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分子生物学细胞。2004年11月；15(11): 5001–5011.
数字对象标识：10.1091/桶。E04-04-0294号
预防性维修识别码：项目编号：524759
PMID：15356267

哺乳动物线粒体分裂和融合介体Fis1、Drp1和Opa1在细胞凋亡中的作用

李扬嘉,*† Seon Yong Jeong先生,*† 马吕斯·卡博夫斯基,* 卡罗琳·史密斯,‡和理查德·尤尔*§
Keith Yamamoto，监控编辑器
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

在细胞凋亡过程中，线粒体网络断裂。利用短发夹RNA进行RNA干扰，我们操纵了哺乳动物细胞中参与线粒体分裂和融合的蛋白质hFis1、Drp1和Opa1的表达水平，并表征了它们在线粒体形态和凋亡中的功能。hFis1的下调在很大程度上抑制了细胞死亡，其抑制程度远远大于Drp1的下调，并且处于不同于Drp1抑制诱导的凋亡阶段。缺乏Opa1的细胞对外源性凋亡诱导极为敏感，一些细胞通过需要hFis1表达的过程自发死亡。野生型Opa1可能作为一种抗凋亡蛋白正常发挥作用，抑制自发凋亡。然而，如果hFis1下调，则细胞不需要Opa1来阻止凋亡，这表明Opa1可能在正常情况下抵消hFis1的促凋亡作用。在本研究中，我们还证明线粒体断裂本身不会导致细胞凋亡。然而，我们提供了进一步的证据，表明线粒体形态发生机制的多种成分可以正向和负向调节细胞凋亡。

简介

线粒体是形态上动态的细胞器，不断分裂和融合，在细胞内形成小的个体单位或互联网络(Bereiter-Hahn，1990年). 它们通过调节细胞器融合和分裂的相对速率，在健康细胞中达到这两种状态之间的平衡(努纳里等., 1997). 控制线粒体分裂的蛋白质包括Drp1(DNM1（DNM1）在酵母中）(Otsuga公司等., 1998;布莱扎德等., 1999)，图1(Mozdy公司等., 2000;雅各布斯等., 2003)，以及酵母中多达六种其他基因产物(调光器等., 2002). Drp1是一种类似于dynamin的大型GTPase，dynamin是一种围绕内吞小泡颈部旋转并促进其从质膜上断裂的蛋白质(欣肖，2000). 用GTP结合缺陷的显性负蛋白抑制Drp1 GTPase活性（Drp1K38A型)导致线粒体拉长，证实哺乳动物细胞（Smirnova等.,1998,2001;弗兰克等., 2001)Drp1的功能与其酵母同源物相似DNM1（DNM1）线粒体分裂(Otsuga公司等1998年;布莱扎德等., 1999). Drp1主要存在于细胞质中，但部分与线粒体外表面的病灶结合，线粒体在细胞器分裂部位结合(斯米尔诺娃等., 2001). 人类Fis1（hFis1）包含一个四三肽重复序列（TPR）基序域(铃木等., 2003;多姆等., 2004)面向细胞质，通过C末端疏水性尾锚定在线粒体外膜(Yoon公司等., 2003). hFis1限制线粒体的外表面，并不是专门定位于线粒体断裂位点(铃木等., 2003;Yoon公司等., 2003). RNA干扰下调哺乳动物Fis1表达诱导线粒体伸长(斯托扬诺夫斯基等., 2004)，证实了之前在酵母中报告的结果FIS1系统参与线粒体分裂(Mozdy公司等., 2000;雅各布斯等., 2003).

哺乳动物细胞中的线粒体融合由大GTPases Mfn1控制(桑特尔和富勒，2001年;石原等., 2003)，Mfn2(桑特尔和富勒，2001年;石原等., 2003)、和Opa1(MGM1型在酵母中）(奥利康等., 2002;佐藤等., 2003). 消除任何这些蛋白质都会导致线粒体断裂(陈等., 2003;奥利康等., 2003;格里帕里克等., 2004). 发现Opa1基因突变导致显性视神经萎缩(亚历山大等., 2000;德莱特等., 2000)可能将这个过程（线粒体融合抑制）与人类疾病联系起来。

在细胞凋亡过程中，线粒体网络断裂，导致线粒体更小、数量更多(曼奇尼等., 1997;De Vos公司等., 1998;庄等., 1998;德萨热等1999年;弗兰克等., 2001;卡博夫斯基等., 2002). 据报道，在caspase激活上游的凋亡阶段和接近Bax向线粒体和细胞色素移位的凋亡阶段，裂变增加、融合减少或两者都会导致线粒体表型c（c）释放(卡博夫斯基等., 2004)这表明线粒体形态与细胞凋亡之间存在机制联系。在细胞凋亡过程中，与线粒体结合的Drp1增加(弗兰克等., 2001;布雷肯里奇等., 2003)线粒体断裂部位的Drp1病灶与凋亡期间发生在线粒体上的Bax病灶共定位(卡博夫斯基等铝2002年). 用显性负蛋白（Drp1）抑制Drp1 GTPase活性K38A型)防止凋亡过程中出现的线粒体断裂并延缓细胞死亡过程(弗兰克等., 2001;卡博夫斯基等., 2002)这表明线粒体分裂是细胞凋亡的必要步骤。据报道，hFis1的过度表达可诱导细胞凋亡(詹姆斯等., 2003)也表明线粒体分裂参与了细胞凋亡。RNAi下调细胞中Opa1的表达导致细胞自发凋亡(奥利康等., 2003)表明野生型Opa1水平促进线粒体融合通常可以保护细胞免受凋亡。

