蛋白激酶C异构体α、β和γ的C2结构域：膜结合态的活化参数和钙计量学^†

C2结构域的纯化

PKCβ的C2结构域表达为谷胱甘肽S公司-转移酶（GST）融合蛋白，在谷胱甘肽亲和柱上分离，然后用凝血酶裂解并洗脱游离C2结构域(16). PKCα和PKCγ的C2结构域用His标记表达，并在用凝血酶裂解前用镍亲和柱分离，然后通过第二个镍柱去除游离的His标记(17). 蛋白质浓度通过色氨酸吸光度、BCA分析和SDS-PAGE凝胶测定(44–46).

平衡荧光实验

在由20 mM组成的标准分析缓冲液中，在25°C的SLM 48000S荧光光谱仪上进行平衡荧光实验N个-（2-羟乙基）哌嗪-N个含KOH、100 mM KCl和5 mM二硫苏糖醇（DTT）的′-2-乙基磺酸（HEPES）（pH 7.4）。对于所有的平衡荧光实验，激发狭缝宽度和发射狭缝宽度分别为4和8 nm。

为了测定结构域稳定性，在没有囊泡和钙的情况下，用标准分析缓冲液中的浓缩尿素滴定C2结构域（0.5µM）。使用激发（λ_前任)和排放量（λ_{相对长度单位})波长分别为284和340nm。数据符合以下方程：

哪里F类_N个代表天然蛋白质的荧光，F类_D类表示变性蛋白质的荧光，K（K）_o个表示展开外推到零尿素的平衡常数，c（c）表示比例常数，以及x个是尿素浓度(47). 然后，在没有尿素的情况下，展开的自由能计算为<trans data-src="Δ">Δ</trans><trans data-src="G">G公司</trans><trans data-src="D">D类</trans><trans data-src="H">H（H）</trans><trans data-src="2">2</trans><trans data-src="O">O（运行）</trans><trans data-src="=">=</trans><trans data-src="−">−</trans><trans data-src="R">R（右）</trans><trans data-src="T">T型</trans><trans data-src="ln">自然对数</trans><trans data-src="K">K（K）</trans><trans data-src="o">o个</trans>。

监测Ca²⁺结合到游离C2结构域，一种浓缩钙²⁺将标准缓冲液中的原液滴定至含有C2结构域（0.5µM）的样品中，该样品位于缺乏囊泡的标准缓冲液内。使用上述相同的激发和发射波长监测固有色氨酸荧光。为了控制色氨酸的淬灭，监测一个单独的含有C2结构域的试管。对照组从Ca中减去²⁺稀释校正后的滴定数据。最大荧光归一化为1。

监测Ca²⁺在荧光螯合剂镁绿（MAG）的存在下，监测C2结构域与膜对接的依赖性，以及蛋白质-膜荧光共振能量转移（FRET）引起的色氨酸猝灭，该荧光螯合物定量了游离钙²⁺浓度。此方法的详细信息已在前面描述(48–50). 用浓缩钙滴定标准缓冲液中的C2域（0.5µM）²⁺在含有PC、PS和dPE（47.5%：47.5%：5%摩尔百分比，250µM总磷脂）和MAG（0.5µM）的标准缓冲液中储存。使用激发（λ_前任)和排放量（λ_{相对长度单位})波长分别为284和340nm。游离钙²⁺通过激发产生的MAG荧光（λ_前任)和排放量（λ_{相对长度单位})波长分别为506和532nm。这个K（K）_D类对于Ca²⁺通过用钙滴定标准缓冲液中的MAG，实验测定了与MAG的结合²⁺，实现游离钙的定量²⁺在蛋白质样品中使用以下方程式：

哪里F类是给定Ca的荧光²⁺浓度，F类_最小值是滴定中观察到的最小荧光，以及F类_最大值是滴定中观察到的最大荧光(50).

