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.2004年6月7日；165(5):723-34.
doi:10.1083/jcb.200312172。

整合素αVbeta6介导的潜在TGF-β激活需要潜在TGF--β结合蛋白-1

贾斯汀·帕内斯 1, 闫晨, 约翰·S·芒格, 丹尼尔·B·里夫金
附属公司

整合素αVbeta6介导的潜在TGF-β激活需要潜在TGF--β结合蛋白-1

贾斯汀·帕内斯等。 J细胞生物学. .

摘要

转化生长因子-β（TGF-β）是以非活性复合物的形式分泌的，包含TGF-α、TGF-γ前肽，也称为潜伏相关蛋白（LAP）和潜伏TGF-δ结合蛋白（LTBP）。这种复合物的细胞外激活是TGF-β调节中一个关键但尚未完全理解的步骤。我们研究了LTBP在整合素αVbeta6调节TGF-β生成中的作用。我们发现，尽管alphavbeta6识别LAP上的RGD，但LTBP-1是alphavbeta6介导的潜在TGF-beta激活所必需的。激活所需的LTBP-1结构域包括TGF-β前肽结合结构域和具有ECM靶向特性的基本氨基酸序列（铰链结构域）。我们的结果表明，在αVbeta6介导的潜在TGF-β活化中，LTBP-1亚型特异性功能；在本试验中，LTBP-3无法替代LTBP-1。结果揭示了LTBP-1在潜在TGF-β激活中的功能作用，并表明特定潜在复合物的激活受不同机制的调节，这些机制可能由LTBP亚型及其与基质的潜在相互作用决定。