为了进一步研究线粒体分裂和凋亡之间的联系，我们探讨了hFis1在这些过程中的作用。使用短发夹RNA（shRNAs）进行RNAi(帕迪森等., 2002)，我们下调了与线粒体形态有关的三种蛋白质：Drp1、hFis1和Opa1。利用这项技术，我们能够控制蛋白质的表达水平，并表征其在线粒体形态和凋亡中的功能。hFis1的下调通过多种途径有效地抑制细胞死亡，其程度远远大于Drp1的下调，并且处于不同于Drp1抑制诱导的凋亡阶段。缺乏Opa1的细胞对外源性凋亡诱导极为敏感，并通过需要hFis1表达的过程自发死亡。因此，构成线粒体形态发生机制的多种蛋白质可以积极和消极地调节细胞凋亡。

材料和方法

细胞培养、转染、DNA构建和RNAi

HeLa细胞（弗吉尼亚州马纳萨斯美国型培养物收集中心）在添加10%热灭活胎牛血清、100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的完整DMEM中培养237°C时。根据制造商的说明，使用FuGENE 6（印第安纳波利斯罗氏诊断公司）转染HeLa细胞。hFis1的cDNA（GenBank登录号：。AF151893型)以人总RNA为模板，通过反转录-聚合酶链反应克隆得到。将野生型hFis1（hFis1wt）和缺乏C末端30个残基的hFis1-（hFis1ΔC）cDNA克隆到哺乳动物表达载体pcDNA3.1和pREP4中。使用sh-激活的基因沉默系统进行RNAi(帕迪森等., 2002). 通过合成两个带有目标序列的cDNA寡核苷酸构建表达shRNAs的质粒，后面的III连接子和U6终止子，退火并连接到BseRI和巴姆pSHAG-1的HI站点（纽约州冷泉市冷泉港实验室）。为了通过shRNA长期（稳定）抑制基因表达，pSHAG-1中编码U6启动子和shRNA的区域被亚克隆到不是我和巴姆pREP4的HI位点（Invitrogen，Carlsbad，CA）。hFis1、Opa1和Drp1的靶序列如下：hFis15′-GAGACGCAGGCACGAGAACGCTCC-3′，Opa1 5′-GATGAGAGTTAGTCAGTCTA-3′，Drp1 5′-TTCAATCGTGAGTATGCTTCTTC-3′。对照shRNA的序列为5′-TCGTACCATAATCAGCTCTGCATACATC-3′，靶向Opa1 3′端非编码区，对Opa1基因表达的沉默无影响。在用这些pREP4构建物转染后的一天，HeLa细胞在含有300μg/ml潮霉素B的DMEM中生长2 d，然后在含有50μg/ml湿霉素B的DMEM中生长3-4 d，以选择转染剂。

免疫细胞化学和共焦显微镜

按照指示处理在双腔玻片中生长的细胞，用4%多聚甲醛固定10分钟，用0.2%Triton X-100渗透15分钟，然后在室温下用2%牛血清白蛋白封闭1小时。用兔多克隆抗Bax抗体（1:800；Upstate Biotechnology，Lake Placid，NY）、小鼠单克隆抗细胞色素检测细胞c（c）（1:800；BD Biosciences PharMinen）或鼠抗DLP1/Drp1单克隆抗体（1:100；BD Transduction Laboratories，Lexington，KY）在4°C下过夜，然后用山羊抗兔Alexa Fluor 594（1:600；分子探针，Eugene，or）或山羊抗鼠Alexa Fluor 488抗体（1:600，分子探针）在RT下染色2小时。清洗后，细胞用慢褪色光防褪色试剂（分子探针）固定，并用共焦显微镜进行分析。为了观察活细胞中的线粒体，添加50 nM Mitotracker CMXRos（分子探针），并在共焦显微镜前培养30分钟。为了分析线粒体膜电位，将细胞与5μg/ml JC1（分子探针）在培养基中孵育20分钟，并通过共聚焦显微镜进行观察。使用LSM 510蔡司共焦显微镜拍摄图像。如前所述，进行基于Matrix靶向光活化绿色荧光蛋白（mito-PAGFP）的线粒体融合分析(卡博夫斯基等., 2004)

