结果
线粒体呼吸缺陷损害自噬基因诱导和自噬通量
我们研究了线粒体在自噬调节中的作用，通过监测GFP-Atg8报告基因在内源性自动液位计8酵母中的启动子（pRS416-pr自动液位计8-GFP-ATG8) (Abeliovich等人，2003年). 利用这个报告，我们分析了自噬反应的两个关键成分：自噬通量和ATG8型诱导(Kirisako等人，1999年;Abeliovich等人，2000年;Shintani和Klonsky，2004年;谢等人，2008). 自噬通量是自噬体随时间的液泡转移和降解，通过western blot分析测量报告者Atg8结构域随时间的空泡降解（游离GFP与总GFP信号的比率）来量化(Shintani和Klonsky，2004年). 同样，我们测量了自动液位计8通过量化归一化为非诱导蛋白（Cdc11）的总GFP信号（GFP-Atg8和游离GFP信号）的倍数增加进行诱导。此外，自动液位计8诱导是在内源性的控制下，使用GFP-only报告器独立于自噬流量进行监测的自动液位计8启动子（pRS426-pr自动液位计8-GFP公司).
为了研究线粒体的作用，我们比较了野生型细胞和缺乏线粒体基因组的野生型细胞在饥饿条件下的自噬反应（rho）0单元格）。细胞生长在半乳糖中，而不是葡萄糖作为碳源，以允许呼吸缺陷性rho的发酵生长0没有葡萄糖抑制线粒体生物发生的细胞。随后，通过将细胞暴露于氨基酸饥饿状态，诱导细胞自噬，这是使用相对低浓度的酵母提取物（0.1%（w/v））忠实地产生的(补充图S1)或标准氮气饥饿条件。我们还改变了氨基酸饥饿期间的碳源，以确定自噬反应依赖线粒体功能的程度。具体来说，我们检查了无碳源（碳饥饿）的影响；醋酸盐作为非发酵碳源；半乳糖或葡萄糖作为可发酵碳源，分别对线粒体生物生成无抑制作用或抑制作用。
野生型和rho分析0细胞表明，在氨基酸饥饿的情况下，自动液位计8诱导严格依赖于碳源的存在和线粒体功能(,自动液位计8感应）。具体来说，我们发现在没有碳源的情况下，野生型和rho0显示显著的单元格自动液位计8诱导(，无碳）。相反，在存在非发酵碳源醋酸盐或可发酵碳源半乳糖和葡萄糖的情况下，自动液位计8野生型细胞的表达受到显著刺激(醋酸、半乳糖或葡萄糖）。值得注意的是，我们没有观察到任何ATG8型rho中的诱导0存在非发酵或可发酵碳源的细胞，证明线粒体呼吸缺陷阻碍自动液位计8氨基酸饥饿诱导().
线粒体呼吸缺陷自动液位计8诱导和自噬通量。(一个)野生型和rho0含有pr的细胞自动液位计8-GFP-ATG8（上部面板）或pr自动液位计8-GFP公司（下面板）暴露于氨基酸或氮饥饿（-N）培养基中，补充有指定的碳源。通过全细胞提取和使用α-GFP和α-Cdc11抗体的western blot分析，在指定的时间点对细胞进行分析。量化自动液位计8感应显示在左下面板中。总GFP信号（GFP-Atg8和游离GFP）被量化并归一化为Cdc11信号。将0 h时的标准化值设为1，并显示饥饿6 h后的相对变化。右下角显示了饥饿6小时后自噬通量的定量，即游离GFP与总GFP信号（GFP-Atg8和游离GFP）的比值。四的平均值和标准差(n个=4）指示进行独立实验。(B类)荧光显微镜分析。野生型，rho0和Δ第7天表达pr的细胞自动液位计8-绿色荧光蛋白-ATG8按照中所述种植(一个)暴露于氨基酸（左侧，半乳糖）或氮气饥饿（右侧，葡萄糖（-N））6 h。通过过夜FM4-64（1μM）染色（红色）观察液泡。箭头表示点状GFP-Atg8结构。透射和荧光显微镜图像叠加，以可视化细胞边界。至少在150个细胞中分析了GFP信号的细胞定位(n个⩾150）。比例尺表示1.5μm。
为了测试线粒体功能是否也调节氨基酸饥饿下其他关键自噬因子的表达，我们分析了ATG14型编码自噬机制的另一个高度诱导的重要组成部分(Chan等人，2001年). 我们分析了一个质粒编码的GFP报告子在内源性ATG14型野生型rho启动子0和Δ第7天细胞。野生型和Δ第7天细胞，我们观察到ATG14型氨基酸饥饿时启动子驱动的GFP报告子(补充图S2). 重要的是，ATG14型rho完全没有诱导作用0单元格(补充图S2)表明线粒体功能是表达调控的自噬成分的一个更普遍的调节器。有趣的是，我们观察到ATG14型rho中启动子控制的GFP表达0与野生型细胞相比，细胞（0小时饥饿）可能反映线粒体功能障碍的代偿性适应(补充图S2).