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数字

图1。
图1。
αV（V）β6-介导SLC和TGF-β1 C:S的潜在TGF-。（A） TGF-β大潜伏复合物（LLC）。LLC由TGF-β（黑色）、LAP（红色）和LTBP组成。TGF-β和LAP在箭头指示的位置进行蛋白质水解处理。LAP和LTBP由二硫键（浅蓝色线）连接。LLC由tTGase通过NH附近的谷氨酰胺-赖氨酸异肽键（绿色）与ECM共价连接2LTBP终点。LTBP的铰链域（箭头）是一个蛋白酶敏感区域。（B） 转化生长因子-β1−/−表达β-整合素亚单位（TGF-β）的细胞−/−/β6细胞）与产生荧光素酶的TMLC共同培养，以响应TGF-β。共培养物不含添加或重组SLC（200 ng/ml）。16-24小时后，收集细胞裂解物并测量萤光素酶活性。误差条表示重复进行的单个实验的SEM。该实验重复多次，结果相似。（C） 转化生长因子-β−/−/β6用空载体TGF-β1 cDNA或TGF-β1 C:S cDNA转染细胞，并与TMLC共培养16-24小时。测定细胞裂解物的萤光素酶活性。（D） 转染细胞（C）也用于产生条件培养基（CM）16–24 h。收集CM，加热至80°C 10 min，稀释10倍，并添加到TMLC中。在单独的微孔中，向TMLC中添加不同浓度的重组TGF-β，以生成TGF-？标准曲线。根据标准曲线确定CM中TGF-β的含量。荧光素酶分析一式三份，显示单个实验的SD。（C和D）误差条表示一式三份的单个实验的SD。这些实验重复多次，结果相似。（E） 转染细胞产生的CM也用于Western blotting。Vb3A9（抗LAP）显示蛋白条带。
图2。
图2。
LTBP结构的结构和表达。本文使用了许多LTBP-1S派生的表达式构造。（A） 这些结构以其名称、描述和支持潜在TGF-β激活的能力来表示。LTBP-1的高度模块化结构用红色（非钙结合）和黑色（钙结合）的类EGF结构域表示，CR结构域用黄色（杂交）和蓝色表示。构造XIV（浅蓝色）的突变CR3结构域已被改变，类似于LTBP-2的非TGF-β结合CR3结构区。（B） 将A中示意性显示的表达结构与猴proTGF-β1共转染到CHO细胞中，收集条件培养基并酌情用Ab39（抗-LTBP-1S）、Vb3A9（抗-LAP）和抗-HA进行检测，以证明LAP的分泌和复合形成。
图3。
图3。
ECR3E对α的影响V（V）β6-介导潜在TGF-β活化和LLC形成。CHO/β6用空的、表达ECR3E-或ECR4E-的病毒转导细胞。（A） 在收集细胞裂解物并测量荧光素酶活性之前，将转基因细胞与TGF-β-报告TMLC共培养16–24小时。实验一式三份，并给出了单个实验的标准偏差。误差条代表重复进行的单个实验的SD。该实验重复多次，结果相似。（B） 用TGF-β1 cDNA表达载体瞬时转染转导的细胞，并使其产生CM 16–24小时。使用培养基进行Western blotting。抗LAP抗体（Vb3A9）显示了反应带。
图4。
图4。
LTBP-1S衍生表达构建拯救TGF-β活化。（A） CHO-β6/ECR3E细胞与NH共转染2-末端缺失构建体和野生型TGF-β1，然后与TGF-β报告TMLC共同培养。16–24小时后，收集细胞裂解物并测量荧光素酶活性。在B和C中使用额外的LTBP-1S衍生表达结构进行了类似的实验。在C中，为了便于说明，相对于其他序列，活动铰链区域（绿色）的大小被放大了。在所有病例中，转染构建物的分泌和TGF-β复合物的形成均得到证实（未描述）。实验一式三份。误差条表示单个实验的SD。
图5。
图5。
LTBP-1S和LTBP-3的激活和LLC形成。（A） 使用MAP对齐LTBP-1、-2、-3和-4的铰链域(http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi-align/multi-arign.html). 上覆LTBP-1S的403–449氨基酸。盒装氨基酸序列识别假定的GAG结合序列。（B） CHO-β6/ECR3E细胞在与TGF-β报告基因TMLC共培养之前，与全长TGF-？和LTBP-1S衍生表达结构或基于LTBP-3的表达结构共转染。16–24小时后，收集细胞裂解物并测量荧光素酶活性。误差条代表重复进行的单个实验的SD。该实验重复多次，结果相似。（C） 收集来自相同转染细胞的条件培养基，并使用Vb3A9进行Western blotting，以显示反应蛋白带。
图6。
图6。
人工定位潜在TGF-β的激活。（A） 稳定表达β的CHO细胞6-整合素（条1和条5），β6-整合素和ECR3E（bars 2和6）、ECR3E（bars 3和7）或未转染的（bars 4和8）与TMLC在模拟涂层或HA-抗体涂层孔上共同培养。16–24小时后，收集细胞裂解液并分析荧光素酶活性。（B） 96 well微量滴定板的微孔涂有不同浓度的抗HA或对照抗体或抗αvβ6。CHO-ECR3E/β6细胞和TMLC在这些孔上共同培养。16–24小时后，收集细胞裂解物并测量荧光素酶活性。每种实验条件一式三份。显示了单个实验的SD。
图7。
图7。
激活ECM沉积的潜在TGF-β。用ECR3E或LTBP-1S稳定转染的CHO细胞（5×104)在用PBS/20 mM EDTA去除之前，在96-well板中电镀48小时。SW480-ECR3E/β6或CHO-ECR3E/β6将细胞和TMLC添加到这些孔中。16–24小时后，收集细胞裂解物并测量荧光素酶活性。所有实验条件一式三份。显示了单个实验的SD。
图8。
图8。
α的示意图V（V）β6-介导的潜在TGF-β活化。TGF-β分泌于含有多种LTBP亚型和剪接变体的复合物中。铰链结构域的高度可变的一级序列将潜在的TGF-β定位在细胞外环境中。重要的是，LTBP-1的铰链域的功能不是由LTBP-3的铰链域复制的。一旦潜在TGF-β固定在ECM中，整合素αV（V）β6结合LAP并产生回缩力。该力的大小与通过潜在复合物与ECM结合而获得的电阻有关。一旦整合素产生的力超过阈值，就会产生具有生物活性的TGF-β。通过蛋白酶等途径，从与ECM的结合中释放潜在复合物，可以防止αV（V）β6-作为整合素收缩介导的潜在TGF-β激活将不再被抵抗。
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