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分子生物学细胞。2009年2月15日；20(4): 1180–1191.
数字对象标识：10.1091/桶。E08-08-0829号
预防性维修识别码：项目经理2642748
PMID：19109422

自噬提供营养，但可导致斩波依赖性Bim诱导生长因子缺失细胞凋亡

布莱恩·奥尔特曼,* 杰西卡·沃福德,* 赵玉星,* 乔纳森·科尔夫,* 艾米丽·弗格森,* 希瑟·L·威曼,* 阿曼达·E·戴,* 奥尔加·伊尔卡耶娃,*†和杰弗里·拉思梅尔通讯作者*†‡
唐纳德·纽梅耶，监控编辑器
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摘要

组织内稳态由生长因子的可用性控制，生长因子维持外源营养吸收并阻止细胞凋亡。尽管自噬可以提供另一种细胞内营养来源，支持凋亡抵抗生长因子提取细胞的基本代谢，但在某些情况下，抗凋亡Bcl-2家族蛋白可以抑制自噬。因此，在表达Bcl-2或Bcl-xL的生长因子提取细胞中，自噬的作用以及自噬和凋亡之间的相互作用尚不清楚。在这里，我们表明，无论Bcl-2或Bcl-xL表达如何，在生长因子退出后，造血细胞中都会快速诱导自噬，并导致线粒体脂质氧化增加。然而，自噬关键基因表达的缺乏并没有导致代谢灾难和生长因子缺乏细胞的快速死亡。相反，抑制自噬可以提高Bcl-2表达适度的细胞存活1周以上，表明自噬在这个时间段内促进了细胞死亡。细胞死亡不是自噬性的，而是凋亡性的，依赖于促凋亡Bcl-2家族蛋白Bim的Chop依赖性诱导。因此，尽管自噬衍生营养素最终很重要，但在生长因子退出后，自噬源营养素最初似乎并不重要。相反，自噬通过使细胞对凋亡敏感来促进组织内环境稳定，以确保在缺乏生长因子时，只有最具抗凋亡能力的细胞才能使用自噬衍生营养素长期存活。

简介

后生动物细胞需要生长因子的输入来维持发育和组织稳态中的新陈代谢和生存能力(拉夫，1992年;拉特梅尔等。, 2000). 雷帕霉素（mTOR）途径的磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-Akt哺乳动物靶点是许多生长因子维持营养吸收和防止凋亡细胞死亡的重要信号机制(维万科和索耶斯，2002年;维曼等。, 2007). 当细胞被剥夺适当的生长因子刺激时，PI3K-Akt-mTOR信号的丢失、葡萄糖转运蛋白在细胞表面的定位以及葡萄糖摄取导致细胞凋亡或自噬(津本和清水，2005年;维曼等。, 2007). 与凋亡的细胞死亡途径不同，自噬是溶酶体中大量细胞质和细胞器降解的双重功能机制，如果受到控制，可以促进细胞存活，如果过度，则可能导致死亡。然而，自噬的调节及其如何影响细胞凋亡和生长因子退出后的细胞命运仍不确定。

自噬可能通过多种机制影响生长因子剥夺后的细胞命运。调节的自噬可以通过在细胞内成分溶酶体消化后为线粒体氧化提供代谢燃料来促进细胞存活(Eskelinen，2005年;勒姆等。，2005年b). 事实上，通过利用自噬作为营养物质来源来支持基础细胞新陈代谢，缺乏凋亡能力的细胞在生长因子缺乏或营养剥夺后可以存活较长时间(勒姆等。2005年a;德根哈特等。, 2006;冯等。, 2008). 自噬也可以通过清除应激细胞中受损的细胞器或蛋白质聚集体来促进存活(阿贝丁等。, 2007;科勒尔等。, 2007). 另外，自噬可以诱导细胞死亡，在caspase被抑制的细胞中观察到自噬死亡(于等。, 2004)并与果蝇属幼虫唾液腺(Lee和Baehrecke，2001年)胚泡内细胞团中细胞的清除(曲等。, 2007)胰岛素衍生神经干细胞的死亡(于等。, 2008).

Bcl-2蛋白家族在生长因子退出后调节细胞死亡，对凋亡和自噬的调节和功能至关重要。抗凋亡Bcl-2家族蛋白，如Bcl-2和Bcl-xL，受生长因子上调，在癌症中经常过度表达(瓦伦斯基，2006). 退出生长因子后，促凋亡BH3-only Bcl-2家族蛋白，如Bim和Puma(布耶等。, 1999;埃拉赫尔等。, 2006)被诱导并与抗凋亡Bcl-2家族蛋白结合，抑制其与Bax和Bak的相互作用并允许发生凋亡(瓦伦斯基，2006). 因此，抗凋亡与促凋亡Bcl-2家族蛋白的比率在确定对凋亡的敏感性方面至关重要。重要的是，抗凋亡Bcl-2家族蛋白可以结合自噬必需蛋白Beclin-1，并在急性营养剥夺的情况下抑制自噬(帕廷格等。, 2005). 与Beclin-1的这种相互作用受到促凋亡BH3-only Bcl-2家族蛋白平衡的影响(马乌里等。, 2007;伊达尔-奥伯施泰因等。, 2007). 然而，在缺血后Bcl-2或Bcl-xL过度表达的情况下，已经观察到自噬诱导(德根哈特等。, 2006)或DNA损伤(清水等。, 2004).