通过用由PC、PX和dPE（72.5%：22.5%：5%摩尔百分比）组成的囊泡滴定每个C2结构域，其中PX是PS、PG、PI或PE，进行磷脂头部组特异性实验。首先使用PC和dPE进行滴定（95%：5%摩尔%），未观察到明显的结合。C2域（0.5µM）与1 mM EDTA和2 mM Ca预混合²⁺（净1 mM游离钙²⁺)在标准分析缓冲液中。对超声处理的脂质进行滴定，并使用激发（λ_前任)和排放量（λ_{相对长度单位})波长分别为284和520nm。将磷脂滴定到缺乏蛋白质的缓冲液中，以控制直接dPE激发引起的背景发射增加。对于每个C2结构域，PC、PS和dPE标准混合物的亲和力（47.5%：47.5%：5%摩尔百分比）也使用上述相同条件进行测定，以便与使用该标准脂质混合物测定的其他平衡和动力学参数进行直接比较。脂质亲和力测量中的所有总脂质浓度除以2，以考虑到由于双层超声处理囊泡的密封性质，一个小叶对蛋白质的不可接近性。

蛋白质对接对PS密度的依赖性是通过改变PS在PC和dPE混合物中的摩尔百分比来确定的。使用了以下摩尔百分比：95%：5%PS/dPE，76%：19%：5%PS/PC/dPE，57%：38%：5%PS/PC/d PE，38%：57%：5%PS/PC/d聚乙烯，28.5%：66.5%：5%PS/PC/dPE，19%：76%：5%PS/PC/dPE，以及9.5%：85.5%：5%PS/PC/dPE混合物。在上述相同条件下，通过dPE发射监测蛋白质-膜FRET。考虑到一个小叶无法获得蛋白质，所有总脂质浓度除以2。

所有平衡结合数据均采用单独立位点方程进行非线性最小二乘分析(等式3)或希尔方程(等式4). 特别是，所有的脂质滴定都是通过单独立位点方程进行分析的(等式3)，而Ca²⁺滴定通常表现出正协同性，因此可以用希尔方程进行分析(等式4):

式中ΔF类_最大值表示计算的最大荧光变化，x个表示游离Ca²⁺浓度（针对Ca²⁺滴定）或针对传单效应校正的磷脂浓度（用于磷脂滴定），K（K）_D类表示脂质结合的宏观平衡解离常数，以及[Ca²⁺]_1/2代表Ca²⁺产生半最大结合的浓度。使用非线性最小二乘分析确定每个方程与实验数据的最佳拟合，得出表观K（K）_D类或[Ca²⁺]_1/2并且，如果等式4，希尔系数(H（H）).

为了估计与每个膜结合C2结构域相互作用的PS分子数量，将蛋白质滴定到含有1 mM游离Ca的囊泡样品中²⁺在标准缓冲区中。所选的脂质混合物利用低PS摩尔百分比来最小化蛋白质拥挤，但囊泡浓度足够高，以确保添加的大约80%的蛋白质与膜结合。添加蛋白质，直到获得最大蛋白-膜FRET信号，表明可用的脂质结合位点饱和。使用两种不同的PC/PS/dPE混合物来确保数据的再现性，并控制囊泡表面的任何蛋白质拥挤：200µM总脂时为73.5%：22.5%：5%，380µM总脂时为83.5%：11.5%：5%。为了进行数据分析，将总PS浓度除以2，以考虑到一个小叶的不可接近性，得出可接近的PS浓度。然后将蛋白质的总浓度除以可用的PS浓度，得出蛋白质与PS的摩尔比。将蛋白质与膜FRET信号相对于该比率绘制，并确定FRET信号达到平台的最小比率。为了估计每个C2结构域的PS分子数，计算了平台蛋白与PS比率的倒数。

通过将NaCl滴定到含有C2结构域（0.5µM）、Ca²⁺（1 mM游离）和囊泡（250µM总PC、PS和dPE，47.5%：47.5%：5%摩尔百分比）。使用的缓冲液是缺少KCl的标准缓冲液。监测FRET信号的下降。使用共沸盐Na分析疏水效应对对接的贡献₂SO公司₄，增强疏水效果(51,52). 纳₂SO公司₄在无游离钙的标准缓冲液中滴定成载脂蛋白C2结构域和囊泡（PC/PS/dPE，47.5%：47.5%：5%摩尔百分比）的混合物²⁺用蛋白-膜FRET监测膜对接。作为阳性对照，监测细胞溶质磷脂酶A2的C2结构域；该结构域利用疏水对接机制，并受到钠的刺激₂SO公司₄在缺乏钙的情况下与囊泡结合²⁺(51).

