Bcl-2家族成员在程序性细胞死亡或凋亡的过程中起关键作用(17,25,36). Bcl-2家族由抗凋亡药物（Bcl-2，Bcl-xL（左）、Bcl-w、Mcl-1、A1、NR-13、BHRF1、LMW5-HL、ORF16、KS-Bcl-2、E1B-19K和CED-9）和促凋亡（Bax、Bak、Bok、Bik、Blk、Hrk、BNIP3、BimL（左）、Bad、Bid和EGL-1）分子(1). 这些蛋白质可以形成同源和异源二聚体，涉及被称为Bcl-2同源（BH）结构域的氨基酸序列。已确定其中四个域（BH1至BH4）(20,25,36,44). 促凋亡分子的BH3结构域似乎是抗凋亡分子和促凋亡分子之间相互作用所必需的(5).
一些Bcl-2家族成员的主要作用部位似乎是线粒体(9,19,21,37,41). 线粒体在许多类型的细胞凋亡中起主要作用。特别是，该细胞器释放凋亡诱导因子(40)和细胞色素c（c）(三,9,19,21,37,45). 后者通过Apaf-1–caspase 9复合物的形成触发caspase 8激活(26). Bcl-2家族成员在调节细胞色素中发挥关键作用c（c）释放。而Bcl-2和Bcl-xL（左）抑制细胞色素c（c）释放(三,21,45)，Bax在体外刺激分离线粒体和异源表达后的完整细胞中的这一事件(三,9,19). 这些蛋白质发挥其功能的机制目前尚不清楚。
Bcl-x的三维结构L（左）(34)和投标(6,31)揭示了这些蛋白质与细菌毒素大肠杆菌素和白喉毒素的通道形成域之间的结构相似性。与这种结构相似性一致，该家族的一些成员包括Bax、Bcl-2和Bcl-xL（左）也能在合成脂膜中形成离子通道(2,33,38,39). 这些蛋白质的通道形成活性尚未在体内得到证实。然而，现在很清楚，至少在细胞凋亡期间，这些蛋白质与细胞内膜，特别是线粒体膜有关。触发Bcl-2家族成员膜结合的事件仍不清楚，尽管很可能像大肠杆菌素和白喉毒素一样，Bcl-2家庭成员在进行膜插入之前可能必须经历构象变化。
我们之前已经证明，在缺乏血清和钾的小脑颗粒细胞或暴露于staurosporine的HeLa细胞凋亡的早期阶段，Bax发生构象变化(8). 类似地，据报道，Bak是Bcl-2家族的另一个促凋亡成员，在细胞色素形成之前，Bak的结构在各种类型的凋亡过程中发生构象变化c（c）线粒体释放(8,12). 对于Bax和Bak，这种构象变化似乎暴露了N末端结构域，否则该结构域是隐蔽的，抗体无法进入。有趣的是，Bid，一种与Bax相互作用的BH3域蛋白，能够触发Bax的构象变化(8). 我们目前实验的目的是了解Bax构象中开关的作用以及这个关键事件如何与细胞色素相关c（c）在这里，我们报告了Bid诱导的构象变化后，Bax寡聚并紧密插入线粒体外膜，无需任何蛋白水解事件。Bax在线粒体外膜中的整合随后是细胞色素c（c）与Bax膜整合相反，释放高度依赖镁。
材料和方法
细胞培养。
HeLa细胞和组成性过度表达Bcl-2（HeLa–Bcl-2）的稳定HeLa电池系(10)在基础Iscove培养基和补充有10%胎牛血清和2 mM的Ham’s F-12培养基（Seromed）的1:1混合物中培养我-谷氨酰胺。
亚细胞分离。
