磷酸酶在核膜拆卸和重组中的作用及其与病理学的相关性

摘要

1.简介

在高等真核生物中，染色体凝聚循环是细胞分裂过程中遗传物质忠实分配的必要步骤，伴随着核膜（NE）的重组。有丝分裂开始时，NE被分解，整个基因组浓缩成有丝分裂染色体，基因转录和翻译减弱，许多DNA结合蛋白从染色质中去除[1]。为了在有丝分裂结束时重组有功能的细胞核，所有这些修饰必须在分裂完成后被逆转和恢复[2]。这些戏剧性的重组事件由磷酸化波调节，主要是由于有丝分裂开始和中期之间的激酶活性，以及有丝分裂退出期间的磷酸酶活性导致的去磷酸化。

本期的其他综述涉及蛋白磷酸酶在早期有丝分裂事件中的参与；在这里，我们将重点关注有丝分裂期间与NE重组过程相关的磷酸化开关。

2.核膜结构和组成

真核生物的一个主要特征是存在一个屏障，NE，将细胞核内容物从细胞质中分离出来。NE由外核膜（ONM）、内核膜（INM）、核孔复合体（NPC）和核膜组成。ONM和INM从内质网（ER）的膜延伸，类似地，核周间隙与ER腔是一个连续体[三].

NPC是巨大的蛋白质复合物（约100-125 MDa[4])跨越NE，调节核质和细胞质之间限制和双向的RNA和蛋白质交换，但也参与基因组组织和转录调控[5,6]。NPC由约30种不同的核孔蛋白（Nup）组成[7]以不同的亚复合物组织：Y复合物、细胞质复合物、内环复合物、跨膜Nups、Nup62复合物和核篮复合物[8].

在后生动物细胞中，核纹层与NE的核侧相结合，由层粘连蛋白和纤维蛋白（V型中间丝）组成，它们以头尾构象形成同源二聚体。层粘连蛋白分为两类：A型层粘连蛋白和B型层粘连蛋白。A型层压板，包括层压板A、层压板AΔ10、层压板C和层压板C2，由LMNA公司基因和B型层粘连蛋白、层粘连B1和层粘连B2由LMNB1型和LMNB2型基因，分别[9]。一些蛋白质，如膜相关蛋白1/2（LAP1/2）、层粘连蛋白B受体（LBR）、emerin等，与核膜相关。板层不仅为NE提供弹性和刚度（归因于A型板层），而且核板还参与许多细胞功能，如染色质与NE的连接、染色质组织、细胞骨架连接、细胞信号传递等[10].

这些复杂的结构和蛋白质相互作用需要重新组织，以实现成功的有丝分裂。因此，NE的有序分解发生在细胞分裂开始时，而有丝分裂退出时发生逐步重建。这是一个严格调控的过程，也需要与染色质的缩合/去缩合循环以及细胞骨架的其他重组过程同步。

3.核外壳拆卸

核膜破裂（NEBD）是一个通常与前期结束相关的阶段，由细胞周期蛋白依赖性激酶1（CDK1）、Aurora激酶、Polo-like激酶1（PLK）和有丝分裂基因a（NIMA）相关激酶中Never等激酶对特定底物的磷酸化来指导。这一过程还需要两种主要蛋白磷酸酶的活性减弱，即蛋白磷酸酶1（PP1）和蛋白磷酸酶2A（PP2A）[11,12,13,14]。PP1，尤其是PP1亚型PP1α和PP2A活性已被CDK介导的磷酸化抑制。在有丝分裂进入期间，CDK1/CyclinB磷酸化PP1的C末端[15]。在有丝分裂进入时，PP2A-B55也被灭活[16]。这种失活可能是由于CDK1激活的长城激酶（Gwl）磷酸化ENSA/Arpp19并使其结合PP2A-B55导致磷酸酶抑制。该系统还依赖于通过CDK1磷酸化使PP1失活[15,17,18].

此外，也有证据表明，两种磷酸酶（PP1和PP2A）之间需要相互作用，以确保它们在裂变酵母中失活[18].