无膜条件下钙与游离C2结构域的结合

确定Ca²⁺在没有膜的情况下，对三个C2结构域的结合亲和力及其固有色氨酸荧光进行了测试，发现它们在钙离子上发生了发射变化²⁺结合。用Ca滴定每个C2结构域²⁺，并且所得荧光曲线与单独立位点模型和Hill多位点模型进行了最佳拟合。提供最佳拟合的模型通过χ确定²(图4A). PKCα的数据通过单独立位点模型拟合得最好，观察到[Ca²⁺]_1/235±4µM，表明Ca²⁺绑定事件不合作。当配备Hill模型时，[Ca²⁺]_1/2保持不变，希尔系数为0.9±0.1，再次表明缺乏合作性。PKCβ的数据通过Hill模型拟合得最好，观察到[Ca²⁺]_1/242±2µM，希尔系数为2.3±0.1。PKCγ的结果与PKCα的结果相似，没有观察到协同作用，而[Ca²⁺]_1/2降低至18±2µM。自由PKCα和PKCγC2结构域缺乏协同性表明Ca²⁺与这些结构域的结合主要由一个独立的钙离子控制²⁺离子，而游离PKCβC2结构域结合多个Ca²⁺具有正合作性的离子。有趣的是，尽管这三个结构域在相同的位置上拥有相同的四种色氨酸(图1)，加利福尼亚州²⁺结合降低PKCα和PKCγC2结构域的荧光，但增加PKCβC2结构域荧光(图4A). 这一发现与钙的数量有关²⁺离子结合到自由域，表明单个Ca的结合²⁺离子对PKCα和PKCγC2结构域产生的色氨酸环境变化与多个Ca的结合不同²⁺PKCβC2结构域的离子。

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图4

钙²⁺PKC C2结构域的亲和力。钙²⁺在没有（A）或存在（B）PC/PS/dPE（47.5%：47.5%：5%摩尔百分比）囊泡的情况下，滴定到含有0.5µM PKCα（●）、PKCβ（▲）或PKCγ（■）C2结构域的溶液中。钙²⁺通过固有Trp荧光监测与分离C2结构域的结合。通过监测蛋白-膜FRET引起的固有Trp猝灭来评估膜对接。游离钙²⁺用镁绿监测膜存在时的浓度(方程式2)，一种荧光螯合剂。实线表示归一化FRET信号与希尔方程的最佳拟合(等式4). 实验条件：25°C、20 mM HEPES（pH 7.4）、100 mM KCl、5 mM DTT和250µM磷脂。

膜存在下钙与游离C2结构域的结合

加利福尼亚州²⁺通过定量C2结构域内固有色氨酸供体和合成膜囊泡内受体丹酰荧光团之间的FRET，测定了膜存在时的结合亲和力。囊泡含有等摩尔的磷脂酰胆碱（PC）和磷脂酰丝氨酸（PS）的混合物，以及小摩尔比（5%）的丹酰标记的磷脂酰乙醇胺（dPE）。FRET信号监测膜对接事件，因此观察到的信号来自与膜相互作用的C2域。在没有Ca的情况下未检测到FRET信号²⁺表明载脂蛋白结构域在钙之前几乎没有膜亲和力²⁺结合。镁绿，一种二价阳离子的荧光指示剂，包含在用钙滴定的样品中²⁺监测游离Ca²⁺浓度。根据游离钙绘制得到的蛋白-膜FRET数据²⁺并与Hill模型进行最佳拟合，如所示图4B.最适合[Ca²⁺]_1/2对于PKCα，产生半最大FRET信号的值为1.4±0.1µM；对于PKCβ，为5.0±0.2µM，对于PKCγ，为0.7±0.1μM。因此，PKCγ表现出最高的Ca²⁺膜对接反应中的亲和力，而PKCβ表现出最低的Ca²⁺密切关系。最适合的Hill系数[1.3±0.1（PKCα），1.8±0.1（蛋白激酶Cβ），1.4±0.1（蛋白质激酶Cγ）(表1)]表明膜对接是由多个Ca的结合驱动的²⁺每个域具有正合作性的离子。显然，膜对钙有显著影响²⁺PKC C2结构域的结合，特别是PKCα和PKCγC2结构域，在没有膜的情况下没有观察到正协同性。