亚细胞分离和免疫印迹

用洋地黄素（300μg/ml）在细胞溶质提取缓冲液（250 mM蔗糖、70 mM KCl、137 mM NaCl、4.3 mM Na）中渗透细胞2高功率放大器4，1.4 mM千赫2人事军官4，pH 7.2，100μM苯甲基磺酰氟[PMSF]，10μg/ml亮氨酸肽，2μg/ml抑肽酶）在冰上放置5分钟。台盼蓝染色证实细胞质膜通透性。以1000×克在4°C下保持5分钟。保存上清液（细胞溶质部分；S），并将颗粒溶解在相同体积的线粒体裂解缓冲液中（50 mM Tris-Cl，pH 7.4，150 mM NaCl，2 mM EDTA，2 mM-EGTA，0.2%Triton X-100，0.3%NP-40，100μM PMSF，10μg/ml亮氨酸肽，2μg/ml抑肽酶），然后在10000×克在4°C下保持10分钟，并将上清液用作重膜（HM）级分。通过将整个细胞溶解在Laemmli样品缓冲液中并煮沸10分钟来制备总细胞裂解物。取每个样品的等分样品，通过BCA蛋白质分析试剂盒（皮尔斯化学公司，伊利诺伊州罗克福德）测定蛋白质浓度。在4–12%聚丙烯酰胺梯度凝胶（Invitrogen）上运行等量的样品，转移到聚偏二氟乙烯膜（Immobilon-P；Millipore，Billerica，MA）上，并进行免疫印迹。主要抗体、稀释液及其来源如下：抗Fis1（1:500；Axxora，San Diego，CA）、抗Opa1(朱等., 2003)、抗DLP1/Drp1（1:1000；BD Transduction Laboratories）、抗Bax（1:1000，Santa Cruz Biotechnology）、抗细胞色素c（c）（1:1000；BD Biosciences PharMinen）、抗PARP（1:1000）、宾夕法尼亚州普利茅斯会议BIOMOL研究实验室和抗肌动蛋白（1:1000，密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）。使用辣根过氧化物酶结合二级抗体（1:10000）。ECL Plus（Amersham Biosciences，Piscataway，NJ）检测到斑点。

凋亡细胞死亡的评估

通过核形态学。培养箱载玻片中生长的细胞按照文本或图例中所述进行处理。细胞核用Hoechst 33342（分子探针）染色（1μg/ml；RT时15分钟），并在荧光显微镜下观察（用于紫外线激发），在几个领域中细胞被评分为正常或凋亡细胞核。每个处理中总共至少有200个细胞被计数，并显示为计数的总细胞中有凋亡细胞核的细胞的百分比。

通过DNA阶梯形成。在10cm培养皿中生长的细胞如上所述进行处理，收获，并用磷酸盐缓冲盐水洗涤一次，然后如前所述分离总DNA(Lee和Shactor，1997年). 用蛋白酶K和核糖核酸酶A消化后，在2%琼脂糖凝胶中分离DNA，并用溴化乙锭在紫外光下进行可视化。

通过聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）裂解/Caspase-3激活。PARP是一种众所周知的caspase-3底物。在细胞凋亡过程中，caspase-3被激活，因此PARP裂解可以作为细胞凋亡的标志。在10厘米培养皿中生长的细胞按照上述方法处理并收获，并制备总细胞提取物。在4–12%丙烯酰胺凝胶中分离等量的蛋白质，并用抗PARP抗体进行免疫印迹。

结果

hFis1或Drp1表达下调诱导线粒体融合

酵母的线粒体分裂至少需要7到8种蛋白质(调光器等2002年)，包括Dnm1p(Otsuga公司等., 1998;布莱扎德等., 1999)和Fis1p(Mozdy公司等., 2000;雅各布斯等., 2003). 这些基因的缺失或突变破坏了线粒体的正常分裂，导致线粒体膜形成网状结构(调光器等., 2002). 为了探讨人类同源基因Dnm1p和Fis1p、Drp1和hFis1在线粒体分裂和凋亡中的作用，我们使用短发夹激活的基因沉默系统（即SHAGG；冷泉港实验室）“敲除”了它们的表达(帕迪森等., 2002). 为了产生稳定抑制内源性基因的细胞系，我们将U6 shRNA插入物转移到pREP4中，pREP4是一种以潮霉素为选择性标记的外膜维持哺乳动物表达载体。

在为hFis1 shRNA设计的12种不同的寡核苷酸中，只有一种与编码序列3′端外的序列相对应，显著抑制了HeLa细胞中hFis1的表达。选择转染HeLa细胞，hFis1几乎完全耗尽，需要在潮霉素存在下生长约1周(图1A). 其中70%以上的细胞线粒体较长，而其余细胞中的线粒体形状更为正常（短管状）(图1、B和C). 考虑到用于选择的潮霉素倾向于诱导线粒体略短，hFis1 RNAi细胞中的正常线粒体可能已经过核（我们未发表的数据）。用携带对照shRNA的质粒转染的大多数细胞具有正常的相对较短的管状线粒体和一些碎片，但从未像hFis1 shRNA转染剂中那样拉长线粒体(图1、B和C).