尽管自噬明显可以促进缺乏生长因子且不能凋亡的细胞的存活(勒姆等。2005年a;德根哈特等。, 2006)自噬在正常或中度表达Bcl-2或Bcl-xL的凋亡活性细胞的生长因子剥夺中的代谢和细胞生存作用尚不清楚。在本研究中，我们验证了以下假设：尽管Bcl-2表达，但在生长因子退出后，自噬可以被激活，并且自噬影响细胞代谢和生存。我们发现，适度表达Bcl-2或Bcl-xL可延迟细胞凋亡，但不能阻止造血细胞在生长因子退出后快速诱导自噬。自噬确实提供了营养物质来源，但这些自噬衍生的营养物质在生长因子退出后的第一周内并不需要存活，自噬反而最终提高了凋亡细胞的死亡率。值得注意的是，这种凋亡是由于BH3-only蛋白Bim通过应激反应转录因子Chop的自噬依赖性转录诱导所致。因此，在停止使用生长因子后诱导自噬可以同时促进基底细胞代谢，并通过Bim诱导细胞凋亡。因此，自噬本身对缺乏生长因子的细胞的短期存活并不是代谢必需的，但可以调节原抗凋亡Bcl-2家族蛋白的平衡。这可能通过增加凋亡应激促进组织内稳态，以确保只有对凋亡有高抵抗力的细胞才能存活足够长的时间，以利用自噬作为营养源和长期生存策略。

材料和方法

细胞培养

培养和转染FL5.12、Ba/F3和32D细胞，如所述(赵等。, 2007). IL3-依赖Bax−/−贝克−/−这些细胞由Julian Lum博士和Craig Thompson博士（宾夕法尼亚大学，费城，PA）提供。先前已经描述过稳定表达Bcl-xL或多西环素诱导的MyrAkt的FL5.12细胞(Plas公司等。, 2001). 将M57（Atg5 Tet-Off）小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs；由日本东京医学和牙科大学水岛Noboru博士慷慨提供）培养在含有10%胎牛血清和2 mM的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM；Sigma，St.Louis，MO）中我-谷氨酰胺。用5μg/ml多西环素（Sigma）处理MEF 4 d，以抑制Atg5表达。对于血清饥饿，MEF在无血清DMEM中清洗三次，然后在无血清的DMEM（含或不含强力霉素）中电镀。

用Bcl-2逆转录FL5.12和32D细胞，克隆表达Bcl-2的FL5.12细胞，以实现Bcl-2中、高表达。用Bcl-xL或Bcl-2转染Ba/F3细胞，用短梗霉素筛选并克隆。逆转录病毒感染后，将表达32D Bcl-2的细胞从细胞因子中取出24小时，然后再添加细胞因子以选择表达Bcl-2细胞。用氯喹（CQ；40μM，西格玛）或衣霉素（2μg/ml，西格马）处理一些细胞。

质粒结构

将人Bcl-2和Bcl-xL亚克隆到MSCV-IRES-tNGFR逆转录病毒载体中。大鼠绿色荧光蛋白（GFP）-LC3(卡贝亚等。, 2000)亚克隆入pMXIRES.2-hCD2逆转录病毒载体（由北卡罗来纳州达勒姆杜克大学何友文博士慷慨提供）。短螺旋RNA干扰（shRNAi）发夹的构建如前所述(福克斯等。, 2003)对Beclin-1，5′GAATGTCAGAACTAAACGCTGTT使用以下靶向序列；附件12，5′GAGCCCCCGTCCTCGGCTGTT；印章，5′GACTTCTCTTGCTCGCCGAGTT；附件5(勒姆等。2005年a); 第7页(于等。, 2004); 以及Bim和GFP(赵等。, 2007).

免疫印迹

细胞在添加蛋白酶抑制剂混合物（BD PharMinen，San Jose，CA）和磷酸酶抑制剂（Sigma）的放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液中进行裂解。蛋白质通过SDS-PAGE（Bio-Rad，Hercules，CA）分离。使用的主要抗体包括：小鼠抗磷酸化Akt Ser473（Cell Signaling，Beverly，MA）；兔抗Akt（细胞信号传导）；兔抗磷mTOR Ser2448（细胞信号）；兔抗Bim（BD PharMinen）；兔抗Puma（细胞信号）；兔抗Bax（细胞信号）；兔抗Bcl-xL（细胞信号传导）；兔抗mBcl-2（BD-PharMinen）；小鼠抗hBcl-2（BD-PharMinen）；小鼠抗GFP（Chemicon International，Temecula，CA）；小鼠抗Beclin-1抗体（肯塔基州列克星敦BD转导实验室）；兔抗LC3抗体（由日本三岛国家遗传研究所Tamotsu Yoshimori博士慷慨提供）；兔抗肌动蛋白（加州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司）；和鼠抗肌动蛋白（Sigma）。使用的二级抗体包括：抗兔和抗鼠辣根过氧化物酶标记抗体（BD-PharMinen）；Alexa-Flour 680山羊抗兔IgG（Invitrogen，Carlsbad，CA）；和IRDye 800CW山羊抗鼠IgG（LiCor，Lincoln，NE）。免疫印迹用ECL-Plus（Amersham Biosciences，Piscataway，NJ）、Supersignal West Pico化学发光底物（Thermo Scientific，Rockford，IL）或Odyssey红外成像系统（LiCor）成像并均匀对比。为了便于查看，一些图像进行了数字重新排列，重新排列的车道用空格表示。对于定量免疫印迹，分析中的蛋白质水平通过肌动蛋白和对照样品的归一化进行定量。

电子和荧光显微镜

对于透射电子显微镜，将细胞颗粒固定在4%的戊二醛中，放置在0.1 M的碳酸钠缓冲液中过夜。颗粒由杜克大学病理电子显微镜设备制备。图像是通过Philips LS 410电子显微镜（新泽西州马华）获得的。电子显微照片以9700倍的放大倍数显示。对于荧光显微镜，细胞固定在1%多聚甲醛和PBS中，并在LSM410共焦显微镜（Zeiss，Thornwood，NY）和Metamorph软件（Universal Imaging，West Chester，PA）上成像。

细胞死亡与半胱天冬酶活性分析

通过流式细胞术分析三份样品中的碘化丙啶排除（1μg/ml；Invitrogen）与前向散射来评估细胞死亡。在分析之前，将MEF胰蛋白酶化并重新悬浮在碘化丙啶溶液中。为了对活性Bax和碘化丙啶DNA进行亚G1 DNA含量分析，将细胞固定在0.25%多聚甲醛（Sigma）中，并在100μg/ml洋地黄素（Sigma-）中渗透，然后与小鼠抗Bax（克隆6A7 BD-PharMinen）、大鼠抗鼠FITC（BD-Pharminen）和5μg/ml碘化丙锭共染。如前所述评估半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性(螺母等。, 2005). 样品在405 nm处进行三份吸光度分析。给定值为V马克斯反应开始后1小时的吸光度。星号表示p<0.05t吨测试。