C2结构域的脂质特异性

当具有不同头部基团的脂质被滴定到C2结构域的溶液中并饱和钙时，通过监测蛋白-膜FRET信号来确定这三个C2结构域中的脂质特异性²⁺。测试了五种不同的脂质头组，包括三种阴离子头组（PS、PG和PI）和两种中性/两性离子头组（PC和PE）。所有脂质均以PC:PX摩尔比为3:1的PC与少量（5 mol%）丹酰化脂质dPE的混合物进行测试。如所示图5A-C阴离子型头基诱导蛋白质对接，而两性离子型头基没有。由于只含有PC和dPE的囊泡无法触发可检测的对接，因此含有另一种脂质的混合物应准确反映后一种头部组的影响。含有PS的囊泡显示出比含有其他阴离子磷脂的囊泡高2-5倍的C2结构域结合亲和力（参见图例图5A-C)这与PS在激活全长cPKC方面已知的生物学重要性一致(23). 为了直接比较三个C2结构域的脂质亲和力，在并列的蛋白-膜FRET实验中评估了它们与PC/PS/dPE混合囊泡的结合，如图5D蛋白质对接产生的脂质依赖性对于所有三个C2结构域都是相似的，产生了明显的K（K）_D类PS结合在3–5µM范围内，总结如下表1总的来说，脂质特异性测量表明，膜对接需要磷脂具有净负电荷，而这种电荷比头部组的详细结构更重要。然而，C2结构域确实与蛋白质-膜复合物中的PS头基具有微弱的特异性相互作用，因为尽管其净负电荷相当，但每个C2结构域对磷脂的亲和力略高于PI和PG。因此，C2结构域有助于传统PKC亚型的PS选择性，从而补充了C1结构域与PS的已知相互作用(55).

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图5

C2结构域的磷脂头部组特异性。将磷脂滴定到含有0.5µM PKCα（A）、PKCβ（B）或PKCγ（C）C2结构域的溶液中。囊泡由3:1 PC/PX/dPE混合物组成（72.5%：22.5%：5%摩尔百分比），其中PX为PS（●）、PG（■）、PI（◆）、PE（□）或PC单独（○）。最佳拟合表观K（K）_D类测定了与含有PS、PG和PI的膜结合的值（但由于亲和力不足，没有测定PE或PC）。这些明显的K（K）_D类PKCαC2结构域的值分别为3±1、13±2和11±3，PKCβC2结构域的值分别为4±1、14±2和17±3，PKCγC2结构域与PS、PG和PI膜结合的值分别为2±1、5±1和4±1。（D） PKCα、PKCβ和PKCγC2结构域与PC/PS/dPE膜对接的比较（47.5%：47.5%：5%摩尔百分比）。蛋白质对接通过蛋白-膜FRET进行评估，利用受体荧光定量FRET。实线表示所得到的归一化FRET信号与独立单位点拟合的最佳拟合(等式3). 在所有实验中，通过将总脂质浓度除以系数2得到指示的脂质浓度，从而得出小泡可接触外叶产生的脂质浓度。实验条件：25°C，1 mM游离钙²⁺100 mM KCl、20 mM HEPES（pH 7.4）和5 mM DTT。

通过改变与PC和dPE混合物中PS的总摩尔比，测试了蛋白质对接对囊泡混合物中PS浓度的依赖性。PS的摩尔比为9.5～95%；dPE保持在5%不变，PC占剩余百分比。对PS的每个新摩尔比重复进行脂质滴定，并记录FRET信号。得到的结合曲线最好地拟合到独立的场地模型，得出了明显的K（K）_D类对于PS.高于40%的PSK（K）_D类s稳定在2–3µM左右。然而，低于40%PS时K（K）_D类随着PS摩尔比降低，s增加至至少7µM。图6绘制外观K（K）_D类s相对于PS的摩尔分数，揭示了本实验中三个C2域的类似行为。结果表明，含有不同PS摩尔比的不同细胞膜可能对C2结构域表现出明显不同的亲和力，从而影响cPKC的细胞靶向性。