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敲低hFis1或Drp1表达可诱导线粒体融合。用含有hFis1、Drp1或对照靶序列shRNA的pREP4构建物转染HeLa细胞，并通过在含有潮霉素B的培养基中生长来选择转染体，Western blotting分析hFis1和Drp1的表达水平。还对肌动蛋白水平进行了负荷控制分析。（B） 用Mitotracker Red CMXRos观察对照RNA干扰细胞、hFis1 RNA干扰细胞或Drp1 RNA干扰细胞的线粒体，并用共焦显微镜进行分析。线粒体的详细结构如图所示。箭头所示为Drp1 RNAi细胞中典型的气球状结构。（C） 对照RNAi、hFis1 RNAi或Drp1 RNAi培养物中线粒体碎片（点）、正常（固体）或细长（条纹）的细胞群体百分比。在每个实验中，对几个领域中的至少200个细胞进行计数。数据表示至少三个独立实验的平均值±标准差。

与hFis1不同，靶向Drp1的六个序列中有四个可以沉默Drp1基因的表达，其中一个之前报道在哺乳动物系统中有效(科赫等., 2003). 关于Drp1耗尽(图1A)近80%的细胞有拉长（融合）的线粒体(图1、B和C). 尽管hFis1 RNAi细胞和Drp1 RNAi电池中的线粒体都被广泛拉长，但线粒体的形状并不相同。在Drp1 RNAi细胞线粒体的小管底部可看到许多球状或球状结构，但hFis1 RNAi电池中未见(图1B，箭头）。有趣的是域名管理1Δ和金融服务1酵母中观察到Δ细胞；两者都表现出网状结构(Mozdy公司等., 2000). 然而，哺乳动物线粒体的尺寸越大，形态的可视化效果越好。据报道，哺乳动物线粒体在过度表达显性负性抑制剂Drp1的细胞中显示线粒体末端扩张K38A型(斯米尔诺娃等., 2001).

hFis1基因敲除不影响Drp1在线粒体中的分布

众所周知，Drp1不仅主要分布于胞浆中，而且在代表未来裂变位点的线粒体外膜的病灶处聚集(拉布鲁斯等., 1999;斯米尔诺娃等., 2001). 由于Drp1缺乏线粒体靶向序列，因此可能需要一些蛋白质来将Drp1招募到线粒体。人类Fis1是这种招募的良好候选者，因为在酵母中，Fis1p是在线粒体上正确组装和分布含Dnm1p复合物所必需的(Mozdy公司等., 2000;箫等., 2002)hFis1的结构类似于参与线粒体输入的某些蛋白质的结构(铃木等., 2003). 如果是这样，Drp1的线粒体分布应该受到hFis1缺失的影响。然而，通过免疫细胞化学评估，对照RNAi细胞和hFis1 RNAi电池之间的Drp1分布几乎没有差异(图2A)或通过亚细胞分级S和HM（主要是线粒体部分）样品的Western blot分析(图2B). Drp1在hFis1 RNAi细胞中分布于线粒体，其分布程度与对照RNA Ai细胞相似。

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hFis1的敲除并不影响Drp1在线粒体中的分布。（A）在固定前，用Mitotracker CMXRos（红色）孵育对照细胞或hFis1-缺失的HeLa细胞20分钟，然后用小鼠单克隆抗DLP1/Drp1和抗小鼠Alexa Fluor 488抗体（绿色）染色。共聚焦显微镜分析线粒体和Drp1的分布。红色，线粒体；绿色，Drp1。（B） 去除hFis1和对照RNAi的HeLa细胞被分为S和HM（主要是线粒体），并通过Western blotting分析Drp1的分布。分馏质量通过特定亚细胞标记物的分布进行验证：线粒体的CoxIV和细胞质的肌动蛋白。

Fis1的耗竭比Drp1的耗竭对细胞凋亡产生更大的抵抗力

显性阴性突变体Drp1的过度表达K38A型诱导线粒体融合，细胞抗凋亡(弗兰克等., 2001;卡博夫斯基等., 2002;布雷肯里奇等., 2003)这表明线粒体形态与细胞死亡敏感性密切相关。我们研究了hFis1表达下调如何影响各种凋亡诱导剂对细胞死亡的敏感性，并将hFis1RNAi细胞与Drp1RNAi电池进行了比较。我们发现，在产生对照RNAi细胞40-65%凋亡的条件下，<20%的hFis1 RNAi细胞凋亡（通过凋亡细胞核评估）(图3A). 由葡萄孢霉素（STS）、放线菌素D（Act D）或抗Fas诱导的凋亡的hFis1 RNAi细胞的caspase-3活性远低于通过PARP裂解评估的对照RNAi电池(图3B). Drp1沉默对细胞凋亡的抑制作用较小(图3，A和B).