在诱导凋亡后的不同时间，在等张线粒体缓冲液（MB）（210 mM甘露醇、70 mM蔗糖、1 mM EDTA、10 mM HEPES[pH7.5]）中收集HeLa细胞，并添加完整的蛋白酶抑制剂混合物（Boehringer Mannheim）。通过安装在5毫升注射器上的25G1 0.5×25毫米针头将细胞分为六个通道，然后以2000×克在Eppendorf离心机中，温度为4°C。该程序重复两次，在13000×克在4°C下保持10分钟。上清液在600000×克在4°C下保持10分钟，以产生轻质膜颗粒（未分析）和最终可溶性部分（S100）。将重膜材料混合并重新悬浮在MB-EGTA中（MB用0.5 mM EGTA代替EDTA），并在500×克在4°C下保持3分钟，以消除残余核。所得上清液以10000×克在4°C下保持10分钟，以进一步纯化线粒体部分。蛋白质浓度通过Bradford方法估算(4)以牛血清白蛋白为标准。
Bax插入和细胞色素的体外检测c（c）释放。
线粒体（100μg蛋白质）在100μl MBC缓冲液（MB加EGTA，补充4 mM MgCl）中有或无各种重组蛋白的情况下培养2，5 mM钠2高功率放大器4，5 mM琥珀酸盐和5μM鱼藤酮）在30°C下离心15分钟，然后在13000×克和4°C。上清液和颗粒用于细胞色素的测定c（c）释放。对于碱提取，在新制备的0.1 M Na中重新悬浮线粒体颗粒（1 mg蛋白质/ml）2合作三（pH 11.5），并在冰上培养20分钟。然后通过离心（600000×克在4°C下保持20分钟）。在4~20%Tris-Gly凝胶（NOVEX）上，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出对应于10μg蛋白质（耐碱组分）和相应体积上清液（碱敏感组分）的线粒体膜微丸。它们各自的细胞色素含量c（c）用多克隆抗细胞色素蛋白免疫印迹法测定Baxc（c）抗体（稀释度1:2500）或针对Bax的多克隆抗体（Upstate Biotechnology）。通过使用抗细胞色素抗体验证线粒体颗粒的负载量相等c（c）氧化酶亚基IV（Cox IV）或抗细胞色素c（c）氧化酶亚基II（Cox II）（均来自分子探针）或抗电压依赖性阴离子通道VDAC（钙生物化学）的抗体。用辣根过氧化物酶偶联山羊抗兔免疫球蛋白G和增强化学发光检测试剂检测抗原-抗体复合物。
交叉链接。
线粒体（0.5 mg蛋白质）与重组蛋白孵育，然后通过离心造粒，并重新悬浮在MB-EGTA和二巯基二甲基亚砜（DMSO；Pierce）或二（磺基琥珀酰亚胺）二甲醚（BS）二甲酚（DSS）中三)（在5 mM柠檬酸钠缓冲液[pH 5.0]中；Pierce）从10倍储备溶液中添加至最终浓度2 mM。在室温下培养30分钟后，通过添加1 M Tris-HCl（pH 7.5）至最终浓度20 mM来淬火交联剂。淬火后，将膜溶解在RIPA缓冲液中，并在12000×克用抗Bax 2D2单克隆抗体（Genzyme）对裂解产物进行免疫沉淀，然后用多克隆抗Bax抗体进行Western印迹分析。
洋地黄治疗线粒体。
用Bid孵育后，将线粒体（100μg）制成颗粒，溶解在100μl洋地黄素（1.2 mg/ml）中，并在冰上孵育25分钟。通过离心将有丝分裂体制成丸，并溶解在100μl RIPA缓冲液中。如上所述，通过Western blotting分析组分。
重组蛋白的生产。
His-tagged Bid，Bid突变体，人类Bcl-xL（左），和人类突变型Bcl-xL（左）（Bcl-xL（左）m： G公司138→A） ，均为Bcl-xL（左）COOH末端缺乏24个氨基酸的蛋白质如前所述产生(8).