与…对比自动液位计8诱导，氨基酸饥饿期间野生型细胞的自噬通量不依赖于碳源(自噬通量）。以ρ为单位0然而，与野生型细胞相比，即使存在半乳糖或葡萄糖，细胞自噬通量也显著降低(半乳糖或葡萄糖），但抑制程度因碳源类型而异(). 这些观察结果表明，在呼吸缺陷细胞中观察到的整体自噬反应的强烈缺陷是由于两者的联合抑制作用自动液位计8诱导和自噬通量。有趣的是，野生型和rho0缺乏所有氮源而不是只有氨基酸的细胞显示出难以区分的自噬流量(，葡萄糖（-N））。这表明在rho中观察到的自噬通量缺陷0细胞在氨基酸饥饿状态下并不是由于自噬机制或液泡生物发生中的固有缺陷。这一结论与已发表的数据一致，表明rho的液泡形态和酸化是正常的0单元格(Chen等人，2008)我们的表型分析进一步支持了rho0细胞对抑制液泡酸化突变体生长的应激条件具有抗性（Δvma2型) (补充图S3). 然而，与氨基酸饥饿一样自动液位计8在rho中观察到诱导作用0氮饥饿条件下细胞与三倍诱导细胞的比较自动液位计8在野生型细胞中，这与已发表的结果一致() (Kirisako等人，1999年;Huang等人，2000年). 这些发现表明，在氨基酸饥饿和氮饥饿条件下，自噬的调节存在差异，这与最近发表的工作一致，表明Gcn2和Gcn4在对氨基酸和氮饥饿作出反应的自噬调节中的不同作用(Ecker等人，2010年). 重要的是，我们的数据表明线粒体功能在自动液位计8诱导和自噬反应。
为了进一步证实我们的结论，我们分析了GFP-ATG8-荧光显微镜下表达细胞。一直以来，在氨基酸饥饿的情况下，野生型细胞表现出强烈的空泡GFP信号，正如重要的空泡染料FM4-64所评估的那样，该信号依赖于重要的自噬成分Atg7，表明GFP-Atg8的自吞噬转换() (Tanida等人，1999年;Huang等人，2000年). 相反，在rho中0细胞在相同条件下，观察到均匀分布的微弱GFP信号，这支持我们的生化数据显示受损自动液位计8rho的诱导和自噬通量0单元格(，半乳糖）。在氨基酸缺乏的rho的点状结构中观察到GFP-Atg80单元格(，半乳糖），增加了Atg8招募到PAS不受影响的可能性(Kirisako等人，1999年). 相反，在氮饥饿条件下，rho0细胞显示出空泡状GFP信号，表明在这些条件下的自噬转换，这一结论也得到了我们的生化分析的支持(). 这些数据共同表明自动液位计8诱导和自噬通量受到不同的调节，证明线粒体在这两方面都起着重要作用自动液位计8诱导和调节氨基酸饥饿自噬反应中的自噬通量。
我们还测试了线粒体功能是否调节稳定期诱导的自噬。野生型细胞在静止期2-4天后表现出显著的自噬反应(补充图S4). 自噬流量在Δ第7天单元格符合预期；然而，自动液位计8观察到诱导(补充图S4). 相反，我们没有检测到自噬流量或自动液位计8rho中的诱导0这些条件下的电池(补充图S4). 因此，线粒体功能是自噬反应的一般调节器。
线粒体在自噬反应中作用的表征
rho河0细胞缺乏线粒体编码的呼吸链核心亚单位和线粒体F1F类o个-因此，ATP合成酶和不能利用非发酵碳源在线粒体内膜上产生质子梯度或通过呼吸产生ATP。确定呼吸链复合物III（CIII）、复合物IV（CIV）或F中是否存在特定缺陷1F类o个-ATP合成酶（CV）与自噬的调节有关，我们比较了野生型rho细胞自噬诱导0和Δ第7天细胞具有维持mtDNA的细胞，但CIII、CIV或CV活性选择性受损。具体而言，通过添加选择性抑制剂抗霉素A或缺乏Cbs1（Δ哥伦比亚广播公司1)Cob1是CIII的线粒体编码核心亚单位，是翻译Cob1所需的一种核编码因子(罗德尔，1997年). 同样，CIV功能在缺乏核编码因子Mss51（Δ51号消息)，第111类（Δ宠物111)或Pet122（Δ宠物122)线粒体编码的CIV核心亚单位Cox1、Cox2或Cox3的翻译所需(Poutre和Fox，1987年;Costanzo和Fox，1988年;Decoster等人，1990年;Herrmann和Funes，2005年). 添加选择性抑制剂寡霉素或缺乏Atp10（Δatp10（atp10）)，装配F所需的核编码因子o个-F的扇区1F类o个-ATP合成酶(Ackerman和Tzagoloff，1990年;Tzagoloff等人，2004年). 在氨基酸饥饿期间，我们分析了存在非发酵碳源醋酸盐或非抑制性发酵碳源半乳糖的自噬，以改变对线粒体功能的依赖性。
在存在非发酵碳源醋酸盐的情况下，抑制CIII、CIV或CV阻止诱导自动液位计8氨基酸饥饿反应中的表达和自噬通量与rho中观察到的程度相似0单元格(). 类似地ATG14型在这些条件下，在抗霉素A或寡霉素的存在下被强烈抑制(补充图S2). 因此，在存在非发酵碳源的情况下，氨基酸饥饿的自噬反应需要产生线粒体ATP的呼吸活动。值得注意的是，在存在可发酵碳源半乳糖的情况下，与在抑制F1F类o个-ATP合成酶（CV）。具体地说，CIII或CIV活动的阻滞受到严重损害自动液位计8饥饿诱导和部分受影响的自噬通量(). 相比之下，CV活性被抑制的细胞表现出三倍于自动液位计8，与未经处理的野生型或Δ相似第7天细胞，自噬通量水平与野生型细胞相似(). 这些数据表明线粒体ATP生成就其本身而言氨基酸饥饿时的自噬反应不需要。
