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.2006年6月；116(6):1606-14.
doi:10.1172/JCI27183。 Epub 2006年5月18日。

蛋白酶激活受体1的连接增强α（v）β6整合素依赖性TGF-β的活化并促进急性肺损伤

R吉斯利·詹金斯 1, 小苏, 乔治·苏, 克里斯托弗·斯科顿, 埃里克·卡梅勒, 杰弗里·洛朗, 乔治·E·戴维斯, 瑞秋·C·钱伯斯, 迈克尔·A·马泰, 迪安·谢泼德
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蛋白酶激活受体1的连接增强α（v）β6整合素依赖性TGF-β的活化并促进急性肺损伤

R吉斯利·詹金斯等。 临床研究杂志. 2006年6月.

摘要

α（v）β6整合素激活潜伏的TGF-β是急性肺损伤发展的关键步骤。然而，α（v）β6介导的TGF-β活化的调节机制尚未确定。我们发现凝血酶和蛋白酶激活受体1（PAR1）的其他激动剂以α（v）β6整合素特异的方式激活TGF-β。这种效应是PAR1特有的，由RhoA和Rho激酶介导。在高潮气量通气期间，气管内滴注PAR1特异性肽TFLLRN会增加肺水肿，而抗α（v）β6整合素的阻断抗体可以完全抑制这种效应；然而，在Itgb6-/-小鼠中没有观察到这种情况。此外，Itgb6-/-小鼠也能防止呼吸机诱导的肺水肿。我们还证明，博莱霉素诱导的肺损伤后，Par1-/-小鼠的肺水肿和TGF-β活性同样降低。这些结果表明，PAR1介导的α（v）β6依赖性TGF-β活化的增强可能是凝血级联激活促进急性肺损伤发展的机制之一，他们确定PAR1和α（v）β6整合素是这种情况下的潜在治疗靶点。