结果
staurosporine处理的HeLa细胞中Bax整合到线粒体膜。
在许多培养细胞中，Bax存在于细胞溶质和线粒体部分(15,43; 未发表的观察）。为了测试线粒体Bax是否整合在线粒体膜中，我们从HeLa细胞分离的线粒体中碱提取蛋白质。密件抄送-xL（左）对Bak和Cox II进行平行分析。与Bcl-x相比L（左）或Bak，它们对碱提取具有抗性，在这种处理过程中，大多数Bax丢失，这表明在正常条件下，Bax松散地附着在线粒体上，而大多数Bcl-xL（左）和Bak蛋白插入膜中（图。A和B）。当用staurosporine处理HeLa细胞时，Bax以时间依赖的方式对碱提取产生抗性。用staurosporine孵育12小时后，发现几乎所有Bax都插入线粒体膜中（图。A） ●●●●。这些结果与Goping等人之前报告的结果一致(11)证明在死亡刺激下，Bax插入线粒体膜。
Bax在细胞凋亡和Bid治疗后整合到线粒体膜。（A） 在无或有1μM staurosporine的情况下培养越来越多时间的HeLa细胞，分离出线粒体，并用0.1 M Na处理2合作三生产耐碱（Att[附]）和耐碱（Ins[插入]）馏分。通过Western blotting分析两个组分中是否存在Bax。Cox II用作凝胶负荷控制。（B） 将HeLa细胞的线粒体与100 nM重组野生型Bid和两个Bid突变体（BidmIII-1和BidmIII-3）在30°C下培养15分钟，通过离心回收，并用0.1 M Na处理2合作三同上。通过Western blotting分析碱敏感组分（Att.）和抗性组分（Ins.）中的各种蛋白质。（C） 细胞色素c（c）与野生型和突变型Bid孵育后，在线粒体悬浮液中通过Western blotting进行分析。
本研究的主要目的是确定Bax在线粒体膜中插入的机制。我们之前报道过，在葡萄孢菌素诱导HeLa细胞凋亡的过程中，线粒体Bax发生构象变化，使其N末端可被抗体攻击(8). 这一事件伴随着细胞色素的释放c（c）此外，我们报告称，在细胞凋亡过程中易位到线粒体的Bid，在直接添加到分离的线粒体中时能够触发Bax构象的变化。因此，Bid可能是负责推动Bax整合到线粒体膜的蛋白质。图B表明，将100 nM-Bid添加到从HeLa细胞分离的线粒体中，使Bax对碱提取具有抵抗力，表明Bax经历了膜整合。当线粒体在100 nM-Bid和100μM z-VAD-fmk（一种广谱caspase肽抑制剂）存在下孵育时，也获得了类似的结果，表明Bid诱导的Bax膜插入与caspase激活无关（结果未显示）。Bcl-x的线粒体水平L（左）、Bak、Cox IV和VDAC均为膜整合蛋白，在Bid处理后未发生变化（图。B） ●●●●。与线粒体的Bid结合对碱处理仍然敏感，这表明与Bax相反，该蛋白本身并不整合到线粒体膜中（图。B） ●●●●。
投标方通过其BH3域与其他Bcl-2家族成员互动(42). 为了确定Bid与Bax的结合是否是Bax插入的先决条件，两个Bid BH3突变体对任一Bax的亲和力选择性降低（BidmIII-3:G94→A）(8,42)或Bcl-2（BidmIII-1:M97D类98→AA）(8,42)进行了测试。虽然BidmIII-1与野生型Bid一样有效，但BidmIII-3不能刺激Bax插入（图。B） 和细胞色素c（c）线粒体释放（图。C） ●●●●。总之，这些结果强烈表明，Bid通过直接与Bax相互作用诱导Bax的插入。
Bax在线粒体外膜的整合。
接下来，我们使用洋地黄素选择性溶解线粒体外膜，测试Bax是插入线粒体外膜还是插入线粒体内膜。分别存在于线粒体外膜和内膜中的VDAC和Cox IV用于建立最佳提取条件。在1.2mg洋地黄苷/mg蛋白质的存在下，HeLa细胞的线粒体丢失了大部分VDAC蛋白质，而Cox IV仍然附着在线粒体上，这表明从线粒体外膜选择性提取蛋白质的条件（图。). 与VDAC一样，Bax被发现对洋地黄提取液敏感，证实在非凋亡细胞中Bax附着在线粒体外膜上。少量Bax对洋地黄素提取不敏感，这可能反映Bax存在于接触部位，尽管我们不能排除蛋白质的一小部分也定位于线粒体内膜的可能性。然而，重要的是，在与Bid孵育15分钟后，对洋地黄素耐药的Bax的比例没有改变。相反，检测到对洋地黄素敏感的Bax数量增加（图。). 在有Bid的情况下检测到的Bax水平的增加反映了Bax与线粒体膜紧密相连的事实，而在没有Bid的条件下，在重复洗涤过程中，线粒体很容易丢失大量Bax。Bcl-x公司L（左）也主要存在于线粒体外膜中，并且在Bid治疗后其分布保持不变（图。). 我们从这些实验中得出结论，Bax与Bid相互作用后，整合到线粒体外膜。
Bid诱导Bax插入线粒体外膜。从HeLa细胞中分离的线粒体（100μg）在30°C下与100 nM-Bid孵育15分钟，并在4°C下用洋地黄素（1.2 mg/ml）处理25分钟。通过Western blotting分析了对洋地黄素敏感（Out.[外线粒体膜]）和耐药（In.[内线粒体膜]L（左）.