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图6

C2结构域对接的磷脂酰丝氨酸依赖性。将PC/PS/dPE混合物中增加的PS百分比滴定到含有C2结构域的溶液中。随着PS浓度的变化，蛋白-膜FRET的变化符合独立位点模型(等式3). 绘制了PKCα（●）、PKCβ（▲）和PKCγ（■）C2结构域的离解常数与PS增加百分比的关系。蛋白质对接通过蛋白-膜FRET进行评估，利用受体荧光定量FRET。解离常数计算使用总PS浓度除以2，以关注囊泡可接触外叶中的脂质。实验条件：25°C，1 mM游离钙²⁺100 mM KCl、20 mM HEPES（pH 7.4）和5 mM DTT。

C2结构域的脂质化学计量学

为了进一步探测C2结构域与膜的结合，测定了相互作用的脂质化学计量比。监测泡囊和钙悬浮液的蛋白质-膜FRET²⁺同时在给定的C2域中滴定。在低蛋白浓度下，FRET信号随蛋白添加量线性增加，而在高蛋白浓度下FRET信号稳定在恒定的平台上，表明膜结合位点已被蛋白质饱和（数据未显示）。线性上升和平坦平台的交叉点由最佳拟合分析确定，直接揭示了每个PS分子结合的蛋白质分子数量。如所示表1，PKCα的化学计量为每蛋白3±1个PS头基，PKCβ的化学计量为每蛋白4±1个PS头基，PKCγ的化学计量为每蛋白5±1个PS头基。这些测量的脂质化学计量值在每个C2结构域3到5个PS头部组之间，彼此之间的实验误差在范围内，表明这三个结构域的头部组相互作用和膜足迹是相似的。

膜相互作用的离子性质

先前的研究表明，PKCβC2结构域或突触素I C2A结构域与含PS的膜的结合主要是离子性的，而胞浆磷脂酶A2 C2结构域与膜的结合则主要是疏水性的(4). 为了直接比较PKCα、PKCβ和PKCγC2结构域膜对接的作用力，进行了两个实验。首先，将NaCl添加到预先形成的Ca的三元络合物中²⁺C2结构域和PC/PS/dPE混合囊泡。蛋白质-膜FRET测量结果表明，添加NaCl导致PKCα和PKCγC2结构域从膜上分离，正如之前观察到的PKCβC2结构域，而胞浆磷脂酶A2 C2结构域不受影响(图7A). 因此，所有三个cPKC C2域与含PS膜的对接需要静电相互作用，而高盐浓度会破坏静电相互作用。第二个实验测试了硫酸钠增强疏水相互作用的能力(51,52)，在缺乏钙的情况下驱动膜对接²⁺在本实验中，硫酸钠未能触发PKCα和PKCγC2结构域的蛋白到膜FRET，正如之前在PKCβC2结构域中观察到的那样，而胞浆磷脂酶A2 C2结构域显示蛋白质对接水平显著增加(图7B). 因此，与胞浆磷脂酶A2 C2结构域的主要疏水对接机制不同，cPKC C2结构域主要与膜发生静电相互作用。这些发现有助于解释cPKC C2结构域对阴离子脂质头基的选择性。

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图7

膜对接的离子强度依赖性。（A） 将NaCl滴定到PKCα（●）、PKCβ（▲）、PKC-γ（■）或胞浆磷脂酶A2（▼）的溶液中，该溶液也含有1 mM游离钙²⁺PC/PS/dPE（47.5%：47.5%：5%摩尔百分比）囊泡。蛋白质对接通过蛋白-膜FRET进行评估，利用受体荧光定量FRET。在没有添加NaCl的情况下，FRET信号被归一化为初始FRET信号。添加EDTA以证明任何剩余的蛋白质-膜相互作用已被完全破坏。（B） 所示C2结构域和PC/PS/dPE（47.5%：47.5%：5%摩尔百分比）囊泡与1.9M Na孵育₂SO公司₄和5 mM EDTA（黑色条）或2 mM CaCl₂和1 mM EDTA（白色条）。生成的FRET信号被归一化为Ca²⁺-触发FRET信号。细胞质磷脂酶A2数据来自Nalefski等人(4). 实验条件：25°C、250µM脂质、100 mM KCl、20 mM HEPES（pH 7.4）和5 mM DTT。