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hFis1缺失比Drp1缺失对细胞凋亡产生更大的抵抗力。（A） 用STS（1μM；6 h）、Act D（10μM；8 h）、足叶乙甙（100μM；30 h）或抗Fas抗体（500 ng/ml，15 h）处理RNAi去除hFis1或Drp1的HeLa细胞以及对照RNAi细胞，并用Hoechst 33342染色细胞核（1μg/ml；RT时15 min）。在荧光显微镜下对这些细胞在几个区域的正常或凋亡细胞核进行计数（用于紫外线激发）。每个处理中总共至少有200个细胞被计数，并显示为计数的总细胞中具有凋亡细胞核的细胞的百分比。数据绘制为至少三个独立实验的平均值±SD。（B） 用STS（1μM；0，3，6 h）、Act D（10μM；0,4，8 h）或抗Fas（500 ng/ml；0，6，15 h）处理去除hFis1，Drp1和对照的HeLa细胞总提取物，分析PARP裂解。该图代表了至少三个独立实验。

为了探讨hFis1 RNAi细胞的细胞死亡抵抗机制，我们检测了细胞凋亡中的两个早期事件：促凋亡蛋白Bax从胞浆向线粒体的移位和细胞色素的释放c（c）从线粒体到细胞质(克鲁克等., 1997;沃尔特等., 1997). 用放线菌素D在zVAD-fmk存在下处理对照RNAi、hFis1 RNAi和Drp1 RNAi细胞8小时，然后使用Bax和细胞色素c（c）免疫细胞化学染色。如所示图4，A和BhFis1 RNAi细胞中的大多数Bax存在于细胞溶质和细胞色素中c（c）与对照RNAi转染的细胞相比，在这些条件下定位于线粒体。有趣的是，在相同条件下，80%以上的Drp1 RNAi细胞Bax转位到线粒体，但在其中一半的细胞中，细胞色素c（c）仍保留在线粒体中(图4，A和B). 通常，在健康细胞中，Bax定位于胞浆和细胞色素中c（c）位于线粒体中（Bax易位阴性和细胞色素c（c）释放阴性），凋亡后Bax转位到线粒体和细胞色素c（c）释放到胞浆中（Bax易位阳性和细胞色素c（c）释放正极）。然而，我们观察到一个不寻常的Bax易位阳性和细胞色素群体c（c）Drp1缺失细胞凋亡过程中的释放阴性细胞(图4C)表明Drp1在Bax易位后起作用，抑制细胞色素c（c）释放。免疫细胞化学结果通过亚细胞分离S和HM样品的Western blot分析得到证实(图4D). 在对照RNAi细胞中，大多数细胞溶质Bax消失（转移到线粒体），一半以上的细胞色素消失c（c）放线菌素D处理后，线粒体中的细胞释放到胞浆中。相比之下，Bax或细胞色素几乎没有差异c（c）在hFis1 RNAi细胞中有无凋亡诱导的分布。因此，hFis1的缺失阻断了Bax易位上游的凋亡。然而，在Drp1 RNAi细胞中，细胞溶质Bax几乎完全消失，但细胞色素c（c）线粒体的释放明显低于对照细胞，表明Drp1 RNAi对细胞凋亡的保护作用位于Bax易位的下游和细胞色素的上游c（c）释放。这些结果证实了免疫细胞化学的结果，并表明hFis1和Drp1在不同的步骤促进细胞凋亡。

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Bax易位和细胞色素c（c）放线菌素D诱导的释放在缺乏hFis1的HeLa细胞中受到抑制，而细胞色素c（c）在Drp1缺失的细胞中，释放被抑制，而不是Bax移位。（A） 用Act D（10μM；8 h）在zVAD-fmk（50μM）存在下处理RNAi去除hFis1或Drp1的HeLa细胞和对照RNAi细胞，固定并用抗Bax（兔多克隆，红色）和抗细胞色素双重染色c（c）（小鼠单克隆，绿色）抗体。（B） 显示Bax易位或细胞色素的细胞数量c（c）将释放量作为每个RNAi细胞群中计数的细胞总数的百分比进行计数和绘制，这些细胞群经过Act D处理并用抗Bax和抗细胞色素染色c（c）（与A所示样品相同）。在几个领域中总共统计了至少200个细胞。数据绘制为至少三个独立实验的平均值±SD。（C） 一组独特的细胞（Bax有易位，但有细胞色素c（c）未释放）。在用Act D处理过的每个RNAi细胞群中，对四组细胞进行计数（与A中的样品相同）：i）Bax未移位，细胞色素c（c）未发布；ii）Bax易位，但细胞色素c（c）未发布；iii）Bax不是易位的，而是细胞色素c（c）发布；和iv）Bax易位和细胞色素c（c）以每个RNAi细胞群中计数的总细胞的百分比绘制释放的。没有分类为iii的细胞，因此只绘制了i、ii和iv。条形图标记为实心或条状，如B所示。数据绘制为至少三个独立实验的平均值±SD。（D） 去除Drp1或hFis1的HeLa细胞与对照RNAi一起在有或无Act D（10μM）的情况下孵育8 h，分离成S和HM（主要是线粒体），并分析Bax和细胞色素的分布c（c）通过Western blotting。分馏质量通过特定亚细胞标记物的分布进行验证：线粒体的CoxIV和细胞质的肌动蛋白。为了证实蛋白质（hFis1和Drp1）的缺失及其定位，还检测了hFis1和Drp1。图中所示为三个独立实验的代表。