葡萄糖摄取

如前所述测量葡萄糖摄取(维曼等。, 2007)，用2-脱氧-d培养细胞5分钟-[三H] 葡萄糖（2μCi/反应）。星号表示p<0.05t吨测试。

酰基肉碱与代谢分析

用1μM培养细胞我-如前所述，在收获前36小时分析肉碱（Sigma）和酰基肉碱(安等。, 2004). 为了测量β-氧化，将Bcl-xL细胞与三H-棕榈酸酯（棕榈酸-[9,10-三H] Sigma）48小时，然后洗净无棕榈酸酯。将细胞在存在或不存在IL3的情况下培养24小时并收获，并在Dowex柱（Sigma）上运行细胞裂解物以分离三H标记水，然后测量其作为细胞内β-氧化的指示。Etomoxir（Sigma）的最终浓度为100μM。星号表示p<0.05t吨测试。

定量实时PCR分析

在Trizol（Invitrogen）中溶解细胞，并通过添加氯仿和随后的乙醇沉淀提取mRNA。用DNAse（Invitrogen）处理RNA，然后使用SuperScript II逆转录酶系统（Invit罗gen）逆转录到cDNA。使用IQ Sybr-Green Supermix（Bio-Rad）在Bio-Rad-ICycler实时PCR机器上进行定量实时PCR。使用了以下引物：Bim，GGTCCAGTGGTATTTCTT，ACTGAGTGTGAAGGCCTGG；Chop，GGGCCAACAGAGGTCACAC，CTTCATGCGTTGCTTCCCA；附件5，ATGCGGTTGAGGCTCACTTTA，GCCCAAAACTGGTCAATCTGTC；附件7，TTCAGTGCTTTGACATGAGTGC，CACCTGACTTTATGTCCC；和附件12，AACAAAAATGGGCTGGGAGCG，TTCCGAGGCACAGTTAAGGAA。将所有值归一化为看家基因β2-微球蛋白（β2M）的定量实时扩增：ACCGGCCTATGCTATCACAGAAA、GGTGAATGCAGCGAGAGAGAGAT。每个定量实时PCR图是三个独立实验的平均值。星号表示p<0.05t吨测试。

结果

Bcl-2和Bcl-xL在葡萄糖摄取减少的情况下防止生长因子缺乏细胞的细胞死亡

在IL3存在和不存在的情况下分析IL3依赖性淋巴/髓系前体细胞系FL5.12，以密切观察细胞因子剥夺后可能导致萎缩和细胞死亡的分子变化(Rathmell公司等。, 2000). 当细胞被剥夺生长因子时，Akt和mTOR的磷酸化降低(维曼等。, 2007;图1A） 和促凋亡蛋白Bim的表达(赵等。, 2007)美洲狮增加了(图1B） ●●●●。活化Akt（肉豆蔻酰化Akt[MyrAkt]）、Bcl-xL或Bcl-2的表达(图1C） 每一种都能防止细胞死亡(图1D） 。相反，IL3停药后，对照细胞和Bcl-xL细胞的葡萄糖摄取减少，但MyrAkt细胞的葡萄糖摄取没有减少(图1E） ●●●●。这与之前的研究结果一致，这些研究表明Bcl-xL不能影响葡萄糖转运蛋白谷氨酸1的转运，而Akt有能力促进谷氨酸1转运到细胞表面(维曼等。, 2007).

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尽管葡萄糖摄取减少，但Bcl-2和Bcl-xL可防止生长因子缺乏细胞的细胞死亡。（A和B）细胞在IL3中培养或从IL3中提取（A）6或（B）10 h，并进行免疫印迹分析。（C） 免疫印迹法检测MyrAkt、Bcl-xL和Bcl-2的表达。在IL3停药后的指定时间测定细胞存活率（D）和葡萄糖摄取率（E）。存活曲线显示了三份样品和标准偏差的平均值，葡萄糖摄取显示了标准偏差。所示数据代表三个或更多实验*学生的p<0.05t吨将IL3提取样品与对照（D）或+IL3样品（E）进行比较。

表达Bcl-xL或Bcl-2的生长因子提取细胞诱导自噬

mTOR磷酸化减少(图1A） 对照和Bcl-xL表达细胞中IL3退出后的葡萄糖摄取(图1E） 可能导致了自噬的诱导。因此，尽管Bcl-2和Bcl-xL有能力在急性环境中阻断自噬，但通过透射电子显微镜检查对照细胞或在有或无细胞因子的情况下表达MyrAkt、Bcl-2或Bcl-xL的细胞中出现自噬体10小时(帕廷格等。, 2005)，10小时后，在对照细胞和表达Bcl-2的细胞中无细胞因子的情况下，自噬体变得清晰可见(图2A） ●●●●。这些发现与自噬诱导的报道一致，即使在血清停药后存在Bcl-xL或Bcl-2过度表达(迈乌里等。, 2007;伊达尔-奥伯施泰因等。, 2007)，缺血(德根哈特等。, 2006)或DNA损伤(清水等。, 2004). 对对照组、MyrAkt-、Bcl-xL-和Bcl-2表达细胞中自噬体和溶酶体的定量显示，细胞因子剥夺后，自噬明显诱导(图2B） 尽管在MyrAkt表达细胞中观察到较少的自噬体和溶酶体，这与mTOR抑制自噬一致。

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Bcl-xL和Bcl-2的表达并不能阻止生长因子退出后的自噬诱导。（A） 对照细胞和表达Bcl-2的细胞在IL3中培养或从IL3中取出10 h，并通过透射电镜进行检查。方框区域显示在右侧，白色箭头表示自噬体和自溶体。（B） 对照组（Con）和MyrAkt-、Bcl-xL和Bcl-2表达细胞中自噬体和溶酶体的定量培养在IL3中或从IL3中取出10 h（每个细胞n=27个）。显示了平均值和SE*学生的p<0.05t吨将IL3提取样品与+IL3样品进行比较。（C） 将稳定表达GFP-LC3的Bcl-xL表达细胞去除细胞因子6 h，并用荧光显微镜检查GFP-LC3.的定位。（D） 在没有或存在氯喹（CQ）的情况下，表达GFP-LC3的细胞在指定的时间内被剥夺细胞因子，并通过抗GFP免疫印迹评估GFP-LC3。（E） 将具有稳定GFP-LC3表达的对照细胞和Myr-Akt–、Bcl-xL–和Bcl-2–表达细胞从IL3中取出指定时间，并通过免疫印迹观察GFP-LC2的处理。所示数据代表三个或更多实验。