钙²⁺激活亲和力、合作性和化学计量学

分离的PKCα、PKCβ和PKCγ的C2结构域表现出相似的Ca²⁺无膜时的结合亲和力。它们内在的[Ca²⁺]_1/2值，定义为Ca²⁺产生半最大固有色氨酸荧光变化的浓度范围从PKCγ的18±2µM到PKCα的35±4µM，再到PKCβ的42±2μM。最大的差异是Ca的表观Hill系数²⁺结合，PKCα和PKCγ的范围为0.9±0.1，PKCβ的范围为2.3±0.1，Ca符号²⁺-触发荧光变化，PKCα和PKCγ为阴性，而PKCβ为阳性。因此，单个Ca的结合²⁺PKCα和PKCγC2结构域的离子在四个保守色氨酸残基处产生的环境变化与两个或多个Ca的结合不同²⁺PKCβC2结构域的离子。

正如耦合结合平衡所预期的那样，膜的存在增加了表观钙²⁺每个分离C2结构域的亲和力。亲和力增强的程度因结构域而异，产生[Ca]_1/2值，定义为Ca²⁺产生半最大蛋白-膜FRET的浓度，范围从PKCγ的0.7±0.1µM到PKCα的1.4±0.1μM，到PKCβ的5.0±0.2µM。膜对钙的影响²⁺三个C2域的协作性也有显著差异。钙的表观希尔系数²⁺在无膜和有膜的情况下，与PKCβ的结合约为2（分别为2.3±0.1和1.8±0.1），表明该结构域至少结合两个Ca²⁺两种状态下的离子。相反，在没有膜的情况下，PKCα和PKCγ表现出接近统一的明显希尔系数（每个为0.9±0.1），这表明这些孤立的结构域可能只结合单个Ca²⁺离子。在存在膜的情况下，PKCα和PKCγ结构域的表观Hill系数略高于单位（分别为1.3±0.1和1.4±0.1），表明Ca的数量²⁺在微摩尔Ca上结合的离子²⁺浓度从溶液中的1增加到膜结合状态下的1以上。对于膜结合的C2结构域，磷脂头部基团可以提供直接协调钙的氧²⁺如与短链PS结合的PKCα的晶体结构所示(17). 这种相互作用可以增加钙的亲和力²⁺离子已经结合到孤立的C2结构域，甚至触发额外Ca的结合²⁺离子进入膜结合域。反过来，额外Ca的结合²⁺离子将解释钙的增加²⁺在膜存在下观察到PKCα和PKCγC2结构域的协同性。由于PKCβ表现出最高的[Ca²⁺]_1/2在无膜和有膜的情况下，C2结构域可设计为在较高Ca下被激活²⁺浓度，但Ca的分数变化较小²⁺浓度高于其他两种亚型。

使用奎因-2和停流动力学定量钙²⁺释放可以直接定量Ca²⁺膜结合络合物的化学计量。正如之前发表的并在本文的研究中证实的那样，PKCβ结合三种Ca²⁺膜对接态离子(4). 同样，我们的研究表明PKCγC2结构域结合三个Ca²⁺当离子与膜对接时。相比之下，只有两个Ca²⁺在膜结合的PKCαC2结构域中检测到离子，表明第三个Ca²⁺离子结合失败或解离过快，在停流分析中检测不到。结合钙数量差异的结构基础²⁺离子尚不清楚，尽管如下文所述，初级氨基酸序列暗示了潜在的候选残基。

脂质化学计量学

与一个C2结构域相互作用的磷脂酰丝氨酸脂质分子的数量从PKCα的3±1到PKCβ的4±1，再到PKCγ的5±1不等。利用PKCα和PKCβ的晶体结构²⁺结合环的测定范围为130到140º²(16,17). 这里使用的脂质，1-棕榈酰-2-油酰基-锡-甘油-3-磷酸胆碱和1-棕榈酰-2-油酰基-锡-甘油-3-磷酸丝氨酸与蛋黄磷脂酰胆碱（EPC）非常相似，主要由16:0和18:1链组成。EPC的研究提供了每种脂质的膜表面积估计值，范围为64到76º²（参考文献58). 如果平均值为70º²假设只有两个脂质头组足以填满钙所包围的区域²⁺绑定循环。然而，观察到三到五个类脂头组与C2域相互作用，这表明相互作用表面包含多个仅部分被C2域足迹覆盖的头组。有趣的是，脂质结合研究表明，全长PKCβII与八个磷脂酰丝氨酸分子相互作用，C2结构域在这种相互作用中起部分作用，但不一定全部作用(59).