Bax二聚。
以前有报道称Bax以单体形式存在于细胞质中(16)二聚化是线粒体易位的先决条件(13). 这促使我们测试Bid是否能够触发Bax二聚化，以及这是否先于膜整合。用膜透性DSS或非膜透性BS处理完整的线粒体三交联剂。在没有Bid的情况下，Bax被检测为单体。然而，在存在100 nM Bid的情况下，可以清楚地检测到大约40和60 kDa的两条Bax免疫反应带（图。). 这些可能对应于Bax同型二聚体和三聚体或Bax异二聚体。我们还检测到一个额外的Bax免疫反应带，该带在～40 kDa处运行，可能对应于与未知蛋白质相连的Bax单体（图。). 两种不同的抗Bax抗体也获得了类似的结果。使用针对Bcl-2、Bcl-x的抗体未检测到这些蛋白带的免疫反应性L（左）、Bag-1、Bid或VDAC。
Bid诱导Bax齐聚。将HeLa细胞分离的线粒体与1μM Bid在30°C下孵育15分钟，并用材料和方法中所述的两种不同的交联剂处理线粒体颗粒。交联后，用抗Bax单克隆抗体对混合物进行免疫沉淀，并用抗Bax多克隆抗体进行Western印迹分析。
接下来，我们研究了Bax寡聚化、其膜插入和线粒体细胞色素之间的时间关系c（c）释放。图A表明，向分离的线粒体添加Bid后，在2.5到5分钟内观察到Bax二聚体和三聚体，其水平在10分钟达到峰值。B） ●●●●。细胞色素释放c（c）在添加Bid后的5到10分钟内，也出现了线粒体损伤，尽管直到15分钟后才观察到最大水平（图。C） ●●●●。这些结果表明Bax二聚（或齐聚）先于其膜整合和细胞色素流出c（c）来自线粒体。
Bax齐聚、Bax膜插入和细胞色素的时间进程研究c（c）将Bid添加到分离的线粒体后释放。将HeLa细胞分离的线粒体与重组Bid在30°C下孵育增加时间，并分析Bax寡聚化（A）、Bax膜插入（B）和细胞色素c（c）释放（C）。附件（碱敏感）；发票。，插入（耐碱）；细胞色素cc（c）.