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数字

图1
图1。IMLE细胞表达上皮细胞标志物和功能性PAR1。
(A类) β6和β4整合素亚基细胞表面表达Itgb6号机组–/–在（β6–/–)和之后（β6+)编码人WTβ的逆转录病毒载体感染6. (B类)用相控光镜（×100）观察上皮细胞形态，用FITC-标记的一抗（×600）免疫荧光法测定上皮标记物细胞角蛋白的表达。(C类)通过使用特异性抗PAR1抗体对细胞裂解物进行Western blotting分析IMLE细胞中PAR1受体的存在。(D类)为了确定这些细胞中的PAR1是否有功能，用增加剂量的PAR1-激活肽SFLLRN处理细胞悬浮液，并将增加的钙动员量确定为阳性对照10μM钙离子载体的百分比。
图2
图2。PAR1激动剂刺激肺上皮细胞导致αv（v）β6-依赖性TGF-β激活。
(A类)IMLE细胞与TML细胞共培养，并用增加剂量的SFLLRN刺激，测量TGF-β反应性纤溶酶原激活物抑制剂-1启动子的荧光素酶活性。表达人WTβ的IMLE细胞6（黑条）与无细胞表面β6（白色条），在αv（v）β6阻断抗体（IMLEβ6-阳性，深灰色条；IMLEβ6-负片，浅灰色条）。(B类)确定α介导的TGF-β表达比例v（v）β6在上皮细胞培养中，IMLE细胞和正常人支气管上皮（NHBE）细胞在没有或存在αv（v）β6与TML细胞共培养时，阻断抗体（黑条）或泛TGF-β阻断抗体（白条），并测定荧光素酶活性。所有实验均一式三份，显示平均值+扫描电镜。结果是至少两个相同独立实验的代表性示例。
图3
图3。PAR1激动剂导致Smad2磷酸化的时间依赖性增加，即αv（v）β6整合素依赖，但不依赖于新的蛋白质合成。
(A类和B类)Smad2磷酸化对10μM PAR1激活肽SFLLRN反应的时间进程(A类)和10 nM凝血酶(B类)，无论α是否存在v（v）β6免疫印迹法检测阻断抗体。随着时间的推移和对α的响应，总Smad2水平v（v）β6检测阻断抗体作为对照。(C类)免疫印迹显示蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺（CHX）对SFLLRN诱导的Smad2磷酸化的影响。通过总Smad2的免疫印迹法测定放线菌酮作为蛋白质合成抑制剂的有效性，并使用MyD88的免疫印迹法作为负载对照。
图4
图4。PAR1肽诱导的αv（v）β6-依赖性TGF-β活性是PAR1受体特异性的。
(A类) αv（v）β6-稳定转染人WTβ的小鼠胚胎成纤维细胞刺激后依赖性TGF-β活性6随着PAR1激活肽TFLLRN和SFLLRN或扰民肽对照（FSLLRN）剂量的增加，其无已知PAR1活化作用。αv（v）β6-通过比较α-v（v）β6在与重组TGF-β浓度增加的共培养实验中，用从标准曲线获得的值阻断抗体。(B类)感染表达WT人β的逆转录病毒载体后6, αv（v）β6肺成纤维细胞中的表达第1部分–/–要么为空的老鼠(第1部分–/–)或用WT PAR1重新配制(第1部分+)通过流式细胞术进行评估。(C类) αv（v）β6-表达第1部分–/–和第1部分+随着SFLLRN和αv（v）β6-通过共培养生物测定测定依赖性TGF-β活性。
图5
图5。PAR1信号通过RhoA和Rho激酶诱导αv（v）β6-介导TGF-β活化。
(A类)表达α的WT小鼠胚胎成纤维细胞v（v）β6（MEFβ6）腺病毒感染GFP、组成活性RhoA或显性阴性RhoA。感染和细胞分选后，用10μM SFLLRN和β6-通过与TML细胞共培养生物测定计算依赖性TGF-β活性。无刺激性第1部分–/–表达α的细胞v（v）β6也感染了编码组成活性RhoA、显性阴性RhoA或GFP对照的腺病毒，并在共培养生物测定中进行了研究，如上所述。(B类)IMLE细胞和小鼠胚胎成纤维细胞均表达β6在Rho激酶抑制剂Y-27632和αv（v）β6-将介导的TGF-β活性与未刺激的IMLE细胞（实线）的活性进行比较。(C类)在Rho激酶抑制剂Y-27632和αv（v）β6阻断抗体，并与未刺激细胞进行比较。通过Western blotting分析细胞裂解液中的磷酸-Smad2或总Smad2。所有结果均代表至少3个独立实验*P（P）< 0.005.
图6
图6。PAR1诱导的肺水肿由αv（v）β6整合素。
(A类)用对照非阻断抗体（白条）或α预处理小鼠v（v）β6通气前24 ml/kg的封闭抗体（黑条），气管内滴注PAR1-特异性肽（TFLLRN）、载体（HBSS）或肽对照（FTLLRN。ELW测量为切除的肺的湿重与干重之比。(B类)用对照非阻断抗体（白条）或α预处理小鼠v（v）β6通气前24 ml/kg的封闭抗体（黑条），气管内滴注肽和对照。肺血管外血浆当量的计算基于125我标记的白蛋白进入肺部。汉克的，n个= 8; TFLLRN中，n个= 10; 和FTLLRN，n个= 11. 数值表示为平均值+SEM*P（P）< 0.01.
图7
图7。Itgb6号机组–/–与WT小鼠相比，输注TFLLRN并在高潮气量下通气的小鼠可防止肺水肿，并降低肺中TGF-β的活性。
(A类)WT小鼠（白色条）和Itgb6号机组–/–对小鼠（黑条）进行通风，并向其滴注肽和对照品，如前所述测量肺水肿。重量，n个= 6; 和Itgb6号机组–/–,n个= 5. (B类)注入Hank’s或PAR1激活肽或Itgb6号机组–/–小鼠滴注PAR1激活肽（黑条）。WT老鼠、汉克老鼠、，n个= 3; WT小鼠，TFLLRN，n个= 4;Itgb6号机组–/–老鼠，n个= 3; 和第1部分–/–小鼠，生理盐水，n个= 3. (C类)典型组织学切片显示WT或Itgb6号机组–/–老鼠。原始放大倍数，×400。数值表示为平均值+SEM。*P（P）< 0.05.
图8
图8。第1部分–/–与WT对照组相比，气管内滴注博莱霉素的小鼠具有降低通透性和TGF-β活化的作用。
(A类)WT或第1部分–/–向小鼠滴入生理盐水（Sal.；白色条）或0.05 U博莱霉素（Bleo.；黑色条）。ELW按所述进行测量。博莱霉素，n个= 6; 和盐水，n个= 5. (B类)WT或WT中核定位磷酸化-Smad2免疫染色的定量第1部分–/–小鼠滴注生理盐水（白色条）或0.05 U博莱霉素（黑色条）。WT小鼠，n个= 4;第1部分–/–,博莱霉素，n个= 4; 和第1部分–/–,盐水，n个= 3. (C类)典型组织学切片显示WT或第1部分–/–老鼠。原始放大倍数，×400。数值表示为平均值+SEM。#P（P）< 0.005,*P（P）< 0.05.
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