钙的动力学²⁺和膜结合

而Ca²⁺结合和解离速度太快，无法测量游离C2结构域、膜对接和解离动力学以及钙²⁺从膜结合复合物中分离，可以通过停流动力学进行测量。膜对接的速率常数非常相似，范围为310±30 s⁻¹对于PKCβ，达到420±40秒⁻¹对于PKCα，达到440±40秒⁻¹PKCγ。因此，在我们研究中使用的浓度（0.5µM C2结构域和250µM总磷脂）下，Ca²⁺-所有三种蛋白质的活性膜对接反应的速率受膜结合事件而非钙的限制²⁺绑定事件。另一个证据表明，当Ca（钙）存在时，膜对接动力学无法区分，这一观察提供了额外的证据，表明膜结合是一种速率限制²⁺在停止流动混合之前放置在蛋白质注射器或膜注射器中。

当游离钙²⁺从组装的蛋白质中去除——Ca²⁺–通过与EDTA（一种不可逆钙）停止流动混合形成膜三元复合物²⁺解离反应被触发，从而能够测量C2结构域从膜上解离的动力学。在这些条件下，PKCα与膜的结合时间是PKCβ的3倍多，而PKCγ与膜的结合时间是PKCβ的2倍多。如果PKCα和PKCγC2结构域的长寿命三元复合物为其全长蛋白质产生更长的膜结合寿命，则这些PKC亚型可能具有更长的膜相关激酶活性时间。有趣的是，对于每个三元络合物，Ca的速率常数²⁺分离被发现在蛋白质从膜分离的速率常数的2倍以内，这表明钙²⁺解离与蛋白质-膜界面断裂同时发生或在断裂后不久发生。

包含平衡和动力学结果的模型

描述钙的协同性、化学计量和动力学的结果²⁺-活性膜对接，提出了以下通用模型：其中P代表C2域，L代表膜，米表示Ca的数量²⁺膜对接前结合的离子，以及n个表示额外Ca的数量²⁺膜结合后结合的离子。

我们的数据表明PKCβ具有最高程度的协同钙²⁺结合和解离。自由PKCβC2结构域产生Ca的表观Hill系数为2.3±0.1²⁺在没有膜的情况下结合，接近两个钙结合的最大希尔系数²⁺离子。该结果与Nalefski和Newton先前提出的模型一致(57)其中两个Ca²⁺离子被提议快速结合到隔离区域，然后缓慢的膜对接和第三钙的结合²⁺离子，以便米=2和n个=1英寸方案1.该结构域结合三个Ca的能力²⁺晶体和模型研究表明，三种钙离子²⁺离子在毫摩尔Ca处结合到自由区²⁺浓度；如此高的钙²⁺水平能够驱动第三钙的结合²⁺即使没有膜(16,69). 对于这个C2结构域，膜与钙的对接动力学²⁺钙的添加和膜解离²⁺去除都是单指数的，表明在两个方向上都有一个单一的速率限制步骤（显示结果和参考文献4和57). 钙的解离²⁺从膜结合的复合物也是单指数的，并且表现出与膜解离的时间常数无法区分的时间常数（目前的结果和参考文献4). 因此，正向反应的现有证据表明，缓慢的膜结合(k个₂在步骤2）中是相对于先前和随后的Ca的速率限制²⁺绑定步骤(k个₁和k个_三分别在步骤1和3中）。相反，反反应的现有证据表明，Ca的离解²⁺最后结合的离子(k个₋₃在步骤3）中是速率限制，这样蛋白质随后从膜上分离并释放最后两个钙²⁺离子相对较快。

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方案1

Ca的Hill系数²⁺结合自由PKCα和PKCγC2结构域（均为0.9±0.1）表明，只有一个Ca²⁺离子在膜对接前结合米=第1步中的1方案1.膜对接后，至少额外添加一个Ca²⁺离子与膜结合的PKCαC2结构域结合(n个=1），而另外两个Ca²⁺离子与膜对接PKCγC2结构域结合(n个=2），如第3步所示方案1再次，这些C2结构域的膜对接和膜分离反应均观察到单指数动力学。这些单指数动力学与为PKCβC2结构域提出的相同速率限制步骤一致：膜结合(k个₂步骤2）中最后结合的Ca的正向反应和解离²⁺离子或反向离子(k个₋₃步骤3）。