过度表达hFis1野生型（hFis1-wt）而非C末端突变（hFis1ΔC）逆转抗凋亡hFis1-RNAi细胞

为了证实hFis1 RNAi细胞的抗凋亡性是hFis1缺失的结果，我们在hFis1RNAi中重建了hFisl的表达。我们用于hFis1 RNAi的靶序列位于编码序列的3′端之外，因此hFis1cDNA构建物可以用于在hFis1RNAi细胞中表达hFis1。我们将HeLa细胞与编码hFis1-wt或hFis1ΔC突变体（缺失膜锚）的cDNA构建物以及hFis1-shRNAi构建物共转染，选择含有潮霉素的转染体，并检测蛋白表达水平和对凋亡的敏感性。如所示图5AhFis1（wt和ΔC）在hFis1RNAi细胞（5-8通道）中表达良好。通过PARP切割评估，过度表达hFis1的hFis1RNAi细胞比hFis1RNA细胞对凋亡更敏感(图5A)，原子核碎裂(图5B)和细胞色素c（c）释放(图5、C和D). 然而，hFis1ΔC突变体在hFis1RNAi细胞中的过度表达并不影响对凋亡的敏感性。结果证实，hFis1是细胞对凋亡敏感性所必需的，并表明线粒体靶向hFis1对促进凋亡是必要的。

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hFis1野生型（hFis1-wt）而非C末端突变型（hFis1ΔC）的过度表达可逆转抗凋亡hFis1-RNAi细胞。用对照shRNA/pREP4（a）、hFis1 shRNA/p REP4材料和方法（A）每组（A–d）转染者分别用或不用STS（1μM）处理6 h，进行裂解，并通过Western blotting分析hFis1表达水平和PARP裂解。肌动蛋白也被分析为一种负荷控制。（B） 每组（a–d）转染者用STS处理（1μM；6 h），细胞核用Hoechst 33342染色（1μg/ml；RT时15 min）。在荧光显微镜下对这些细胞在几个区域的正常或凋亡细胞核进行计数（用于紫外线激发）。每个处理中总共至少有200个细胞被计数，并显示为总计数细胞中具有凋亡细胞核的细胞的百分比。数据绘制为至少三个独立实验的平均值±SD。（C） 每组（a–d）的转染子在zVAD-fmk（50μM）存在下用ActD（10μM；8小时）处理，固定，并用抗细胞色素染色c（c）（小鼠单克隆、绿色）抗体和图像通过共焦显微镜捕获。（D） 细胞色素的细胞数量c（c）以各组（a–d）经Act d处理并用抗细胞色素染色的转染剂中计数的总细胞的百分比来计算和绘制c（c）（与C中所示的样品相同）。在几个领域中总共统计了至少200个细胞。数据绘制为至少三个独立实验的平均值±SD。

Opa1基因敲除诱导线粒体碎片化并诱导细胞凋亡

据报道，RNAi下调HeLa细胞Opa1，导致线粒体断裂，线粒体膜电位耗散，嵴紊乱(奥利康等., 2003). 这些事件之后是细胞色素c（c）释放和caspase依赖的凋亡核事件。为了进一步研究Opa1的功能，特别是与裂变蛋白hFis1和Drp1结合，我们设计了几个Opa1序列（编码和非编码）特有的shRNA结构，用于基因沉默，方法与我们用于hFis1和Drp1RNAi的方法相同。报告下调Opa1的序列(奥利雄等., 2003)也曾在SHAGging系统工作。未产生基因沉默的序列被用作对照RNAi。转染后5–7天才能有效地选择转染剂，在该人群中Opa1几乎完全耗尽(图6A). 没有消失的下带可能是一个非特异性带，而不是八种选择性剪接变体之一(德莱特等., 2000)因为我们用于RNAi的靶序列存在于所有剪接变体中。在这些条件下，几乎所有细胞都显示出广泛的线粒体碎片，与对照RNAi细胞明显不同(图6、B和C).