作为自噬的一种独立测量方法，还检测了微管相关蛋白轻链3（MAP-LC3）的定位和加工，MAP-LC3是一种参与自噬体形成的小蛋白，在诱导自噬时被加工成活性形式(谷多等。, 2004). 从IL3中取出稳定表达GFP标记的LC3的细胞，然后在12小时内进行分析。具有稳定表达GFP-LC3的Bcl-xL表达细胞在没有IL3的情况下表现出特征性的LC3点状模式，表明存在自噬(图2C） ●●●●。此外，免疫印迹分析显示，在IL3退出后不久，对照细胞中的GFP-LC3 I开始减少，伴随着GFP-LC3II的增加，并且这种转换持续到12小时(图2D） 。抗GFP抗体识别的较小27-kDa蛋白也在8小时后开始出现(图2D） 。这种较小的蛋白质以前曾被用作自噬的指示剂(细川等。, 2006)并且似乎是由于GFP-LC3的溶酶体降解而出现的，因为溶酶体抑制剂CQ抑制了较小形式GFP-LC3-的出现，并导致GFP-LC3-II的积聚(图2D） 。表达MyrAkt的细胞中GFP-LC3的加工和切割受到抑制(图2E） 但在表达Bcl-2和Bcl-xL的细胞中，生长因子退出后似乎正常发生(图2E） ●●●●。综上所述，这些数据表明，生长因子撤除后会迅速诱导自噬，而Bcl-2或Bcl-xL的表达不会影响这一过程。

提取生长因子后自噬促进长链脂肪酸的生成和代谢

造血Bax−/−贝克−/−生长因子长期停用后，细胞依靠自噬为线粒体氧化提供细胞内营养(勒姆等。2005年a). 为了确定表达Bcl-2或Bcl-xL的细胞在IL3停药后的最初几天是否也从自噬中获得代谢益处，在对照组和表达MyrAkt-、Bcl-xL和Bcl-2的细胞中测量了酰基肉碱。酰基肉碱来源于肉碱与氨基酸或脂质的共价键，通过线粒体内膜转运，代表可用于线粒体分解代谢的碳链(安等。, 2004). IL3停药10小时后，小链酰基肉碱水平没有显著变化（补充图S1，A-D）。然而，1天后，表达Bcl-xL和Bcl-2的细胞（补充图S1、C和d分别）显示短碳肉碱链增加了两倍以上。C5-鸟氨酸水平也增加，表明氨基酸代谢升高（补充图S1、A、C和D）。因此，即使在葡萄糖摄取减少的情况下，线粒体氧化可用的碳源似乎也会增加。

IL3提取Bax的酰基肉碱谱−/−贝克−/−细胞的特征是确定对自噬的依赖如何影响新陈代谢。与表达Bcl-2和Bcl-xL的细胞相似，在IL3缺乏的Bax中观察到短链酰基肉碱增加−/−贝克−/−单元格（未显示数据）。重要的是，我们还观察到C18:1（油酸盐）和C18（硬脂酸盐）长链酰基肉碱的增加(图3A） ，表明脂肪酸从细胞内脂质中动员用于新陈代谢，与作为营养物质生成过程的自噬模型相一致(勒姆等。2005年b). C18:1和C18-肉碱在早期没有变化，但在IL3停药后1天，表达Bcl-xL和Bcl-2的FL5.12细胞中也显著增加(图3，B–D）。

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提取生长因子可以促进长链脂肪酸的生成和代谢。（A–D）IL3-依赖Bax−/−贝克−/−（dKO；A）、对照（B）、Bcl-xL（C）和Bcl-2（D）细胞在IL3中培养或从IL3中提取指定时间，并通过串联质谱测定酰基肉碱的C18:1（油酸）和C18（硬脂酸）水平。（E） 表达Bcl-xL的细胞与三棕榈酸氢盐48小时，在有IL3存在的情况下清洗并培养，或从IL3中提取1天。测量氚水的产生，作为棕榈酸代谢的指标。在一些样品中添加了β-氧化抑制剂Etomoxir（Etm）。显示了一式三份样品和SE的平均值*学生的p<0.05t吨除另有说明外，与+IL3样品相比，对提取的IL3样品进行测试。所示数据代表三个或更多实验。

酰基肉碱稳态水平的变化并不一定表明脂质通过线粒体β-氧化的通量发生改变，或者这些脂质是由自噬产生的。为了直接观察流量，Bcl-xL表达细胞被标记为三棕榈酸酯，并测定β-氧化速率。合并的氧化三提取生长因子后，棕榈酸氢盐增加，而这一点被添加了软骨蛋白棕榈酰转移酶和β-氧化抑制剂埃托莫西尔（Etm，图3E） ●●●●。因此，尽管MyrAkt细胞继续摄取和利用葡萄糖，但表达Bcl-2或Bcl-xL的细胞减少了葡萄糖摄取(图1E） 在停止生长因子后，转而进行脂质和氨基酸的线粒体氧化。

为了确定这些长链脂肪酸的来源是否为自噬，将氯喹添加到缺乏生长因子的Bcl-xL表达细胞中，以抑制细胞内成分的溶酶体降解。氯喹消除了C18:1和C18-肉碱的增加(图4A） ●●●●。有趣的是，氯喹治疗并不能完全阻止停止使用生长因子后Bcl-xL表达细胞中C5-鸟氨酸水平的增加(图4B） ，表明生长因子退出的细胞可能维持一些不依赖自噬的氨基酸代谢。因此，在表达Bcl-2或Bcl-xL的生长因子提取细胞中，自噬似乎是脂肪酸的关键来源，但不是氨基酸的关键来源。