有趣的是，测得的Ca²⁺在分离的PKCα和PKCβC2结构域的晶体结构中观察到的化学计量学范围为2到3 Ca²⁺每个域的离子数(16,17,41). 这些化学计量比上述模型中的cPKC C2结构域与膜对接之前出现的化学计量要高。这种明显的矛盾可以用高钙来解释²⁺结晶过程中使用的浓度（2至12 mM）。在最简单的图片中，生理相关的微摩尔Ca²⁺浓度无法加载至少一个Ca²⁺膜对接前的位置，而毫摩尔Ca²⁺浓度可以加载额外的Ca²⁺没有膜的位置。对于PKCβC2结构域²⁺晶体结构中观察到的离子可能对应于相同的三种钙²⁺膜结合三元络合物中检测到的离子（参考文献4以及目前的结果）。对于PKCαC2结构域，两个Ca²⁺在膜结合的三元复合物中检测到的离子似乎与两种Ca相匹配²⁺在C2结构域Ca之间的三元络合物的早期晶体结构中观察到的离子²⁺离子和短链PS类似物(17). 然而，含有PKCαC2结构域和不同短链PS类似物的三元复合物的最新晶体结构揭示了三结合Ca²⁺离子(41). 后一种结构含有第三种Ca²⁺膜结合三元复合物中未检测到的离子可能是由高钙人工加载生理无关位点引起的²⁺结晶过程中的浓度（12 mM）。或者，弱结合的第三离子可能分解得太快，在目前的钙定量中检测不到²⁺膜结合络合物中的离子，因为只有那些离解速度比停止流动仪器的停滞时间（0.9ms）慢的离子才会被观察到。无论哪种情况，PKCαC2结构域对第三个Ca的亲和力²⁺离子显著低于PKCβ和PKCγC2结构域，这两个结构域都能稳定地结合第三个Ca²⁺膜结合复合物中的离子。

一级氨基酸序列分析

PKCα、PKCβ和PKCγC2结构域之间的一级氨基酸序列分析表明，它们的62%的残基是相同的（参见图1)，表明有相当大的同源性。为了确定这些C2结构域对第三个Ca的不同亲和力下的一级结构差异²⁺离子，将注意力集中在三个链间环上是有用的，称为Ca²⁺结合环1–3（CBL 1–3），之前在Ca和Ca中都有涉及²⁺这些和其他C2域与膜表面的协调和直接接触(8–17,60–64). CBL 1在PKCα、PKCβ和PKCγC2结构域中是相同的，除了一个与观察到的Ca无关的单一变化²⁺化学计量学。虽然在其他C2域中，CBL 2提供直接钙²⁺协调(8–10,14,15)，PKCα和PKCβ的晶体结构没有显示直接的Ca²⁺这个环的配位显示了四个替换，包括两个非保守替换(16,17). 在其他C2域中，CBL2在膜对接中也起着最不重要的作用(64,65). 然而，PKCα中CBL2位216的Arg被PKCβ和PKCγ中的Lys取代；因此，精氨酸可能与第三钙发生排斥作用²⁺降低p的离子K（K）_一Lys的。最后，CBL3表现出两个取代，其中只有一个与观察到的Ca相关²⁺化学计量学。在CBL 3的251位，PKCα中的Thr保守地改变为PKCβ和-γ中的Ser。这种残留物对钙至关重要²⁺-触发全长PKCα的膜对接和酶激活，并直接协调第三Ca²⁺PKC C2畴晶体结构中存在的离子(16,41,63). 虽然Thr和Ser侧链之间的差异很小，但额外的甲基可能会显著降低PKCα对第三Ca的亲和力²⁺离子处于膜结合状态。简言之，尽管位置216和251是最有可能的候选者，但还需要进一步的研究来确定PKCα的结构特征，这些特征是其对第三Ca的亲和力较低或可忽略不计的基础²⁺离子处于膜对接状态。

我们感谢以下各位对cDNA的馈赠：Ohno和Nishizuka教授（日本神户PKCα）和Tobias Meyer教授（加州斯坦福斯坦福大学PKCγ）。