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Opa1的耗尽导致线粒体断裂，细胞对凋亡变得非常敏感。用含有Opa1靶序列shRNA或对照序列shRNA的pREP4构建物转染HeLa细胞，并通过在含有潮霉素B（A）的培养基中生长来选择转染剂制备Opa1 RNAi细胞和对照RNAi的总细胞裂解物，并通过Western blotting分析Opa1的表达水平。肌动蛋白水平也被分析为负荷控制。（B） 用Mitotracker Red CMXRos观察对照RNAi细胞和Opa1 RNAi电池的线粒体，并用共焦显微镜进行分析。线粒体的详细结构如图所示。（C）在对照RNAi或Opa1-RNAi培养中，线粒体碎片（点）、正常（固体）或细长（条纹）的细胞群体百分比。在每个实验中，对几个领域中的至少200个细胞进行计数。数据表示至少三个独立实验的平均值±SD。（D） 用STS（1μM；6 h）、Act D（10μM；8 h）、足叶乙甙（100μM；30 h）或抗Fas抗体（500 ng/ml；15 h）处理Opa1缺失细胞和对照RNAi细胞，并对凋亡细胞核（用Hoechst染色）进行计分和标绘，作为计数的总细胞（至少200个细胞）的百分比。数据显示为三个独立实验的平均值±SD。（E） 从如上所述处理的细胞中分离出总DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳进行分析，并用溴化乙锭进行可视化。第一条通道是DNA阶梯控制。图中所示为三个独立实验的代表。（F） 在zVAD-fmk存在下，将缺失Opa1的HeLa细胞和对照RNAi细胞与Act D（10μM）孵育8小时，固定并用抗Bax（红色；我们未发表的数据）和抗细胞色素染色c（c）抗体（绿色）。（G） F中显示Bax易位或细胞色素的细胞数c（c）将释放量作为每个RNAi细胞群中计数的细胞总数的百分比进行计数和绘制，这些细胞群经过或不经过Act D处理，并用抗Bax和抗细胞色素染色c（c）抗体（与F中所示的样本相同）。在几个领域中总共统计了至少200个细胞。数据绘制为至少三个独立实验的平均值±SD。（H） 用STS（1μM；0，3，6 H）、Act D（10μM；0,4，8 H）或抗Fas（500 ng/ml；0，6，15 H）处理去Opa1 HeLa细胞和对照细胞的总提取物，分析PARP裂解。该图代表了至少三个独立实验。

与hFis1和Drp1 RNAi细胞相比，Opa1-RNAi对各种刺激诱导的凋亡更为敏感，这与之前的报告一致(奥利康等., 2003)，部分细胞（～25–35%）自发死亡(图6D). Opa1下调的细胞以典型的凋亡特征死亡。核碎裂(图6D)，DNA阶梯形成(图6E)，Bax易位，细胞色素c（c）释放(图6，F和G)和半胱氨酸蛋白酶激活/PARP裂解(图6H)均被观察到。一般caspase抑制剂zVAD-fmk和Bcl-2过度表达抑制了Opa1缺失引起的细胞死亡（我们未发表的数据）。

hFis1和Opa1缺失的细胞在广泛线粒体碎片的分泌中表现出抗凋亡性

hFis1的下调导致线粒体广泛融合，细胞变得抗凋亡（图​（图11和​和3）。三). 相反，Opa1下调导致线粒体广泛断裂，细胞对死亡更加敏感(图6). 在酵母中，裂变介质的消除可以通过消除融合介质来抵消(Sesaki和Jensen，1999年;Mozdy公司等., 2000;Wong公司等., 2000;濑崎等., 2003). 因此，我们下调了hFis1和Opa1，并检测了其对线粒体形态和细胞凋亡敏感性的影响。

70%以上的hFis1和Opa1细胞几乎完全耗尽（hFis1/Opa1 RNAi）(图7A)显示线粒体碎片(图7B)与单独使用Opa1 RNAi处理细胞时的结果类似(图6、B和C). 这可能反映了Opa1和hFis1在5天选择期内的消失率。因此，Fis1被耗尽5天，然后Opa1 RNAi被转染到Fis1耗尽的细胞中。Opa1缺失后2天检查线粒体形态显示，与第二次转染中表达对照RNAi的细胞相比，线粒体断裂(图7C). 因此，即使在用RNAi耗尽hFis1后，也会发生有限的线粒体分裂率，在没有Opa1的情况下，这种分裂率将占主导地位。酵母中Fis1基因缺失后，也会发生缓慢但有限的线粒体分裂(雅各布斯等., 2003). 如前所述，使用基于线粒体PAGFP稀释率测量的线粒体融合试验获得的结果进一步证实了hFis/Opa1 RNAi中线粒体的残余裂变(卡博夫斯基等., 2004). 我们发现hFis1/Opa1双RNAi细胞中线粒体融合受到完全抑制，与单个Opa1 RNAi电池中检测到的线粒体融合没有区别(图7、D和E).

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hFis1和Opa1缺失的细胞中线粒体广泛破碎。将含有hFis1和Opa1靶序列shRNA的pREP4构建物转染HeLa细胞，或将其与对照组一起转染，并通过在含有潮霉素B的培养基中生长来选择转染剂，或同时制备hFis1和Opa1 RNAi细胞以及对照RNAi电池，并通过Western blotting分析hFis1和Opa1RNAi的表达水平。肌动蛋白也被分析为一种负荷控制。（B） 左侧，用Mitotracker Red CMXRos观察hFis1/Opa1-RNAi细胞的线粒体，并通过共聚焦显微镜进行分析。线粒体的详细结构如图所示。右图为hFis1/Opa1 RNAi细胞培养中线粒体碎片（点）、正常（固体）或细长（条纹）的细胞群体百分比。在每个实验中，对几个领域中的至少200个细胞进行计数。数据表示至少三个独立实验的平均值±SD。（C） 随后Opa1的缺失逆转了hFis1缺失细胞中细长的线粒体形态。选择RNAi去除hFis1的Hela细胞5天，再次转染Opa1-shRNA-或对照shRNA--结构，2天后进行检测。为了鉴定转染体，共转染pEYFP载体。用线粒体红CMXRos观察线粒体，并用共焦显微镜进行分析。（D和E）对照RNA干扰、Opa1 RNA干扰和hFis1/Opa1 RNA干扰双RNA干扰细胞通过基于mito-PAGF的融合分析进行线粒体融合。用mito-PAGFP转染细胞，然后光激活细胞内的小区域（制剂中的白色圆圈），共聚焦采集覆盖整个细胞厚度的z序列。（E） 测量活化区域内荧光强度随时间的变化。