氨基酸饥饿期间呼吸链复合体III、IV或V活性受损的细胞的自噬反应。野生型，rho0, Δ第7天在呼吸链复合体III（CIII:Δ哥伦比亚广播公司1)，络合物IV（CIV:Δ51号消息, Δ第111页, Δ宠物122)，或F1F类o个-ATP合成酶（复合物V；CV:Δatp10（atp10）)暴露于补充有醋酸盐的氨基酸饥饿培养基中(一个)或半乳糖(B类). 当指示时，野生型细胞在氨基酸饥饿期暴露于抗霉素A（AA）或寡霉素（O）。所有菌株均表达pr自动液位计8-GFP-ATG8（上部面板）或pr自动液位计8-GFP公司（下部面板）。样品分析如所述五的平均数和标准差(n个=5）表示独立实验。
鉴于我们的数据表明线粒体呼吸活动是氨基酸饥饿期间自噬诱导的关键调节器，我们研究了调节信号的性质。呼吸复合物的抑制与活性氧种类的增加有关，以前与哺乳动物的自噬调节有关(Scherz-Shouval等人，2007年;Lambert和Brand，2009年). 然而，细胞溶质（Sod1）或线粒体（Sod2）超氧化物歧化酶的过度表达并不影响野生型或rho的自噬反应0细胞或在半乳糖存在下的氨基酸饥饿期间用抗霉素A或寡霉素处理的野生型细胞中(补充图S5A). 因此，ROS在这些条件下不起重要作用。
接下来，我们测试了ATP水平和/或线粒体膜电位是否可以作为线粒体信号在氨基酸饥饿期间进行自噬调节。因此，我们研究了在存在醋酸盐或半乳糖的情况下，氨基酸饥饿期间线粒体呼吸缺陷对细胞和线粒体ATP水平的影响(). 以ρ为单位0细胞、细胞和线粒体ATP水平在生长条件下显著低于野生型细胞(，时间0 h），并且在存在醋酸盐或半乳糖的情况下，氨基酸饥饿期间没有变化(，时间3和6小时）。相反，野生型细胞、抗霉素A（阻断CIII）或寡霉素（阻断CV）处理的野生型细胞和Δ第7天氨基酸饥饿时的细胞(，时间0、3和6小时）。有趣的是，在所有条件下，ATP水平的降低与线粒体功能无关，并且与rho中观察到的水平相似0细胞在生长和氨基酸饥饿条件下生长。这就增加了一种可能性，即存在将ATP水平维持在相对较窄范围内的调节机制。虽然我们的数据表明，在氨基酸饥饿期间，ATP的产生是自噬反应所必需的()，ATP水平的调节独立于线粒体功能，因此，ATP水平不太可能代表自噬调节的直接线粒体信号。
氨基酸饥饿期间的ATP水平和线粒体膜电位。(一个,B类)野生型，rho0和Δ第7天细胞暴露于补充有醋酸盐的氨基酸饥饿培养基中(一个)或半乳糖(B类). 如有指示，野生型细胞在氨基酸饥饿期间暴露于抗霉素A（AA）或寡霉素（O）。在指定的时间点测定总细胞（上部面板）或分离线粒体（下部面板）的ATP和蛋白质。(C类)野生型和Δ第7天将细胞暴露于补充有醋酸盐或半乳糖的氨基酸饥饿培养基中3 h。在指示的氨基酸饥饿期间，野生型细胞暴露于抗霉素A（AA）、寡霉素（O）或CCCP（50μM）。用线粒体膜电位依赖性染料DiOC处理细胞6（3） 并用荧光显微镜检查。至少10个线粒体小管的平均像素强度(n个=10）在5个代表性细胞中测定每种情况。在醋酸盐存在下野生型线粒体的值被定义为100%，并相应地计算相对值。显示了平均值和s.d。
在可发酵碳源存在下的氨基酸饥饿期间，自动液位计8诱导和自噬流量在较小程度上需要功能性CIII和CIV呼吸链复合物。阻断这些复合物的功能与线粒体膜电位降低有关(约翰逊等人，1981年;陈，1988;Petit等人，1996年;Ludovico等人，2001年)增加了在发酵氨基酸饥饿条件下通过呼吸维持线粒体膜电位是诱导自噬所必需的可能性。为了测试这种可能性，我们使用线粒体膜电位依赖性染料DiOC，通过活细胞的荧光显微镜监测了氨基酸饥饿期间的线粒体膜电位三(6). 在氨基酸饥饿3小时后，用抗霉素A（阻断CIII）处理的野生型细胞显示出DiOC的强烈降低三（6） 荧光与野生型或Δ比较第7天以乙酸或半乳糖为碳源的细胞，表明线粒体膜电位显著降低(). 相反，寡霉素处理野生型细胞（CV阻断）导致类似或增加的DiOC三（6） 与未经处理的野生型细胞在醋酸或半乳糖存在下的荧光比较，表明线粒体膜电位保持不变(). 因此，即使在发酵条件下，导致线粒体膜电位降低的线粒体缺陷也与自噬反应的强烈抑制有关。为了证实线粒体膜电位变化在自噬调节中的作用，我们监测了在氨基酸饥饿期间，随着膜解偶联物羰基氰化物间氯苯腙（CCCP）浓度的增加，野生型细胞的自噬诱导(补充图S5B). 正如DiOC评估的那样，CCCP显著降低了线粒体膜电位三（6） 荧光，并始终损害ATG8型以剂量依赖的方式，与在rho中观察到的程度相似0单元格(;补充图S5B). 同样，在CCCP存在的情况下，自噬通量受到严重损害，但我们不能排除CCCP治疗损害液泡酸化的可能性，液泡酸化对自噬周转至关重要(补充图S5B) (Nakamura等人，1997年). 总之，这些观察结果支持了一个模型，即线粒体膜电位指示线粒体的功能状态，并主要调节自动液位计8细胞自噬反应的诱导成分。
线粒体主要通过PKA调节自噬
为了了解线粒体如何调节自噬反应，我们评估了参与自噬调节的两条主要信号通路的作用。TORC1和cAMP依赖性PKA通过直接磷酸化调节Atg1–Atg13复合物的组装、活性和PAS定位，独立控制自噬(Kamada等人，2000年,2010;Budovskaya等人，2005年;Stephan等人，2009年). TORC1和PKA活性抑制两者自动液位计8诱导和自噬流量，表明两者都是自噬反应的负调节器(Noda和Ohsumi，1998年;Budovskaya等人，2004年).