Bcl-x对Bid诱导的Bax在线粒体外膜整合的调控L（左）和Bcl-2。
我们之前已经证明Bcl-2和Bcl-xL（左）能够抑制细胞中Bax构象的变化，这些细胞受到凋亡刺激或在分离的线粒体中加入Bid后L（左）可以阻止Bid诱导的Bax齐聚并插入膜中。我们发现在Bcl-x的存在下L（左），Bid无法触发Bax膜整合，细胞色素c（c）释放或Bax齐聚（图。A至C）。相反，Bcl-x的突变体L（左）（Bcl-xLm（磅）)未能结合Bax，但未抑制这些连续事件。当从过度表达Bcl-2的HeLa细胞中加入线粒体时，Bid也无法触发Bax整合（图。D） ●●●●。
Bcl-x公司L（左）和Bcl-2抑制Bid诱导的低聚化和Bax插入线粒体外膜。在1μM重组Bcl-x存在下，用100 nM-Bid培养从HeLa细胞分离的（A至C）线粒体L（左）或Bcl-xL（左）用线粒体研究Bax插入线粒体外膜（A）、细胞色素c（c）释放（B）和Bax二聚（C）。（D） 分离出过表达Bcl-2的HeLa细胞的线粒体，并在30°C下与100 nM-Bid孵育15分钟，用于分析Bax插入线粒体外膜的情况。附件（碱敏感）；检验。，插入（耐碱）；控制中心。，控制；细胞色素cc（c）.
无细胞色素Bax的膜插入c（c）在没有镁离子的情况下释放。
我们以前报道过Bax触发细胞色素的能力c（c）线粒体的释放高度依赖于镁离子，但与通透性转换孔的开放无关(9). 我们现在通过测试镁对Bax的膜插入是否重要来扩展这些观察结果。图A表明，在存在和不存在2.5 mM Mg的情况下，在线粒体中加入Bid后，Bax对碱提取具有抵抗力2+表明Bax在膜中的整合与Mg无关2+然而，只有线粒体在2.5 mM Mg存在下与Bid孵育2+被发现释放细胞色素c（c）（图。B） ●●●●。使用2.5 mM MnCl也获得了类似的结果2，可替代MgCl2在许多情况下（图。). 然而，其他离子，如钠、钾或锂，均在5 mM下测试，效果要差得多（图。B） ●●●●。我们得出结论，镁的存在对Bax诱导的细胞色素很重要c（c）只有Bax插入线粒体后才会释放。
与细胞色素相反c（c）释放，Bid-induced insert of Bax不需要Mg2+（A）将HeLa细胞的线粒体与100 nM-Bid在30°C和2.5 mM MgCl存在或不存在的条件下孵育15分钟2或氯化锰2在分析Bax插入膜之前。（B） 线粒体在存在或不存在100 nM Bid和各种盐（包括MgCl）的情况下培养2（2.5 mM），氯化锰2（2.5 mM）、KCl（5 mM），NaCl（5 mM）和LiCl（5mM）。对上清液和线粒体颗粒进行细胞色素分析c（c）释放。控制中心。，控制；附件（碱敏感）；发票。，插入（耐碱）；塞浦路斯。c、 细胞色素c（c）.
讨论
Bax，一种促凋亡蛋白，在许多神经细胞类型和卵巢卵泡中绝对需要凋亡(7,32)，通过触发细胞色素发挥其部分活性c（c）线粒体释放(9,19,21,37,41). Bax刺激细胞色素的机制c（c）外流仍不清楚。在以前的报告中，Bax蛋白水平的细胞凋亡过程中发生了一些事件，包括线粒体移位(15,43)，构象变化(8)，二聚(11,13)和膜集成(11,13)，已描述。尽管如此，Bax插入线粒体膜的机制以及Bax在线粒体内的定位仍不清楚。这里我们显示，Bid，一种仅含BH3的Bax相互作用蛋白，能够触发Bax在线粒体外膜的整合。我们之前已经报道过，Bid能够诱导Bax构象的变化，导致其N末端结构域的暴露。有趣的是，Bax的N末端结构域可能通过干扰疏水性C末端膜锚定结构域来抑制Bax靶向线粒体膜的活性(11). 因此，Bid诱导的Bax构象变化可能是导致Bax插入膜的一系列事件中的第一个。Bax二聚体化似乎是Bax在膜中整合的另一个关键事件，因为Bax的二聚体增强后会特异性靶向线粒体并引发一些线粒体功能障碍(13). 