NEBD和核渗透的第一步是NPC的分解；这是由Nups的磷酸化介导的。蛋白质组学研究已在不同的Nup中鉴定出许多有丝分裂磷酸位点，这些Nup属于几个亚复合物(图1)并表示Nup98[19]和编号35[20]在人类细胞有丝分裂中是高度磷酸化的Nup。

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图1

有丝分裂期间核膜成分磷酸化。核孔复合体（NPC）及其与核膜（外核膜（ONM）和内核膜（INM））、层粘连蛋白（棕色）和NE蛋白（紫色）的相互作用的示意图。NPC由属于不同亚复合物的核穿孔蛋白（NUP）组成：Y复合物（细胞质和核环）（粉红色）、跨膜NUP复合物（蓝色）、内环复合物（绿色）、Nup62复合物（灰色）和核篮复合物（红色）。在开放式有丝分裂过程中，核膜破裂，导致染色体分离。这个过程是由磷酸化驱动的。根据已发表的磷酸蛋白质组学研究，列出了每个NUP的有丝分裂特异性磷酸化氨基酸（AA）[21,22]，以及中确定的候选激酶（红色的PLK家族和蓝色的Aurora激酶家族）[23]。LBR：拉明-B受体；LEMD3：LEM结构域蛋白3；NUPL2：核通道蛋白样蛋白2；POM121：孔膜蛋白121kDa；RanBP2：Ran结合蛋白2。

一些研究已经开始揭示NPC在有丝分裂进入时分解的分子机制。Nup98（Y复合物的一种成分）的释放是鼻咽癌解体的早期事件之一，发生在鼻咽癌的前期[24,25]由于Nup98被几种有丝分裂激酶逐步过度磷酸化，包括CDK1/Cyclin B和NIMA相关激酶（NEK）家族成员[19]。最近，PLK1在促进NPC拆卸中的作用也得到了强调[20,26]。与有丝分裂磷酸蛋白组学数据一致，PLK1是负责这些磷酸化的代表性最高的激酶(图1)，PLK的抑制而不是Aurora B激酶的抑制导致进入有丝分裂，伴随着层a/C的完全扩散，但NPC的不完全解体[26]。PLK1的靶点似乎在NPC分解中起主要作用，是支架核穿孔蛋白Nup35和NPC看门人Nup98。Nup98中的初始磷酸化发生在可访问和潜在的非结构化区域。这些区域的磷酸化可能通过变构机制影响Nup98 C末端结构域的整体构型，变构机制与其他支架Nup的磷酸化协同作用，导致NPC的初始分解。在几个Nup中确定的不同磷酸化的作用及其对最终NPC分解的贡献仍有待确定。

在这个过程之后，CDK1/Cyclin B对A型层粘连蛋白的磷酸化导致核层的解聚[27]而B型层粘连蛋白的分解似乎归因于前期晚期蛋白激酶C（PKC）的活性[28,29]。针对B型纤丝磷酸化的体内研究表明，PKC的βII亚型以拉明B的S405残基为靶点，并促进其分解[30]。当层粘连蛋白为INM提供结构时，染色质结合蛋白，如屏障-自整合因子（BAF）（BANF1基因的产物），介导染色质和去甲肾上腺素之间的联系。BAF被痘苗相关激酶（VRK）1磷酸化，导致染色质从去甲肾上腺素中分离出来[31]。最近的一项研究很好地说明了有丝分裂过程中核膜与染色质发生扰动分离的后果，其中NE和染色质之间施加了一种强制的束缚；在这种情况下，可以观察到染色体凝聚缺陷和后期染色质桥[32]。核膜的解体导致NE膜上的染色质释放，并将其撤回有丝分裂内质网[33]。因此，从我们到目前为止所讨论的内容来看，很明显，所有这些过程都是可能的，因为CDK1在有丝分裂开始时通过其抑制性Thr14和Tyr15残基的去磷酸化而激活。这些抑制性磷酸化被Cdc25A和Cdc25B去除[34]因此，在有丝分裂开始时，磷酸酶间接参与NEBD和其他主要步骤。在解释其机制之前，众所周知，抑制蛋白磷酸酶可能导致染色体过早凝聚（PCC）。使用冈田酸（OA）治疗人类外周血淋巴细胞可能以剂量依赖性的方式导致PCC，而与细胞周期阶段无关[35]。该技术已用于放射生物学剂量学的若干应用中[36]临床人类核型分析[37].