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自噬是提取生长因子后线粒体氧化的脂质而非氨基酸衍生代谢物的唯一来源。（A和B）表达Bcl-xL的细胞在IL3中培养或从IL3中提取1d。在收获前8 h向一些样品中添加氯喹（CQ），以抑制溶酶体降解途径。（A） 通过串联质谱法测定脂质衍生的长链和（B）氨基酸衍生的短链酰基肉碱。显示了三份样品和SE的平均值*学生的p<0.05t吨IL3提取样品与+IL3样品的对比试验，除非另有说明。

尽管有营养物质产生，自噬仍会导致表达Bcl-2和Bcl-xL的细胞死亡

线粒体氧化营养物质的生成表明，细胞因子退出和葡萄糖摄取减少后，自噬可能在细胞存活中发挥积极作用。为了直接检测自噬在Bcl-2和Bcl-xL介导的细胞存活中的作用，我们利用shRNAi构建物对抗自噬关键基因Atg5、Atg7、Atg12(图5A） 和Beclin-1(图5B） ●●●●。当细胞从IL3中取出时，Beclin-1和Atg5 shRNAis都减少了自噬，这表明LC3 I到LC3 II的处理减少(图5B） ●●●●。首先将对照、Beclin-1和Atg5 shRNAis转染到缺乏外源性Bcl-2或Bcl-xL表达的对照细胞中，并评估IL3退出后的存活率。IL3停药后12小时，自噬抑制导致更快死亡(图5C） ●●●●。这种死亡不是由于自噬对Bcl-2家族蛋白的调节，因为IL3退出后内源性Bcl-2和Bcl-xL不受自噬shRNAi的影响（补充图S2）。表达谷氨酸1和己糖激酶的细胞，即使在生长因子退出后，也能维持高葡萄糖摄取并增加存活率(赵等。, 2007)也显示，当自噬被抑制时，在停止生长因子后不久死亡人数增加(图5D） 。为了确定自噬是否影响生长因子退出后非造血细胞的死亡，通过调节Atg5表达的永生化MEF(细川等。, 2006)在血清剥夺后进行检查(图5E） ●●●●。加入强力霉素抑制了Atg5的表达（补充图S3），且在停血清后，Atg5缺陷的MEF的死亡速度与PBS对照处理的细胞相似或略快(图5E） ●●●●。多西环素对野生型MEF无影响（数据未显示）。总之，这些数据表明，在自噬缺乏的细胞中，生长因子退出后不久，细胞死亡类似或适度增强，这种死亡不是由于营养缺乏引起的。

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细胞因子退出后早期，自噬以营养不依赖的方式支持细胞存活。（A） 通过实时定量PCR测定shRNAi对Atg5、Atg7或Atg12的mRNA抑制效率。（B） 用对照Beclin-1或Atg5 shRNAi瞬时转染Bcl-2细胞，从细胞因子中提取48小时后收获，并用免疫印迹法检测Beclin-1敲除效率和内源性LC3处理。（C和D）对照（C）和谷氨酸/己糖激酶表达（D）细胞转染对照、Beclin-1或Atg5 shRNAi，并在IL3退出后随时间观察存活率。（E） 用PBS或5μg/ml多西环素治疗Atg5-Tet-Off MEF 4 d，从血清中取出，并分析其生存能力。显示了三份样品的平均值和标准偏差*学生的p<0.05t吨测试样品相对于对照样品的测试。所示数据代表三个或更多实验。

接下来在MyrAkt和Bcl-2表达细胞中检测自噬抑制后的长期细胞活力。Beclin-1和Atg5 shRNAi均不影响表达MyrAkt的细胞的存活(图6A） ●●●●。相反，抑制自噬可提高Bcl-2表达适度的细胞在后期的存活率(图6B） ●●●●。在表达Bcl-xL的细胞中也观察到类似的结果（补充图S4）。重要的是，抑制适度表达Bcl-2的细胞的自噬导致持续1周以上的两倍或更大的生存优势(图6C） ●●●●。类似地，Bcl-2表达的MEF中自噬的抑制(图6D） 有条件的Atg5表达导致停血清后细胞存活率增加(图6E） ●●●●。在造血衍生Ba/F3（补充图S5，a-D）和32D（补充图S6，a和B）细胞系中观察到一致的结果，支持自噬在生长因子提取中的生产作用。重要的是，高水平的Bcl-2表达可以保护细胞免受这种死亡，而抑制自噬则没有进一步的优势或劣势(图6F） ●●●●。因此，尽管通过自噬降低了葡萄糖摄取量并产生了替代营养素，但自噬衍生代谢物对生长因子退出后早期支持细胞存活并不重要。相反，自噬作用是促进表达中等水平Bcl-2或Bcl-xL的生长因子细胞死亡。

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自噬诱导生长因子缺失的Bcl-2和Bcl-xL表达细胞死亡。（A和B）MyrAkt（A）和Bcl-2表达（B）细胞转染对照、Beclin-1或Atg5 shRNAi，并在IL3退出后随时间观察细胞活力。（C） 转染对照、Beclin-1或Atg5 shRNAi的中度表达Bcl-2的细胞从细胞因子中去除，并在9天内追踪生存能力。（d）人类Bcl-2在Atg5 Tet-Off MEF中过度表达。蛋白质水平通过免疫印迹分析。（E） 用PBS或5μg/ml多西环素处理表达Bcl-2的Atg5 Tet-Off MEF 4 d，从血清中取出，并分析其在指定时间内的生存能力。（F） 用对照、Beclin-1或Atg5 shRNAi转染Bcl-2高表达的细胞，并从细胞因子中提取，在9天内追踪存活率。显示了三份样品的平均值和标准偏差*学生的p<0.05t吨测试样品相对于对照样品的测试。对于死亡曲线，*p<0.05t吨测试样品相对于对照样品的多个时间点。所示数据代表三个或更多实验。