我们通过监测野生型、野生型rho的自噬反应，研究了TORC1在氨基酸饥饿期间线粒体调节自噬中的作用0, Δ净现值2和Δ净现值2ρ0没有或存在TORC1特异性抑制剂雷帕霉素的细胞。净现值2编码一个保守的Npr2/Npr3复合物的一个成分，最近被确定在TORC1抑制和氨基酸饥饿时的细胞适应中起关键作用(Neklesa和Davis，2009年). 自噬通量在Δ净现值2氨基酸饥饿条件下突变细胞与野生型细胞的比较()表明通过Npr2/3抑制TORC1对自噬流量的正向调节至关重要。雷帕霉素治疗对TORC1的抑制始终导致野生型和Δ中的自噬通量无法区分npr2型单元格(). 有趣的是，与未经处理的野生型细胞相比，雷帕霉素处理的野生细胞的自噬通量显著加快，这表明TORC1在氨基酸饥饿时仅部分失活(3小时与6小时）。值得注意的是，我们观察到雷帕霉素介导的类似刺激rho自噬流量0和Δ净现值2ρ0单元格()表明抑制TORC1可以抑制线粒体呼吸缺陷引起的自噬流量下降。值得注意的是，野生型和rho0与氨基酸饥饿期间雷帕霉素处理的细胞相比，在存在和不存在雷帕霉素的氮饥饿期间，细胞表现出显著相似的自噬流量(;补充图S6A). 此外，对氮饥饿的自噬反应在Δ净现值2突变体(补充图S6A).
TORC1在氨基酸饥饿下自噬调节中的作用。(一个)野生型，rho0, Δ净现值2和Δ净现值2ρ0表达pr的细胞自动液位计8-GFP-ATG8（上面板）或pr自动液位计8-GFP公司（下面板）暴露于补充有半乳糖的氨基酸饥饿培养基中，不存在或存在雷帕霉素。样品分析如所述四种方法的平均值和标准差(n个=4）指示进行独立实验。(B类)野生型，rho0, Δ净现值2和Δ第7天表达pr的细胞净现值1-将NPR1-HA暴露于补充有半乳糖的氨基酸饥饿培养基中，而不存在雷帕霉素（上片）或存在雷帕霉素（下片）。指出了Npr1的过磷酸化（Npr1-P）和脱磷酸（Npr1）形式。在指定的时间点，使用α-HA和α-Cdc11抗体通过全细胞提取和western blot分析对细胞进行分析。(C类)野生型，rho0, Δ净现值2和Δ第7天细胞暴露于添加半乳糖的氨基酸饥饿培养基中。此外，在饥饿期间用雷帕霉素处理野生型细胞（左图）。通过全细胞提取和使用α-Atg13和α-Cdc11抗体的western blot分析，在指定的时间点监测磷酸化（Atg13-P）和去磷酸化（Attg13）Atg13。
为了评估细胞中TORC1的活性，我们监测了Npr1的磷酸化，Npr1是一种TORC1效应物，在生长条件下过度磷酸化，在氮饥饿或雷帕霉素处理下以TORC1依赖的方式去磷酸化(Schmidt等人，1998年;Gander等人，2008年). 虽然意义不明确，但Npr1的稳态水平在rho中降低0单元格(). 然而，更重要的是，我们观察到野生型rho中Npr1的磷酸化模式没有显著差异0, Δ净现值2，或Δatg7型氨基酸饥饿过程中的细胞(). 相反，我们观察到野生型rho在氮饥饿期间积累了去磷酸化形式的Npr10和Δ第7天表明TORC1活性受到强烈抑制(补充图S6B). 同样，在雷帕霉素存在下的氨基酸饥饿后，我们观察到所有菌株中Npr1向去磷酸化形式转变(). 与已发表的结果一致，Npr1的磷酸化模式在Δ中没有改变净现值2氮饥饿期间的细胞(Neklesa和Davis，2009年)但雷帕霉素对TORC1的化学抑制导致去磷酸化Npr1形式的积累。相反，雷帕霉素处理并没有进一步改变野生型rho中Npr1的磷酸化状态0，或Δ第7天单元格(补充图S6B). 同样，野生型rho中Atg13的磷酸化模式没有改变0, Δ净现值2，或Δ第7天氨基酸饥饿时的细胞(). 相反，在雷帕霉素处理的野生型细胞中观察到Atg13的磷酸化形式和去磷酸化形式的出现明显减少，这与TORC1的抑制相一致(). 这些数据表明，与氨基酸饥饿相比，氮饥饿期间TORC1活性具有主导调节作用，并表明在这两种条件下，自噬调节存在显著差异。
与自噬通量相反，自动液位计8诱导在Δ中不受影响净现值2氨基酸饥饿时细胞与野生型细胞的比较(). 此外，雷帕霉素介导的TORC1抑制没有改变自动液位计8野生型或Δ诱导净现值2细胞或缺陷自动液位计8rho线粒体功能障碍引起的诱导0和Δ净现值2ρ0单元格(). 这些结果表明，在氨基酸饥饿的情况下自动液位计8表达是以TORC1依赖的方式调节的。因此，在氨基酸饥饿的条件下，我们的结果支持自噬反应的两个调节臂的存在，它们不同地控制自噬流量和自动液位计8分别以TORC1依赖性和TORC1非依赖性的方式诱导。因此，线粒体调节自动液位计8通过TORC1以外的调节机制诱导。
通过对PKA和线粒体功能在自噬反应中的作用进行比较分析，我们测试了线粒体是否通过PKA调节自噬响应。具体来说，我们设计的细胞表达RAS2系统(ras2（ras2）G19伏)导致PKA过度激活(Toda等人，1985年;Budovskaya等人，2004年). 此外，我们使用表达PKA三个催化亚单位变体的细胞(公共事业管理局:tpk1型M164G型,tpk2型M147G型,tpk3型M165G型)而不是对抑制剂1NM-PP1（PP1）条件失活敏感的野生型等位基因(Yorimitsu等人，2007年). 我们将这些菌株的自噬反应与野生型和rho进行了比较0细胞处于氨基酸饥饿状态。与以前的报告一致ras2（ras2）G19伏突变体抑制自噬反应() (Budovskaya等人，2004年). 值得注意的是，自噬通量和自动液位计8诱导受损程度与rho相似0单元格()表明PKA过度激活和线粒体呼吸缺陷导致自噬流量和自动液位计8自噬反应的诱导成分。PKA活性的抑制(公共事业管理局+PP1）对自噬流量没有显著影响，但令人惊讶的是，其受损ATG8型在rho中观察到的诱导0或ras2（ras2）G19伏-表达细胞(). 因此，需要一定程度的PKA活动才能完成自动液位计8氨基酸饥饿诱导野生型细胞。
