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。2000年2月15日；97(4):1589-94.
doi:10.1073/pnas.97.4.1589。

酵母中亨廷顿蛋白的聚集随聚谷氨酰胺扩张的长度和伴侣蛋白的表达而变化

S克洛比奇 1, 林德奎斯特
附属公司

酵母中亨廷顿蛋白的聚集随聚谷氨酰胺扩张的长度和伴侣蛋白的表达而变化

S克洛比奇等。 美国国家科学院程序。 。

摘要

亨廷顿病（HD）是一种遗传性神经退行性疾病，由亨廷顿蛋白（Ht）中的聚谷氨酰胺（polyQ）扩张引起。HD的一个特征是Ht的N末端片段的蛋白水解产物，该片段包含polyQ重复序列，在受影响神经元的细胞核和细胞质中形成聚集体。具有较长polyQ重复序列的蛋白质聚集更快，并在较早的年龄引起疾病，但聚集机制及其与疾病的关系尚不清楚。为了为Ht的研究提供一个新的、可遗传处理的模型系统，我们改造酵母细胞来表达Ht的N端片段，该片段具有25、47、72或103个残基的不同polyQ重复长度，并与绿色荧光蛋白融合。聚集程度随polyQ重复序列的长度而变化：在两个极端，大多数HtQ103蛋白合并成单个大的细胞质聚集，而HtQ25没有聚集的迹象。在三个不同步骤抑制泛素/蛋白酶体途径的突变对酵母中Ht片段的聚集没有影响，这表明之前在哺乳动物细胞中发现的Ht泛素化可能不是polyQ长度依赖性聚集的内在要求。改变酵母中多种伴侣蛋白的表达水平既不会增加也不会减少Ht聚集。然而，Sis1、Hsp70和Hsp104过表达调节了HtQ72和HtQ103片段的聚集。更引人注目的是，Hsp104的缺失实际上消除了它。这些观察结果确立了酵母作为研究多Q依赖性Ht聚集的原因和后果的系统。

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数字

图1
图1
Ht片段在酵母中的表达。(顶部)左侧，本研究中使用的Ht–GFP片段示意图。灰盒，GFP；白盒，人类Ht蛋白N末端区域的1–68个氨基酸，包含25、47、72或103条谷氨酰胺（黑盒）。(中间)用GFP对Ht聚集体进行可视化。对于表达HtQ103的野生型细胞，还显示了与DAPI的协同作用(右上). (底部)沉积分析。球状体在1×TNE中溶解，并将Sarkosyl添加到最终浓度2%。离心后，通过SDS/8%PAGE和GFP抗体免疫印迹分析上清液和颗粒组分。考马斯染色显示负载相等（数据未显示）。标记蛋白位置显示在左侧（212 kDa、122 kDa，83 kDa和51.8 kDa）。箭头标记凝胶的顶部。
图2
图2
Sis1和Hsp70的过度表达影响Ht聚集。(上部)用pTVSIS I转化表达含有25、72或103个Q残基的Ht–GFP融合蛋白的野生型细胞，以过度表达Sis1。(下部)用质粒pLH101转化含有表达质粒p416/PQ103的野生型细胞，产生Hsp70过表达。显示了表达HtQ103的细胞的两张图片，以充分表示。最适合可视化大集合的焦平面通常会使多个小集合失去焦点。
图3
图3
Hsp104的过度表达降低Ht聚集。(上部)Ht–GFP融合蛋白的可视化。用质粒p2HG（104）转化产生Ht变体的酵母野生型细胞，以过度表达Hsp104。(下部)沉积分析如图1所示。上箭头表示凝胶顶部，下箭头表示SDS可溶性HtQ72的迁移位置。
图4
图4
Hsp104的丢失影响Ht聚集。(上部)GFP融合蛋白在Δ热休克蛋白104应变。(下部)沉积分析如图1所示。
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