自噬诱导的细胞死亡是凋亡性的

退出生长因子后，Bcl-2水平调节自噬诱导的细胞死亡的能力表明，细胞死亡可能是凋亡。凋亡诱导受促凋亡和抗凋亡蛋白的平衡调节，Bcl-2的自噬依赖性丢失可能降低了凋亡阈值。尽管在Bcl-2和高表达Bcl-2的细胞系中，IL3退出后Bcl-2蛋白水平都降低，但这不受shRNAi敲除Atg5的影响(图7A） ●●●●。为了测试Bcl-2细胞中IL3退出后自噬诱导的死亡是否真的是凋亡、Bax构象变化和活化(图7B） ，DNA降解到亚G1水平(图7C） ，和Caspase 3活性(图7D） 在停止使用生长因子后进行测量。IL3退出Bcl-2细胞后，三种凋亡标记物均增加(图7和自噬抑制抑制了这些标记(图7，B–D）。总之，这些数据表明，IL3退出后，中度Bcl-2表达的细胞发生凋亡，并以自噬依赖的方式增强。

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自噬不会导致Bcl-2降解，但会促进缺乏生长因子的Bcl-2表达细胞的凋亡。（A） 用对照或Atg5 shRNAi转染中等（左）和高（右）Bcl-2表达细胞，从细胞因子中提取，并分析外源性人类Bcl-2蛋白表达。（B和C）用Control、Beclin、Atg7或Atg12和活性Bax（B）转染中等表达Bcl-2的细胞，并在IL3存在或IL3退出36小时后分析亚G1 DNA含量（C）。（D） 在IL3存在或IL3退出24小时后，在转染对照、Beclin-1或Atg7 shRNAi的Bcl-2表达细胞中测量Caspase 3活性。显示了三份样品的平均值和标准偏差*学生的p<0.05t吨测试样品相对于对照样品的测试。所示数据代表三个或更多实验。

自噬增强促凋亡转录因子Chop的诱导

目前尚不清楚自噬如何导致细胞凋亡，但细胞内成分的自噬降解可能启动了促凋亡信号通路。特别是，自噬被证明在破坏未折叠蛋白中起作用(Hoyer-Hansen和Jaattela，2007年)，可能在生长因子退出后发生的细胞萎缩期间积累，并可能影响细胞存活。为了确定提取生长因子时是否发生未折叠蛋白反应，以及自噬是否影响这一过程，从细胞因子中提取转染对照或Atg5 shRNAi的Bcl-2表达细胞，并提取未折叠蛋白响应和ER应激蛋白Calnexin、Bip和磷酸化-EIF2α，随着时间的推移，还观察到了多应力转录因子Chop。与诱导所有内质网应激和未折叠蛋白反应标记物的衣霉素（Tun）处理细胞相比，Calnexin、Bip和磷酸化-EIF2α在转染对照shRNAi的细胞中细胞因子撤除后未发生改变(图8A） ●●●●。然而，Chop是在停止生长因子后诱导的(图8A） ，虽然低于Tun治疗后的水平。重要的是，在自噬缺陷细胞中未检测到Chop蛋白的诱导(图8A） 这表明，在缺乏典型内质网应激的情况下，生长因子撤除后的Chop诱导可能发生在自噬下游。事实上，shRNAi对自噬关键基因Beclin-1、Atg5、Atg7或Atg12的自噬抑制阻止了IL3停药后Chop mRNA的完全诱导(图8B） ●●●●。自噬有助于Chop的上调，但不是必需的，因为不管自噬抑制如何，Chop mRNA的部分诱导仍会发生。

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自噬促进生长因子停药后促凋亡转录因子Chop的诱导。（A） 用衣霉素（Tun）处理表达Bcl-2的细胞12小时，或用对照（Con）或Atg5 shRNAi转染细胞，并在指定时间内退出细胞因子。通过免疫印迹法测定Chop、Calnexin、Bip和pEif2α的表达。顶行是一个非特异性带（<），Chop用箭头表示。（B） 用对照或shRNAi转染Bcl-2表达细胞对抗自噬基因，提取IL3 1 d，然后用实时定量PCR分析Chop mRNA水平。显示了三次独立实验的平均值和标准偏差*学生的p<0.05t吨测试样品相对于对照样品的测试。所示数据代表三个或更多实验。

Chop先前被证明可以调节促凋亡蛋白Bim的转录诱导(普塔拉卡思等。, 2007)和彪马(石原等。, 2007)并可能调节其他生产因子导致生长因子缺乏细胞凋亡。为了确定Chop在IL3退出后诱导促凋亡蛋白中的重要性，shRNAi抑制了Chop的表达(图9A） ●●●●。这导致Bim-EL诱导蛋白水平下降(图9B） 、美洲狮(图9C） 和Bax(图9D） 所有这些都可能导致生长因子缺失的Bcl-2表达细胞的凋亡。在此处显示的暴露中，Bim、Bim-L和Bim-S的交替剪接亚型不容易通过蛋白质印迹检测到。Chop对Bim mRNA水平的调节至少部分是通过调节Bim mRNA水平实现的，因为Chop的shRNAi抑制完全阻止了IL3停药后Bim mRNA的增加(图9E） ●●●●。重要的是，与用对照shRNAi转染的细胞相比，shRNAi对Chop诱导的抑制大大增加了生长因子剥夺后Bcl-2中度表达的细胞的存活率(图9F） ●●●●。因此，在IL3退出后，Chop被诱导并调节促凋亡蛋白Bim、Puma和Bax，而自噬可以部分调节Chop的诱导和活性。

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Chop是诱导促凋亡Bcl-2家族蛋白和生长因子退出后细胞死亡所必需的。用对照（Con）或Chop shRNAi转染（A–D）Bcl-2表达细胞，并在指定时间内从IL3中取出。（A） 通过实时定量PCR检测shRNAi对Chop表达的抑制作用。免疫印迹法观察Bim-EL（B）、Puma（C）和Bax（D）在对照（Con）或Chop shRNAi转染细胞中的诱导作用。采集Bim mRNA（E），通过实时定量PCR测定其mRNA水平。（F） 用对照或Chop shRNAi转染表达Bcl-2的细胞，从IL3中提取，观察细胞存活时间。显示了三份样品的平均值和标准偏差*学生的p<0.05t吨测试样品相对于对照样品的测试。对于死亡曲线，*p<0.05t吨测试样品相对于对照样品的多个时间点。所示数据代表三个或更多实验。对于免疫印迹，分析中的蛋白质水平通过归一化肌动蛋白和每个面板中的对照样品进行量化，定量显示在每个通道下。