线粒体功能通过调节PKA活性控制自噬。(一个)氨基酸饥饿下PKA依赖性自噬反应的调节。野生型，rho0,公共事业管理局、和ras2（ras2）G19伏-表达pr的细胞自动液位计8-GFP-ATG8（上部面板）或pr自动液位计8-GFP公司（下面板）暴露于补充半乳糖的氨基酸饥饿培养基中。PKA活动公共事业管理局通过添加1NM-PP1（PP1；1μg/ml）抑制。样品分析如所述; 3、6h后测定自噬流量(B类)体内PKA活性。野生型，rho0,公共事业管理局、和ras2（ras2）G19伏-表达细胞窝藏6个MYC-cki12−200（S125/130A）（Cki1）在半乳糖培养基中生长。如有指示，野生型细胞在半乳糖培养基中，在抗霉素A（AA）或寡霉素（O）的存在下生长6小时。通过全细胞提取和使用α-Myc抗体的western blot分析，分析Cki1的PKA依赖性磷酸化（上表）。磷酸化（Cki1-P）和非磷酸化（Cki1）形式的Cki1相对于野生型细胞的比率（wt=1）（下面板）。(C类)PKA抑制可恢复自噬流量，但不能ATG8型在线粒体功能障碍的情况下诱导。野生型，rho0,公共事业管理局、和公共事业管理局ρ0表达pr的细胞自动液位计8-GFP-ATG8按照中所述进行处理(一个). 样品分析如所述四种方法的平均值和标准差(n个=4）独立实验如所示(一个–C类).
这些数据增加了线粒体以依赖PKA活性的方式调节自噬反应的可能性。为了测试这一点，我们测量了PKA活性体内在野生型、野生型rho中0,ras2（ras2）G19伏-表达，以及公共事业管理局（+PP1）细胞，或在存在抗霉素A或寡霉素的野生型细胞中使用PKA底物报告子，该报告子是由天然底物蛋白Cki1产生的(Deminoff等人，2006年). 该PKA底物报告子含有Cki1的前200个氨基酸，并在两个已知蛋白激酶C位点（S125A，S130A）发生突变，使其磷酸化完全依赖于PKA（S185）。我们通过SDS-PAGE分析中的迁移率变化检测到Cki1报告子的PKA依赖性磷酸化，并量化磷酸化和非磷酸化形式的比率，作为衡量体内在合成半乳糖培养基中对数期细胞中PKA的活性。正如预期的那样，我们观察到PKA失活后磷酸化Cki1-P形式减少(公共事业管理局+PP1）与野生型细胞比较(). 值得注意的是，用ρ表示0细胞和野生型细胞经抗霉素A处理后，我们观察到与野生型细胞相比，Cki1-P/Cki1比率增加了两倍，与我们在PKA过度活跃的细胞中检测到的结果相似(ras2（ras2）G19伏) (). 有趣的是，在寡霉素存在的情况下，野生型细胞中PKA活性仅轻微增加，这与其对自噬反应的相对较小的抑制作用一致(和). 这些数据表明体内PKA的活性受线粒体功能的调节，线粒体呼吸缺陷是PKA的正调节因子。在此背景下，值得注意的是，PKA途径先前已被证明可以调节线粒体功能(Chevtzoff等人，2005年;陈和鲍尔斯，2006年). 因此，我们的研究结果表明，线粒体和PKA相互影响，可能是为了适应细胞代谢。此外，我们的数据表明自动液位计8抗霉素A或rho对野生型细胞的诱导和自噬通量0这些细胞是由线粒体呼吸缺陷引发的PKA活性增加引起的。
我们通过分析rho来测试PKA活性的抑制是否逆转了线粒体功能障碍细胞自噬反应的缺陷0具有类似物敏感性的细胞公共事业管理局1NM-PP1存在下氨基酸饥饿的等位基因。正如我们之前观察到的，自噬反应的两个组成部分都在野生型细胞中受到刺激(). 将1NM-PP1添加到类似物敏感野生型细胞(公共事业管理局)被抑制的自动液位计8诱导，但自噬通量的刺激方式与野生型细胞相似(). 重要的是，与rho相比0在1NM-PP1类似物敏感的细胞中观察到自噬通量的强烈刺激公共事业管理局ρ0单元格(). 这些观察结果与我们的假设一致，即线粒体呼吸缺陷刺激PKA，PKA反过来抑制rho的自噬流量0细胞。然而，与自噬通量相反，我们在自动液位计8将1NM-PP1添加到类似物敏感的诱导公共事业管理局ρ0单元格(). 这一观察结果与我们之前的发现一致自动液位计8诱导需要野生型细胞中PKA活性的一些基线水平()并提示线粒体功能障碍细胞也存在类似的PKA需求。我们的数据表明，线粒体功能通过调节PKA活性来控制自噬反应，PKA活性反过来调节自噬应答的双臂-自噬流量和自动液位计8氨基酸饥饿诱导。
在自噬通量反应中，线粒体呼吸缺陷损害了Atg1–Atg13复合物向PAS的募集