基于细胞周期调控的现有知识，以及NE溶解和染色质凝聚之间协调所涉及的激酶（综述于[38,39])可以预测，PCC的诱导将由CDK1、PLK1（及其对着丝粒的靶向性）的激活触发，并伴随着Lamin A和NPC的分解[26,27,28]。然而，我们未发表的工作(图2)并不意味着情况就是这样。OA通过PP1和PP2A失活诱导PCC确实会导致PCC和磷酸化（活性）PLK1靶向着丝粒，但在大多数情况下与拉明A和NPC的完全溶解无关。因此，如果PP1/PP2A的失活足以驱动染色体凝聚[35]，它还建议需要发生其他事件来拆卸NE，并且这两个进程可以解耦。这是在细胞周期中染色体凝聚和NE重组可以解偶联的少数例子之一。唯一的另一个已知病例是MCPH1的突变，与NE重组相比，有丝分裂后的染色体去凝聚延迟了很多[40]。显然，这一新的观察结果表明，需要对这一过程以及染色质和核膜重塑之间的协调调节进行进一步的研究。

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图2

冈田酸触发染色体缩合，但不能完全分解NE。HeLa细胞用二甲基亚砜或500nM冈田酸处理4h，然后固定并染色(A类)Lamin A/C（红色）和mAb44（NPC成分，绿色）或(B类)磷酸-PLK1（T210）（绿色）和拉明A/C（红色）。(A类)在前期，层蛋白A/C和NUP没有完全分解，染色体开始凝聚（顶图），而在中期，层蛋白C/C和NUPs完全分解并分散在细胞质中（中图）。在冈田酸处理后，染色体凝集与前中期一样先进，但Lamin A/C和NUP没有完全分解，仍然存在于染色体周围（底部面板）。(B类)在前期，当层粘连蛋白A/C仍然未被分解时，磷酸化的PLK1（PLK1ph）已经在着丝粒聚集（顶部面板）。在前中期，层蛋白A/C完全分散在细胞质中，PLK1ph定位于着丝粒（中间板）。冈田酸处理后，染色体与前中期相似凝缩，层蛋白A/C没有完全分解，PLK1开始在着丝粒处积累（底图）。

一旦磷酸化，一些NE蛋白就会积聚在有丝分裂细胞的不同区域，如有丝分裂纺锤体或动粒[41,42,43]并在其他有丝分裂事件中发挥作用，如染色体分离[44]。这里我们不讨论NE蛋白在有丝分裂中的作用，但[45,46,47]代表对这个主题的优秀评论。此外，在去甲肾上腺素分解过程中，去甲肾上腺素的膜成分重新收缩到有丝分裂纺锤体周围的内质网中：这不仅允许有丝分裂的纺锤体组装，而且促进了对染色体-微管相互作用至关重要的有丝分裂因子的局部集中[48].

4.核外壳重新组装

在满足纺锤组装检查点（SAC）后，后发复合体（APC）被激活，并触发蛋白酶体降解细胞周期蛋白B。CDK水平下降是有丝分裂退出以及PP1和PP2A重新激活的必要条件之一[49,50]。在此阶段，NE开始围绕分离染色质进行重整。这种改革是以一种循序渐进的方式进行的，即Nups的最初招募之后是Lamina的组装[51]。磷脂酶在这一过程中的作用得到了一些生物体的许多研究的支持。

5.潜在疾病

许多疾病，从癌症到早衰综合征，至少部分以NE畸形为特征。

有丝分裂的错误执行导致无法产生健康的细胞。在存在主要缺陷的情况下，细胞通常会通过凋亡而被消除，但小缺陷也可能极其有害。一个例子是染色体分离中的错误。Merotelic（动粒微管）附着是人类细胞非整倍体的主要来源[82]; 这些染色体将位于后期纺锤体的中间，并最终并入两个子细胞之一，从而形成非整倍体细胞。尽管拷贝数的增加/减少可能已经代表了一种有害的情况，但主要缺陷实际上与NE改革的动态有关。如前所述，NPC和核膜有序地聚集到分离染色质的表面。一般来说，NPC成分首先在染色质的极性区域组装，然后在纺锤体的中央侧组装。最近的研究表明，位于中央纺锤体内的染色质在几个鼻咽癌成分的组装中失败，但它能够吸收层[26,53,83]。NE重组中的这种损伤将产生染色质，染色质被层包围，但缺少NPC，并与细胞的主核分离。这些结构被称为微核（MN），通常存在于癌细胞中[84]。最近的几项研究充分证明了MN的形成对细胞的负面影响及其对基因组不稳定性的贡献，这些研究表明，这些结构携带未复制的DNA和DNA损伤（NPC的缺乏导致无法维持核-细胞质转运），从而触发色氨酸，癌症进化基础上的染色体破碎现象[83,84,85,86,87].