自噬以Chop依赖的方式特异性调节促凋亡蛋白Bim

由于在IL3停药后需要Chop来诱导Bim、Puma和Bax，并且Chop本身也受到自噬的部分调节，因此接下来要研究自噬在Bcl-2家族蛋白调节中的作用。生长因子缺乏细胞中的自噬抑制大大抑制了Bim-EL和Bim-L的诱导(图10A） ，而美洲狮(图10B） 和Bax(图10C） 未受影响。为了确定Bim的调节是否为转录，通过实时定量PCR分析转染对照shRNAi或shRNAi-抗自噬基因的Bcl-2表达细胞的Bim mRNA诱导(图10D） 。与用对照shRNAi处理的IL3提取的Bcl-2表达细胞相比，在IL3去除后12和24小时，用每个自噬基因shRNA处理的细胞显示Bim mRNA水平显著降低(图10D） 。因此，尽管Chop可能在生长因子退出后调节几种促凋亡蛋白，但自噬特异性抑制了Chop依赖性Bim诱导或mRNA稳定(松井等。, 2007).

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自噬以Chop依赖的方式特异性上调促凋亡蛋白Bim。用对照组Atg5或Atg7 shRNAi瞬时转染（A–C）Bcl-2表达细胞，在指定时间内从IL3中提取，并通过免疫印迹法测定Bim-EL和Bim-L（A）、Puma（B）和Bax（C）水平。（D） 用对照、Beclin-1、Atg5、Atg7或Atg12 shRNAi转染表达Bcl-2的细胞，并在指定时间内提取IL3。采集RNA，通过实时定量PCR分析Bim mRNA水平。用对照（Con）、Beclin-1、Atg5或Bim-shRNAi转染（E和F）Bcl-2细胞。（E） 通过IL3-脱附细胞的免疫印迹测试shRNAi对Bim表达的抑制。（F） 在IL3退出后，观察细胞活力随时间的变化。显示了三份样品的平均值和标准偏差*学生的p<0.05t吨测试样品相对于对照样品的测试。对于死亡曲线，*p<0.05t吨测试样品相对于对照样品的多个时间点。所示数据代表三个或更多实验。

Bim已被证明在促进造血细胞死亡方面具有特别重要的作用(布耶等。, 1999;赵等。, 2007). 为了评估Bim在细胞因子撤除后中度表达Bcl-2的细胞死亡中的作用，将细胞转染对照细胞Bim(图10E） Beclin-1或Atg5 shRNAi，并在停止使用生长因子后进行死亡分析。与Bim的自噬调节促进细胞死亡相一致，shRNAi抑制Bim诱导可提高生存率，其程度与抑制自噬相似(图10F） ●●●●。因此，Chop依赖性Bim诱导的特异性自噬调节似乎可以解释生长因子退出后Bcl-2和Bcl-xL表达细胞中自噬激活导致的凋亡死亡。

讨论

自噬在各种系统中被描述为促进或防止细胞死亡(勒姆等。2005年b;莱文和克罗默，2008年). 在这种情况下，自噬在生长因子撤除及其与凋亡的相互作用中可能发挥的作用尚不明确。在这项研究中，我们证明了生长因子提取的造血细胞在存活和死亡中的自噬具有双重性。尽管表达了Bcl-2和Bcl-xL，但在停止使用生长因子后仍能诱导自噬，并提供明显的代谢益处。在营养素缺乏或长时间停用生长因子后，自噬衍生的营养素已被证明对支持凋亡无能细胞的细胞活力至关重要(勒姆等。2005年a;马修等。, 2007). 然而，我们发现，在细胞因子退出后至少1周内，自噬衍生代谢物不需要支持缺乏生长因子的造血细胞存活。相反，自噬通过对促凋亡BH3-only蛋白Bim的Chop依赖性特异性调节，最终促进生长因子缺失细胞的凋亡。因此，自噬似乎有助于组织内稳态，在生长因子退出后使细胞对凋亡敏感，从而确保只有最具抗凋亡能力的细胞才能存活下来，以利用自噬作为长期生存机制。

研究表明，在氨基酸饥饿或雷帕霉素治疗下，Bcl-2家族蛋白与含BH3结构域的自噬蛋白Beclin-1相互作用，这种相互作用可以抑制自噬的诱导(帕廷格等。, 2005;梁等。, 2006). 然而，在取血清后，BH3-only蛋白Bad可以与Beclin-1竞争结合Bcl-2或Bcl-xL，从而缓解Beclin-1启动自噬，即使在Bcl-2和Bcl-xL过度表达的情况下(迈乌里等。, 2007;伊达尔-奥伯施泰因等。, 2007). 在缺血条件下也观察到过表达Bcl-2或Bcl-xL的细胞自噬(德根哈特等。, 2006)DNA损伤后(清水等。, 2004). 在这里，在IL3退出后，自噬在Bcl-2和Bcl-xL表达细胞中正常发生。我们观察到生长因子退出后细胞内内源性磷酸化-Bad水平没有变化（数据未显示），但BH3-only蛋白（如Bim和Puma）的表达增加可能已经充分破坏了Bcl-2/Bcl-xL-Beclin-1相互作用，从而允许自噬诱导。

当生长因子退出后外源性养分吸收减少时，自噬可以支持细胞代谢(勒姆等。2005年a;马修等。, 2007). 的确，Bax−/−贝克−/−细胞最终依赖自噬来支持基本的代谢过程(勒姆等。2005年a). 尽管自噬可以产生营养物质以维持生存，但之前还没有直接测量自噬提供的营养物质。我们发现，生长因子提取Bcl-2或Bcl-xL表达细胞中的自噬诱导导致氨基酸增加（反映在C5-鸟氨酸增加；图4B和补充图S1）和长链脂肪酸（反映为C18:1-和C18-肉碱增加，图3和​和4A；4A；米林顿等。, 1990;安等。, 2004). 重要的是，虽然长链脂肪酸的可用性似乎完全依赖于自噬，但氨基酸仅部分依赖于自吞噬。与生长因子和自噬无关的营养来源（如支持细胞代谢的氨基酸）一致，表达Bcl-2的细胞能够在自噬减少的情况下独立于生长因子存活至少一周(图6、C和F）。残留葡萄糖摄取或对氨基酸氧化的依赖可能有助于细胞存活。的确，Bax−/−贝克−/−提取生长因子后，细胞至少在5周内保持可测量的糖酵解通量(勒姆等。2005年a). 蛋白酶体降解导致的细胞萎缩也可能提供了足够的氨基酸来维持最小的线粒体氧化。另外，据报道，大分子自噬受到抑制后，伴侣介导的自噬增加，而该途径可能提供营养(Dice，2007年;考希克等。, 2008). 自噬和替代燃料在生长因子提取后作为营养源的作用将对未来的研究非常重要。