TORC1和PKA调节Atg1–Atg13复合物，这反过来又是自噬体形成初始步骤的关键调节因子(Kamada等人，2000年;Cheong等人，2008年). 首先，我们讨论了自动液位计8诱导和自噬通量取决于Atg1–Atg13复合物以及是否自动液位计8诱导和自噬流量是相互依存的事件。为了实现这一目标，我们分析了Δatg1处, Δ第7天和Δ第9天单元格和Δ第11天细胞，分别缺乏一般和选择性自噬的必要因子(Lang等人，2000年;Kim等人，2001年). 值得注意的是，自噬通量在Δ中被完全阻断atg1处, Δ第7天，或Δ第9天单元格(). 我们还观察到Δ中自噬流量的部分抑制第11天细胞在氨基酸饥饿期间，表明Atg11在氨基酸饥饿过程中具有更广泛的作用。然而，自动液位计8所有受试者的诱导均未受影响自动液位计突变体(). 因此，在氨基酸饥饿期间，Atg1–Atg13复合物是自噬流量调节所必需的，但对于自动液位计8归纳。此外，自动液位计8诱导并不依赖于自噬通量所需的自噬机制。这些发现与自噬反应途径的两个独立调节臂的存在一致。
线粒体呼吸缺陷损害了氨基酸饥饿下Atg1–Atg13复合物的PAS募集。(一个)自动液位计8诱导独立于Atg1–Atg13复合物和自噬流量。野生型，rho0, Δ在g1, Δ第7天, Δ第9天和Δ第11天含有pr的细胞自动液位计8-GFP-ATG8如中所述进行了分析四的平均数和标准差(n个=4）指示进行独立实验。(B类)Atg1和Atg13对PAS的补充依赖于线粒体功能。野生型和rho0含有pr的细胞自动液位计8-GFP-ATG8和公关自动液位计1-自动液位计1-mCherry（上部面板）或prATG13公司-ATG13公司-mCherry（下面板）暴露于补充半乳糖的氨基酸饥饿培养基中3小时。野生型细胞在饥饿2.5小时30分钟后用抗霉素A（AA 30′）处理，或用寡霉素（O）处理3小时。箭头表示GFP-Atg8点的位置。透射和荧光显微镜图像叠加，以可视化细胞边界。比例尺代表1.5μm。(C类)氨基酸饥饿期间Atg1-和Atg13-mCherry的稳定水平。野生型，rho0和Δ第7天表达pr的细胞自动液位计1-自动液位计1-mCherry（上部面板）或prATG13公司-ATG13公司-mCherry（下部面板）暴露在外，并按照(B类)并使用α-dsRed和α-Cdc11抗体进行全细胞提取和western blot分析。
为了确定线粒体调节自噬流量的基础，我们利用了以下观察结果：PKA依赖的Atg1和Atg13磷酸化调节它们在PAS中的定位(Budovskaya等人，2005年;Stephan等人，2009年). 具体来说，在PKA过度活跃的情况下，Atg1和Atg13不会被招募到PAS中。鉴于线粒体呼吸缺陷的细胞PKA显著增加体内活动()，我们确定Atg1和Atg13是否定位于GFP-Atg8标记的朋酸结构，这可能是线粒体功能障碍条件下氨基酸饥饿期间的PAS。在野生型细胞中，在氨基酸饥饿条件下，GFP-Atg8和Atg1 mCherry或GFP-Atg8和Atg13 mCherry共同定位于大多数泪点，这与自噬反应的刺激一致(). 尽管GFP-Atg8点状细胞的出现频率相似（50-75%的细胞；n个⩾150）英寸rho0或抗霉素A处理的野生型细胞与野生型细胞相比，这些结构处Atg1-或Atg13-mCherry阳性的Atg8点显著减少(). 相反，在氨基酸饥饿期间，在寡霉素存在下，Atg1-或Atg13-mCherry与GFP-Atg8共定位，其程度与野生型细胞中观察到的相似，与rho相比，PKA活性增加较小0或抗霉素A处理的野生型细胞(和). 在所有条件下，通过西方分析监测，Atg1 mCherry在细胞中以可比的稳态水平存在(). Atg13-mCherry在野生型细胞中的表达被诱导约1.5倍(). 这种诱导在rho中被抑制0但在抗霉素A处理或寡霉素处理的细胞中，它与野生型细胞具有可比性(). 这些发现表明，线粒体功能障碍引起的Atg13定位错误是PKA调节的结果，而不是蛋白质水平。因此，在氨基酸饥饿期间，我们的数据表明，即使是短期线粒体呼吸缺陷也会严重损害Atg1或Atg13向PAS的募集，这与我们的观察一致，即线粒体呼吸缺陷会增加PKA活性，并在这些条件下损害自噬流。综上所述，这些数据与线粒体呼吸缺陷诱导PKA活性，从而抑制自噬调节的两个臂的模型一致：诱导关键的PKA活性自动液位计像Atg8和Atg14这样的成分和PAS的组织是自噬通量所必需的。
讨论
我们的数据表明线粒体功能是细胞自噬的关键调节因子酿酒酵母并支持中总结的模型我们的数据表明，对氨基酸饥饿的自噬反应至少由两个成分控制，即自噬通量和自动液位计基因诱导，与之前公布的数据一致(Abeliovich等人，2000年). 有趣的是，这两种成分受到不同的调节。我们的数据和已发表的研究表明，自噬通量成分由Atg1–Atg13复合物控制，并由TORC1和PKA的独立磷酸化负调控(Funakoshi等人，1997年;Matsuura等人，1997年;Kamada等人，2000年,2010;Budovskaya等人，2005年;Stephan等人，2009年). 这个自动液位计基因诱导成分，特别是自动液位计8，通过控制自噬室的大小来调节自噬反应的大小(Abeliovich等人，2000年;谢等人，2008). 与自噬通量相反，我们的数据表明自动液位计8PKA以不依赖于Atg1和TORC1的方式对诱导进行负调控。重要的是，在自噬调节网络中，线粒体呼吸功能是PKA活性的关键调节器，并调节自噬流量和自动液位计8自噬途径的诱导成分。
