照；*和**重要性P（P）与转染pcDNA3的Aβ相比，分别<0.05和0.00125–35处理神经元；n个=3).
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