除了支持细胞新陈代谢外，自噬还可以通过降解受损的细胞内细胞器来提高细胞活力(科勒尔等。, 2007). 在自噬似乎可以促进存活的情况下，就像对照FL5.12细胞在退出生长因子后的情况一样，支持细胞存活的机制不是提供营养物质来替代失去的葡萄糖摄取，因为表达谷蛋白1和己糖激酶的细胞同样受到自噬抑制的影响(图5、C和D）。在表达Bcl-2的细胞中，细胞因子撤除后可保护其免受线粒体和其他细胞器损伤，在这些早期时间点不需要自噬。因此，自噬可能通过降解受损的细胞器，在生长因子退出后早期抑制细胞死亡。

在停止生长因子后的后期，自噬使适度表达Bcl-2或Bcl-xL的细胞对凋亡敏感。正常情况下，通过诱导促凋亡BH3-only蛋白和中和抗凋亡Bcl-2家族蛋白，细胞凋亡在生长因子退出后很快启动。在强烈抵抗凋亡的细胞中，自噬可能最终支持长期生存(勒姆等。2005年a;德根哈特等。, 2006;莱文和克罗默，2008年;维尔德洛等。, 2008)，由于诱导促凋亡BH3仅蛋白不足以诱导凋亡。的确，Bax−/−贝克−/−细胞对Bim诱导的细胞毒性具有完全抗性。因此，必须绕过细胞凋亡的初始屏障，以便在缺乏生长因子的情况下，通过自噬使细胞持续存活。我们的数据表明，通过增强Bim的诱导，自噬本身增加了细胞长期生存所必须承受的凋亡应激。支持这一观点的是，自噬在某些发育和组织内稳态环境中会导致细胞凋亡(阿克德米尔等。, 2006;优素福等。, 2006;斯科特等。, 2007;王等。2008年a,b条)尽管机制尚不明确。自噬对促凋亡蛋白Bim的调节代表了自噬和凋亡之间的一种新的联系，可能适用于细胞缺乏生长因子的各种情况，例如在发育和组织内稳态。

通过增加促凋亡BH3-only蛋白Bim的Chop依赖性上调，发生自噬诱导凋亡(图9、B和E）。Chop是内质网应激诱导的转录因子(Oyadomari和Mori，2004年;普塔拉卡思等。, 2007)，但在停止生长因子后，没有出现典型的内质网应激和未折叠蛋白反应(图8A） ●●●●。Chop已被证明能对多种细胞应激做出反应(Oyadomari和Mori，2004年)自噬可能启动或增强这种途径。重要的是，抑制自噬仅阻止生长因子退出后部分Chop的诱导，除Bim外，Chop对诱导Bax和Puma也是必要的。然而，自噬只是Chop介导的Bim mRNA上调所必需的。因此，shRNAi抑制Chop导致从生长因子中提取的表达Bcl-2和Bcl-xL的细胞的存活率高于单独抑制Bim的表达(图9F与图10F） ●●●●。自噬对Chop诱导和活性的修饰在细胞存活中起着重要作用，但其确切机制尚不清楚，可能与环境有关。特别是，当表达Bcl-2的MEF缺乏血清时，尽管细胞死亡增强，但我们无法检测到Bim的自噬依赖性调节，这表明自噬可能促进不同系统中不同的促凋亡信号通路。这是未来研究的一个重要领域。

自噬对细胞存活既有积极作用，也有消极作用，但这两种结果是如何调节的，以及细胞在什么条件下可以利用自噬产生的营养物质作为生存机制，目前尚不清楚。在这里，我们使用对凋亡有轻微或中度抵抗力的非转化造血细胞来检测自噬在生长因子撤退中的作用。令人惊讶的是，自噬通过促进Chop依赖的Bim上调而增强了细胞凋亡。对Bim表达敏感的细胞或组织可能对Chop的自噬调节和凋亡特别敏感。这些发现与凋亡的发生是为了阻止细胞在缺乏生长因子的情况下长期存活的观点一致(勒姆等。2005年a;德根哈特等。, 2006;冯等。, 2008)并进一步表明自噬增强了这种凋亡应激。通过这种方式，只有抗凋亡药物与促凋亡Bcl-2家族成员高度平衡的细胞才能在停止使用生长因子后长期存活，以利用自噬提供的替代燃料来源。为了更好地理解这两种途径如何影响正常和疾病过程，进一步阐明凋亡和自噬相互作用的机制仍然很重要。

补充材料

【补充资料】

致谢

我们感谢Tamotsu Yoshimori博士（日本三岛国立遗传研究所）、Youwen He博士（杜克大学）、Noboru Mizushima博士（日本东京医科牙科大学，Bunkyo-Ku）以及Julian Lum和Craig Thompson博士（宾夕法尼亚大学）慷慨提供上述试剂，杜克大学病理电子显微镜设备。我们还感谢克里斯托弗·纽加德博士、萨利·科恩布卢斯博士、莱塔·纳特博士（杜克大学）、埃里克·贝赫雷克博士（马萨诸塞大学医学院，马萨诸塞州伍斯特市），以及莎拉·雅各布斯和克里斯蒂娜·鲍尔斯博士的有益评论和见解。这项工作得到了国家癌症研究所拨款RO1 CA123350的支持。

脚注

这篇文章在年印刷之前在网上发表媒体MBC(http://www.molbiolcell.org/cgi/doi/10.1091/mbc.E08-08-0829)2008年12月24日。

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文章来自细胞分子生物学由以下人员提供美国细胞生物学学会