氨基酸饥饿下线粒体功能在自噬调节中的作用模型。氨基酸饥饿诱导自噬反应的两个调节臂，ATG8型诱导和自噬流量。自噬通量以Atg1、PKA和TORC1依赖性方式调节，而自动液位计8诱导受PKA调节。线粒体呼吸缺陷诱导PKA活性，从而抑制自噬反应的双臂。
TOR和PKA共同作用，协调真核细胞中营养物质的可用性与细胞增殖和生长(Dechant和Peter，2008年;Zaman等人，2008年). PKA通过抑制线粒体活性相关基因使细胞从有氧呼吸过渡到发酵生长(陈和鲍尔斯，2006年;Dechant和Peter，2008年;Zaman等人，2008年). 我们观察到线粒体功能障碍激活细胞中的PKA，这表明PKA活性和线粒体功能之间存在相互关系。这种调节回路的生理作用可能确保细胞代谢适应发酵，以应对呼吸缺陷。该电路还可以通过抑制新线粒体蛋白质的合成和输入来降低线粒体应激，从而使线粒体蛋白质质量控制系统能够用于维持现有蛋白质。降低压力将为恢复提供一个时间窗口，类似于其他压力反应，如内质网中未折叠的蛋白质反应(罗恩和沃尔特，2007年). 在这种情况下，线粒体功能障碍对自噬的抑制将是这一假定应激途径的另一方面。或者，在ATP只能通过糖酵解生成的情况下，细胞成分的降解可能是不利的，而PKA的激活可能会对线粒体功能障碍作出反应，从而确保自噬反应适应细胞的代谢能力。
一个关键问题是线粒体呼吸缺陷如何向PKA发出信号。我们的数据表明，呼吸产生的线粒体膜电位是诱导自噬的关键因素，可能是线粒体功能状态的信号。我们发现在这些条件下，细胞PKA活性最强。有趣的是，在哺乳动物和酵母细胞中，去极化的线粒体可以诱导选择性的自噬周转（线粒体吞噬），这与质量控制机制一致(Priault等人，2005年;Nowikovsky等人，2007年;Narendra等人，2008年;Twig等人，2008年). 然而，我们的数据表明线粒体呼吸缺陷抑制了一般和选择性的自噬，包括氨基酸饥饿下的线粒体吞噬(补充图S7). 因此，线粒体功能障碍对自噬和有丝分裂调节的影响可能因缺陷的性质和严重程度而有很大差异，例如线粒体膜电位崩溃与呼吸缺陷，以及真核细胞的生长条件。此外，我们的研究结果表明，呼吸缺陷线粒体的积累超过一定阈值会降低细胞的自噬和有丝分裂能力，并启动负反馈回路，最终导致细胞老化或细胞死亡，并可能导致或引发与年龄相关的疾病。对于衰老过程中蛋白稳定能力的崩溃，也提出了类似的原理秀丽隐杆线虫(Ben-Zvi等人，2009年)这表明细胞代谢、应激反应和质量控制机制之间存在共同的相互依赖性。虽然该模型目前仍处于推测阶段，但有趣的是，在我们的系统中存在呼吸缺陷线粒体时，TORC1抑制可以减轻对自噬流量的影响。这与许多关于调节TOR活性对物种寿命和年龄相关疾病的有益影响的报告一致(Kapahi等人，2010年). 有趣的是，在苍蝇神经元老化过程中，包括Atg8a在内的几个重要自噬基因的表达下降(Simonsen等人，2008年). 这增加了神经元线粒体功能障碍可能受损的可能性自动液位计8衰老动物模型中的表达方式与我们在酵母中观察到的类似。事实上，增加Atg8a表达可以逆转神经元损伤和缩短寿命，这表明Atg8a水平在这些条件下具有限速作用(Simonsen等人，2008年). 在这种情况下，我们的发现表明了线粒体功能障碍和自噬受损这两个共同危险因素之间的相互关系，这可能通过提高共同致病机制的可能性，改变我们对衰老、癌变和神经退行性疾病潜在机制的理解。
材料和方法
克隆和质粒
pRS416-pr号自动液位计8-GFP-ATG8已在前面描述过(Abeliovich等人，2003年). pRS426-pr（第426页）自动液位计8-GFP公司是通过克隆生态RI和Hin公司dIII侧翼pr自动液位计8-GFP公司来自pRS416-pr的片段自动液位计8-GFP-ATG8输入pRS426。pRS426-pr（第426页）ATG14型-GFP公司通过克隆pr生成ATG14型（−1000至−1 bp 5′-区域）两侧生态RI和Pst（磅/平方英尺）输入pRS426Pst（磅/平方英尺）我和圣诞节我站在绿色荧光蛋白的两侧。pRS314-p型自动液位计1-自动液位计1-mCherry和pRS314-pATG13公司-ATG13公司-mCherry是通过克隆pr产生的自动液位计1-在g1（−800至−1 bp的5′-区加上没有终止密码子的ORF）不是我和巴姆HI或prATG13公司-ATG13公司（−1000到−1 bp 5′-区域加上无终止密码子的ORF）两侧不是我和圣诞节I转化为含有mCherry的pRS314(Shaner等人，2004年)分别是。pRS314-p型净现值1-净现值1-HA是通过克隆pr生成的净现值1-净现值1（−763至−1 bp 5′-区域加上无终止密码子的ORF），包含一个HA标签，两侧有囊我和圣诞节I输入pRS314。第CM184页-ras2（ras2）G19伏是通过克隆生成的RAS2系统两侧有巴姆HI和不是I进入pCM184(Gari等人，1997年)通过定点突变引入突变G19V。pRS416-pr号OM45公司-OM45-GFP公司通过克隆pr生成OM45公司-OM45公司（−878至−1 bp 5′-区域加上无终止密码子的ORF）两侧不是我和巴姆HI进入pRS416巴姆HI和生态RI侧翼的GFP。pRS423-pr型古巴比索-6个MYC-cki12−200（S125/130A）按中所述生成Deminoff等人（2006年）并且突变S125/130A是通过诱变PCR引入的（来自Paul Herman博士的善意礼物）。