完整的分子机制仍需澄清，但提出了两个主要假设。一种是基于中心纺锤体是极光B激酶和PLK1的高活性区域这一事实。极光B的抑制[26,53]和PLK1[16]可以触发全国人大的早期集会。众所周知(图1)一些Nup被PLK1磷酸化，它们的去磷酸化对NPC的重新组装至关重要，染色质中部活性激酶的存在可能会对NPC重新组装产生负调控。

相反，另一种假说认为纺锤形微管抑制这些包膜蛋白的正常募集，而不依赖于极光B[83]，但实际机制尚不清楚。

一个一致的观察结果是，核糖核酸不装载在纺锤体中央的染色质上，核糖核苷酸必须进行去磷酸化才能促进其重新组装[42,88,89]。在这方面，我们不能排除关键机制在于一些未知蛋白磷酸酶的空间激活。关键磷酸酶可能通过激酶（可能是PLK1）在纺锤体附近保持非活性，从而防止关键Nup的局部去磷酸化。在这方面，它可以概括出有丝分裂早期动粒的情况，在动粒中需要实现激酶和磷酸酶活性之间的平衡，以推进这一过程。

相对于与层粘连相关的疾病，Hutchinson-Gilford早衰综合征（“HGPS”或“早衰症”）是一种在许多关键方面与正常衰老相似的早衰疾病，是研究最多的疾病之一[90,91]。孕激素是一种C末端突变，缺乏拉明a的50个氨基酸，因此保留了正常拉明a中被裂解的法尼基，是大多数病例中的致病缺陷。最近的研究表明，完整的前体蛋白对动态机械敏感性磷酸化和降解反应较小。层蛋白A磷酸化（S22）是一种主要的有丝分裂磷酸化位点，它与层蛋白A迁移率的增加和显著软化细胞核的产生有关[92].

拉明A S22也被证明是CDK5的靶点。在神经元细胞和初级皮层神经元中，CDK5通过直接磷酸化层粘连蛋白A和层粘连膜B1诱导核层粘连扩散。层粘连蛋白的磷酸化抗性突变体在神经毒性刺激下对核扩散和细胞死亡产生抵抗，表明这是早期病理事件，也是神经元死亡的主要机制[93]。在这方面，磷酸酶的表达水平也可能在这些疾病的病因中起主要作用。

有趣的是，一名扩张型心肌病患者报告了一例杂合Lamin a S22L突变，但没有分子数据可用[94]。评估这种有丝分裂磷酸酶是如何参与发病机制的，以及由于突变会产生一种非磷酸化突变，因此哪种磷酸酶可能与心肌病有关，这将是一件有趣的事情。

6.结论与未来展望

我们最近见证了蛋白质磷酸酶在许多不同领域的复兴，包括细胞周期的研究。这些关键的相变和细胞的选择最终取决于激酶活性与其反作用磷酸酶之间的平衡。有丝分裂进入、SAC的建立和移除以及有丝分裂退出的执行都提供了很好的例子。对于检查点调节，已经获得了大量的分子细节[39]但对于有丝分裂的退出，道路仍然相当崎岖，主要是由于需要新的工具来研究特异性磷酸酶在这个快速而动态的阶段中的作用。然而，快速蛋白质降解系统、光遗传学工具和单细胞分析的可用性将为开展更多研究提供合适的平台，这些研究将导致底物的识别、它们的顺序去磷酸化和不同磷酸酶特异性的知识获取。

致谢

作者贡献

所有作者都参与了这篇评论的撰写。中的实验图2由P.V.和F.H.设计和解释，由F.H.执行。

基金

本研究由威康信托基金会（The Wellcome Trust）资助，该基金会授予PV科学基金210742/Z/18/Z。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

参考文献