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.2010年5月28日；285(22):16978-90.

doi:10.1074/jbc。M109.096552。 Epub 2010年4月1日。

CDK1-环素B在G2/M过渡期的及时组装需要Cdc25磷酸酶

奥列格·蒂莫菲耶夫¹, Onur Cizmecioglu公司, 弗洛里安·塞特勒, 托尔·坎普夫, 英格丽德·霍夫曼

附属公司

PMID： 20360007
预防性维修识别码：项目经理2878026
内政部： 10.1074/jbc。M109.096552

CDK1-环素B在G2/M过渡期的及时组装需要Cdc25磷酸酶

奥列格·蒂莫菲耶夫等。生物化学杂志. 2010.

.2010年5月28日；285(22):16978-90.

doi:10.1074/jbc。M109.096552。 Epub 2010年4月1日。

作者

奥列格·蒂莫菲耶夫¹, Onur Cizmecioglu公司, 弗洛里安·塞特勒, 托尔·坎普夫, 英格丽德·霍夫曼

附属

¹细胞周期控制和致癌，德国癌症研究中心，F045，Im Neuenheimer Feld 242，D-69120 Heidelberg，Germany。

PMID： 20360007
预防性维修识别码：项目经理2878026
内政部： 10.1074/jbc。M109.096552

摘要

有丝分裂的进行需要Cdk1激酶活性的协调调节。Cdk1的激活是一个多步骤过程，包括Cdk1-cyclin B的结合、cyclin-kinase复合物向细胞核的重新定位、Cdk-activating kinase（CAK；后生动物中的Cdk7）激活Thr（161）上的Cdk1磷酸化，以及去除抑制性Thr（14）和Tyr（15）磷酸化。这种去磷酸化是由双重特异性Cdc25磷酸酶催化的，这种磷酸酶存在于哺乳动物细胞的三种亚型，即Cdc25A、-B和-C中。我们发现Cdc25A的表达导致加速G（2）/M相变。在Cdc25A-过表达细胞中，尽管Cdk1在Tyr上被磷酸化，但它仍表现出高激酶活性（15）。此外，与对照细胞相比，Tyr（15）磷酸化的Cdk1在Cdc25A过度表达细胞中结合更多的细胞周期蛋白B。与此一致，我们证明在人类转化细胞中，Cdc25A和Cdc25B，而不是Cdc25C磷酸酶对细胞周期蛋白激酶复合物形成的时间和效率有影响。Cdc25A或Cdc25B的过度表达促进了Cdk1-cyclin B复合物的早期组装和激活，而短发夹RNA对这些磷酸酶的抑制具有相反的效果，导致G（2）中cyclin B-bound Cdk1的数量和有丝分裂显著减少。重要的是，我们发现Cdc25A过度表达导致Cdk7活化，Cdk1的Thr（161）磷酸化增加。总之，我们的数据表明，Cdk1在G（2）/M的复杂组装和去磷酸化是紧密耦合的，并受Cdc25磷酸酶的调控。

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数字

图1。 — 图1。
Cdc25A过度表达导致G缩短₂期和早期有丝分裂开始。 A类，具有稳定诱导表达Cdc25A的U2OS细胞在G₁/S使用双胸苷块，然后按照“实验程序”所述释放。用BrdUrd脉冲标记后，收集、固定细胞，并用抗BrdUrd抗体和PI染色。这个顶部面板显示非诱导的基于DNA内容的细胞周期曲线(+泰特;左边)和诱导（−泰特;正确的)单元格。这个左下面板证明释放后8小时，非诱导细胞和诱导细胞中BrdUrd阳性群体之间没有显著差异；这个中下桌显示释放后4至8小时内连续时间点的量化数据；WB在右下面板说明了非诱导和诱导状态下Cdc25A蛋白的水平。显示了三个实验之一的代表性结果。B类，同步化U2OS细胞细胞周期进程中四个独立的FACS辅助DNA含量测量的量化。使用配对t吨测试，第页对于指示的95%置信区间在上面这个图注意，完成DNA复制的细胞积累速度没有显著差异(4牛).C类在释放后的不同时间间隔收集U2OS Cdc25A细胞，固定，并用抗磷酸化-Ser染色¹⁰组蛋白H3抗体和碘化丙啶。显示了三个独立的FACS辅助测量系列的定量（选择了一个代表性时间点，即11 h）(第3页)-阳性细胞(左上面板)和2n个下一个G中的单元格₁相位(右上面板). 这个下部面板代表pH3阳性人群的体积(左边)和DNA图谱(正确的)非感应式(+泰特)和诱导（−泰特)细胞释放后11小时。D类，U2OS Cdc25A细胞从双胸苷块中释放出来，并使用微分干涉对比显微镜进行监测。细胞特征性圆整的开始被认为是有丝分裂的开始，因为在那之后很快就观察到DNA凝结。顶部，显示了一个代表性的非诱导和诱导细胞的静态照片。这个数字以分钟为单位表示发布后的时间(比例尺，10μm）。底部每个细胞从释放到前期的持续时间分为六个区间。显示了每个间隔的前期细胞百分比（非诱导，n个= 51; 诱导，n个= 46).pSer10型，序列号（P）¹⁰.E类，U2OS Cdc25A细胞从双胸苷块中释放出来，并使用微分干涉对比显微镜进行监测。如文中所述，测量51个诱导细胞和46个非诱导细胞的有丝分裂持续时间。使用配对分析结果t吨-测试；第页95%置信区间显示在图.