酵母菌株和培养基
本研究中使用的所有菌株都是W303的衍生物(鲁2-3112;乌拉3-1;他的3-11,15;trp1-1型;ade2-1;加拿大1-100). 基因缺失是由基于PCR的靶向同源重组取代完整ORF产生的kanMX6(Δatg1处, Δ第7天, Δ第9天),纳特MX(Δ哥伦比亚广播公司1, Δ51号消息, Δ宠物111, Δ宠物122，或Δatp10（atp10）)，或HIS3MX6系列(Δ第11天, Δ第32页, Δ净现值2, Δvma2型)磁带(Longtine等人，1998年). rho河0菌株通过在补充有溴化乙锭（25μg/ml）的YPD培养基中生长而产生。菌株在合成半乳糖培养基（0.7%酵母氮基、2%半乳糖和0.05%葡萄糖）或YP乳酸培养基（1%酵母提取物、2%蛋白胨和2%乳酸）中生长到对数阶段，并暴露于氨基酸（0.1%酵母提取物）或氮（-N；0.17%酵母氮基，无（NH）4)2SO公司4和氨基酸）饥饿培养基中添加醋酸盐（1%）、半乳糖（2%）或葡萄糖（2%），如图所示。如有需要，可添加抗霉素A（1μg/ml）、寡霉素（7.5μg/ml）或雷帕霉素（400 ng/ml）。为了抑制或允许表达，携带pCM184的菌株-ras2（ras2）G19伏分别在多西环素（20μg/ml）存在或不存在的情况下（12小时）生长。1NM-PP1敏感公共事业管理局(tpk1型M164G型,tpk2型M147G型、和tpk3型M165G型)应变已在Yorimitsu等人（2007年）。要阻止PKA活动，公共事业管理局菌株在指定培养基中预先培养（60分钟）并在1NM-PP1（1μg/ml）存在下饥饿。含有pRS423-pr的菌株古巴比索-6个MYC-cki12−200（S125/130A）在合成半乳糖培养基中生长，如Deminoff等人（2006年）.
全细胞提取、western blot分析和定量
在指定的时间点，与0.25 OD对应的单元格600收集单位并通过碱性全细胞提取（0.255M NaOH，1%β-巯基乙醇）进行裂解。通过SDS-PAGE和免疫印迹分析蛋白质提取物（α-Atg13，多克隆，Klonsky博士；α-Cdc11，多克隆的，Novus Biologicals；α-dsRed，多克隆、克隆；α-GFP和α-HA，单克隆，Covance；α-Myc，单克隆、Sigma；α-Pgk1，单克隆的，分子探针）并用与IRDye（800CW；LI-COR Biosciences）结合的适当二级抗体进行可视化。使用奥德赛红外成像系统（LI-COR Biosciences）进行量化。
荧光显微镜
将细胞安装在指示饥饿培养基中的0.5%低熔点琼脂糖中，并使用显微镜（IX70 Deltavision；Olympus）和100-W汞灯（Applied Precision，LLC），使用×60 1.4 NA物镜（Olympas）观察细胞。两维和三维光学显微镜数据是使用一个集成的、冷却的基于电荷耦合器件的相机（MicroMax；Princeton）收集的，该相机配备了一个内联芯片（Sony）。使用DeltaVision的迭代约束三维反褶积方法处理三维数据集，以消除失焦光。除非另有说明，否则用SoftWorx（Applied Precision，LLC）和PHOTOSHOP（Adobe Systems，San Jose，CA）软件处理去卷积图像的代表部分。
细胞和线粒体ATP的测量
在指定的时间点，对应于50 OD的单元格600收集、清洗单元，并将其重新悬浮在1 ml NMIB缓冲液中（0.6 M山梨醇；5 mM氯化镁2; 50 mM KCl；100 mM KOAc；20 mM HEPES pH 7.4），并在液氮中冷冻为液滴。使用SPEX冷冻磨机6750进行细胞破碎（3次循环；速率为7，持续2分钟）。通过离心法从解冻的细胞粉末中去除细胞碎片后，根据制造商的说明，通过标准Bradford分析测定上清液（总细胞）的蛋白质浓度，并将10μl与90μl TCA（5%）混合，以便使用promega ENLITEN®ATP分析测定ATP。通过差速离心从总细胞上清液中分离线粒体，并将其重悬于25μl NMIB缓冲液中。通过标准Bradford测定法测定蛋白质浓度，并将10μl与90μl TCA（5%）混合用于ATP测定。
线粒体膜电位的测量
在氨基酸饥饿3小时后，细胞暴露于3,3′-二己基氧羰基花青素碘化物（DiOC三（6） ）（最终浓度为10 ng/ml），在23°C下保持5分钟。收集具有相同暴露时间（1s）和强度标度的细胞的三维数据集。为了进行分析，使用ImageJ软件（NIH）针对每种情况确定了5个代表性细胞中至少10个线粒体小管横截面的像素强度。