然而，在这项研究中，Bax增强的二聚体未能触发细胞色素c（c）线粒体释放，表明Bax二聚体可能不代表膜插入或细胞色素的正确四级结构c（c）释放(13). 与Gross等人报告的数据一致(13)，我们的结果表明活性Bax同二聚体或低聚物在与Bid相互作用后形成。然而，我们不能排除Bax也与其他蛋白质形成大络合物的可能性。Bcl-2和Bcl-xL（左）能够阻止Bax寡聚和插入，这与我们之前的结果一致，即两种抗凋亡蛋白通过直接与Bax结合来抵消Bid诱导的Bax构象变化。然而，Bcl-x仍有可能L（左）或Bcl-2抑制Bax诱导的细胞色素c（c）释放与Bax结合无关(22)通过形成能够平衡Bax作用的通道。
Bax在膜插入后触发细胞色素的机制c（c）线粒体的释放尚不清楚。有人提出Bax可能通过与腺嘌呤核苷酸转运体的相互作用刺激通透性转换孔（PTP）的开放(30). 由于PTP开放，线粒体会膨胀，导致线粒体外膜破裂，细胞色素被动释放c（c）(23,24). 然而，有一些类型的细胞凋亡是线粒体收缩而不是肿胀(18,27–29,46)在缺乏神经生长因子的交感神经元中，细胞色素的释放c（c）如果胱天蛋白酶激活被阻止，可以逆转(29). 此外，我们发现PTP抑制剂环孢霉素A不能抑制Bid诱导的Bax插入线粒体膜（结果未显示）和Bax诱导的细胞色素c（c）线粒体释放(9). 总之，这些研究表明细胞色素的释放c（c）线粒体损伤可能是一个控制良好的事件，在某些情况下发生，独立于PTP的开放。一种可能的机制是Bax形成一个足够大的通道，允许细胞色素的释放c（c）以及其他类似大小的蛋白质。Bax在膜内的整合将是导致通道形成的一系列事件中的第一个。尽管如此，我们报告Bax插入线粒体不足以触发细胞色素c（c）释放。事实上，在缺乏镁的情况下2+，细胞色素c（c）尽管Bax插入线粒体膜，但未释放。
上述所有实验均采用全长Bid进行，此前有报道称，Bid在staurosporine诱导HeLa细胞凋亡过程中易位到线粒体(8). 与Bax相反，我们发现Bid不整合在线粒体膜中。这与白细胞介素-3剥夺FL5.12细胞期间caspase 8裂解Bid后发现的情况相反。在这些研究中，Bid的裂解形式（p15 Bid）转位到线粒体并成为一种完整的膜蛋白(14). 我们发现，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8裂解的Bid在触发Bax插入线粒体膜和细胞色素中的效率至少是其10倍c（c）线粒体流出（R.Eskes等人，未发表的数据）。
通过洋地黄素提取评估，Bax整合发生在线粒体外膜。在细胞色素的过程中，我们还没有检测到Bax从线粒体外膜向线粒体内膜的移位c（c）释放。这与其他人的结果形成对比，他们报告了用白术苷处理线粒体后Bax从线粒体外膜重新分布到线粒体内膜(30). 我们的结果强烈表明Bax通过物理存在于线粒体外膜而发挥其凋亡功能。如前所述，这种定位与Bax与线粒体外膜通道VDAC相互作用的能力相一致(35). 这种定位也符合Bax本身可能形成一个通道来释放细胞色素的假设c（c）然而，Bax的一小部分，以及Bak和Bcl-xL（左），被发现整合在非凋亡细胞线粒体的线粒体外膜中。在没有凋亡刺激的情况下，Bax和Bak可能通过形成Bax–Bcl-x而在膜中失活L（左）或Bak–Bcl-xL（左）异二聚体，尽管我们不能排除这些蛋白在非凋亡细胞中也有功能并发挥生理作用的可能性。
总之，我们的结果与细胞凋亡模型一致，在该模型中，Bid与Bax相互作用，触发Bax构象的变化，导致二聚（或齐聚）并整合到线粒体外膜（图。).
凋亡期间Bid激活Bax的模型。在凋亡刺激后，Bid与Bax结合并触发Bax构象的改变。因此，Bax二聚体（或寡聚体）并插入线粒体外膜，从而产生细胞色素c（c）（Cyt.c）从线粒体释放。