图2。 — 图2。
在Cdc25A过度表达细胞中，细胞周期蛋白B结合的Cdk1激酶的主要池在Tyr上磷酸化¹⁵在G₂/米。 A类如图2所示同步U2OS Cdc25A细胞，并在指定的时间点采集WB样品，并用相应的抗体进行检测。注意Tyr（P）的增加¹⁵(pTyr15)诱导细胞中的条带强度。B类，Cdk1从释放后10 h收集的U2OS Cdc25A细胞裂解液中免疫沉淀。蛋白质在二维PAGE上进行解析，并使用抗Cdk1和抗Tyr（P）进行分析¹⁵抗体。星号对应于双磷酸化Thr（P）¹⁴/泰尔（P）¹⁵（**）和单磷酸化Tyr（P）¹⁵Cdk1（*）。这个箭头在Thr上标记Cdk1的磷酸化¹⁶¹(pThr161型).C类，使用抗细胞周期蛋白B抗体共同免疫沉淀细胞周期蛋白B-结合的Cdk1，蛋白质复合物按A类使用指示的抗体。D类，与B类和C类用SDS-PAGE进行解析，并用WB和相应抗体进行分析。E类用免疫印迹法分析未诱导和诱导U2OS Cdc25A细胞的抗洗涤剂组分的核提取物和裂解物。该图表示释放后10小时收集的细胞制备的裂解物的WB。F类，与E类使用抗Wee1抗体或兔IgG作为对照进行IP。在与蛋白A-琼脂糖微球（Amersham Biosciences）结合后，分离免疫沉淀物进行激酶分析(顶部)和WB(底部). 这个中间面板显示底物的等负荷（催化失活纯化GST-Cdk2 K33T/K34S）。国际能源论坛，等电聚焦。PARP项目，聚ADP-核糖聚合酶。

图3。 — 图3。
部分脱磷的Tyr（P）¹⁵Cdk1具有催化活性。 A类，Cdk1从释放后10 h收集的500μg U2OS Cdc25A细胞裂解液中免疫沉淀。样品被分割并用于免疫印迹(正确的)或激酶分析(左边). 注意Tyr的高水平¹⁵(pTyr15)诱导细胞中的磷酸化和Cdk1激酶活性。B类，与中的裂解物相同A类用于IP和抗-Tyr（P）¹⁵或抗Cdk1抗体，然后分裂以进行后续H1激酶分析和WB(克).C类，非诱导和诱导U2OS细胞中Cdk1相对激酶活性的定量。使用抗Cdk1或抗Tyr（P）免疫沉淀激酶¹⁵抗体。非诱导细胞的活性被认为是1；n个= 3.误差线、S.D。D类、裂解物和Cdk1免疫沉淀物，如A类用抗-Tyr（P）免疫印迹¹⁵抗体。E类，通过两轮免疫沉淀，上述相同的裂解物耗尽Cdk2激酶，并且通过免疫印迹控制耗尽效率(正确的). 耗尽后，IP与抗-Tyr（P）¹⁵进行抗体检测，并在H1激酶试验中评估免疫沉淀物的激酶活性(左边).F类，293T细胞与pCDNA3.1（+）-FLAG-Cdk1 WT或指示突变体和pCDNA3.1-（+）-HA-cyclin B1共同转染；使用空载体pCDNA3.1（+）平衡DNA数量。转染后24小时，细胞被裂解，使用抗FLAG M2抗体进行免疫沉淀，并用于H1激酶分析。克，使用抗-Tyr（P）获得的免疫沉淀物¹⁵(B类)在WB中用所指示的抗体进行探测。注意与Tyr（P）共免疫沉淀的细胞周期蛋白B数量显著增加¹⁵来自诱导细胞的Cdk1。

图4。 — 图4。
过度表达Cdc25A或Cdc25B而非Cdc25C可诱导早期Cdk1-cyclin B复合物的组装和激活。 A类用500μg同步化U2OS Cdc25A细胞裂解液中抗细胞周期素B抗体获得的免疫沉淀用于WB。这个右侧面板显示了用于IP的50μg裂解液中的蛋白质水平，由WB用所示抗体检测。B类，用免疫沉淀法进行激酶分析，免疫沉淀法使用抗细胞周期蛋白B或抗Cdk1抗体从与交流和D类，类似于A类和B类，但使用了表达Cdc25B的同步诱导U2OS细胞的裂解物。E类和F类，类似于A类和B类，但使用了表达Cdc25C的同步诱导U2OS细胞的裂解物。

图5。 — 图5。
Cdc25A的过度表达与Thr上APC3的早期磷酸化相关²⁴⁴. A类，U2OS Cdc25A细胞从双胸苷阻断中释放(左边)在指定的时间点（小时）采集WB样本，并用相应的抗体进行检测。注意APC3-Thr（P）的早期外观²⁴⁴诱导细胞中的信号。B类、诱导和非诱导U2OS Cdc25A细胞从双胸苷块释放后9小时固定在盖玻片上(左边). 细胞用抗细胞周期素B染色(绿色)和抗APC3-Thr（P）²⁴⁴(红色)抗体。DNA用Hoechst染色(蓝色).比例尺，10微米。这个箭头指示Thr（P）²⁴⁴装饰中心体的信号。赖特、中心体Thr阳性细胞百分比（P）²⁴⁴Cdc25A诱导和非诱导细胞的信号。误差线S.D.在三个独立实验中(n个= 200).

图6。 — 图6。
shRNA抑制Cdc25A或Cdc25B可损伤Cdk1-cyclin B复合物组装。 A类，HeLa细胞被质粒转染，编码靶向Cdc25A或萤火虫荧光素酶的shRNA作为对照，转染后24 h，通过双胸苷块进行同步化。释放后，以不同的时间间隔收集细胞，用于FACS，以确认细胞周期的同步和跟踪阶段（未显示），并用于制备裂解物。左侧，使用所示抗体从500μg裂解液中免疫沉淀细胞周期蛋白B，在SDS-PAGE上解析蛋白质并进行WB分析。使用ImageJ软件测量Cdk1条带的密度，并将其相对强度计算为释放（有丝分裂）后9小时Cdk1条带密度的比值，考虑为1。显示结果在下面Cdk1斑点。赖特，50μg用于IP的裂解物，由WB进行分析，以监测Cdc25A的阻遏作用和负载的均匀性。B类，类似于A类，但使用表达抗Cdc25B磷酸酶shRNA的质粒。C类，类似于A类和B类，但Cdc25A和Cdc25B均使用相应的shRNA-表达结构被抑制。D类，在三个独立的实验中，使用时间点9h的相对密度测量数据进行统计分析。误差线、S.D。

图7。 — 图7。
Cdc25A的过度表达与Cdk7电泳迁移率的增加相关。 A类从双胸腺嘧啶核苷块释放后10 h收集的U2OS Cdc25A同步化细胞的裂解物用所示抗体进行免疫印迹分析。注意Thr（P）的偏移¹⁶¹(pThr161型)诱导细胞中的条带，对应于Tyr¹⁵/瑟¹⁶¹-磷酸化Cdk1与Thr（P）的比较¹⁴/泰尔（P）¹⁵/苏尔（P）¹⁶¹在非诱导细胞中磷酸化，Thr略有增加¹⁶¹Cdc25A过度表达后的磷酸化。B类、诱导和非诱导U2OS Cdc25A细胞从双胸苷块释放后9小时固定在盖玻片上(左边). 细胞用抗细胞周期蛋白B染色(绿色)和抗Cdk1-Thr（P）¹⁶¹(红色)抗体。DNA用Hoechst染色(蓝色).比例尺，10微米。上正确的，抗Thr（P）的相对信号强度¹⁶¹对～50个细胞进行染色。误差线S.D.在三个独立实验中。C类，核能(左边)和耐洗涤剂部分(正确的)来自与中同步的单元格A类使用SDS-PAGE对U2OS Cdc25A细胞的提取物进行分离，并用指示的抗体进行探测。注意，在从诱导细胞获得的耐洗涤剂组分中，迁移速度更快的Cdk7带比从非诱导细胞中获得的更丰富。磷-苏氨酸¹⁶¹Cdk1型(上部频带)当Cdc25A过度表达时，这些提取物中的含量也会增加。这个下部频带单位：Thr（P）¹⁶¹免疫印迹对应于Thr（P）¹⁶⁰Cdk2，也被所用抗体识别。D类，Cdk7从500μg的裂解物中免疫沉淀，如A类分离IP进行免疫印迹(底部)以及使用催化活性的GST-Cdk1（GST-Cd k1-KD）作为底物进行激酶分析(顶部). 作为对照，使用小鼠IgG。

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