hFis1/Opa1 RNAi细胞对凋亡有很强的抵抗力，几乎与hFis1-RNAi细胞的抵抗力相同，而与Opa1 RNAi细胞的抵抗能力相反(图8A). 然而，这些细胞的阻力程度在不同的实验中有很大的差异（如图8A). 当用抗Fas抗体处理hFis1/Opa1 RNAi细胞和hFis1-RAi细胞（以及对照RNAi和Opa1 RNAi-细胞）的时间更长时，它们之间对凋亡的敏感性差异变得更大(图8B). hFis1/Opa1 RNA干扰细胞比hFis1 RNA干扰细胞更敏感，但从未像对照RNA干扰细胞或Opa1 RNAi细胞那样敏感。通过抑制Act D诱导的细胞色素也证实了hFis1/Opa1 RNAi细胞对凋亡的抵抗c（c）释放和Bax移位(图8C). 众所周知，Opa1与线粒体内膜有关，有报道称Opa1的缺失导致线粒体膜电位的损失(奥利康等., 2003). 事实上，大多数Opa1缺失细胞的线粒体膜电位都丢失了，但hFis1编码缺失阻止了这种丢失(图8D). 因此，hFis1对于由Opa1缺失引起的自发和诱导的细胞凋亡都是必需的，并且在细胞凋亡途径中与Opa1具有上位性功能。

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hFis1和Opa1缺失的细胞表现出与hFis1-缺失的细胞一样的抗凋亡性。（A） 用STS（1μM；6 h）、Act D（10μM；8 h）、足叶乙甙（100μM；30 h）或抗Fas抗体（500 ng/ml；15 h）处理缺失hFis1、Opa1或两者的HeLa细胞以及对照RNAi细胞，并用Hoechst 33342染色细胞核（1μg/ml；RT时15 min）。在荧光显微镜下对这些细胞在几个区域的正常或凋亡细胞核进行计数（用于紫外线激发）。每个处理中总共至少有200个细胞被计数，并绘制为计数的总细胞中具有凋亡细胞核的细胞的百分比。数据显示为至少三个独立实验的平均值±SD。（B） 将耗尽Opa1、hFis1或两者的HeLa细胞与对照RNAi细胞一起与抗Fas抗体（500 ng/ml）孵育，孵育时间如图所示，对细胞核进行染色并计数为正常或凋亡细胞核。在每个时间点，每个样本中总共至少有200个细胞被计数，并绘制为计数的总细胞中具有凋亡细胞核的细胞的百分比。数据绘制为至少三个独立实验的平均值±SD。（C） Bax易位与细胞色素c（c）Act D处理诱导的释放在hFis/Opa1 RNAi细胞中受到抑制。左侧，RNAi去除hFis1和Opa1的HeLa细胞以及对照RNAi细胞在zVAD-fmk（50μM）存在下用Act D处理（10μM；8 h），固定，并用抗Bax（兔多克隆，红色）和抗细胞色素双重染色c（c）（小鼠单克隆，绿色）抗体。右，显示Bax易位或细胞色素的细胞数量c（c）对释放进行计数，并将其绘制为用ActD处理并用抗Bax和抗细胞色素染色的每个RNAi细胞群中计数的总细胞的百分比c（c）抗体（与左图所示相同的样本）。在几个领域中总共统计了至少200个细胞。数据绘制为至少三个独立实验的平均值±SD。（D） hFis1缺失可防止Opa1缺失引起的线粒体膜电位降低。左侧，用5μg/ml JC-1孵育HeLa细胞20分钟，用共焦显微镜观察hFis1（b）、Opa1（c）或两者（d）以及对照RNAi细胞（a）。JC-1是一种阳离子染料，通过将其荧光发射从绿色变为红色来指示线粒体极化。线粒体膜电位高的区域用红色荧光表示，线粒体膜电位低的区域用绿色荧光表示。对，计算线粒体膜电位丢失的细胞数量，并绘制为每个RNAi细胞群中细胞总数的百分比。

讨论

当刺激哺乳动物细胞进行凋亡时，线粒体分裂成更小和更多的单位(曼奇尼等1997年;De Vos公司等., 1998;庄等., 1998;德萨热等., 1999;弗兰克等., 2001;卡博夫斯基等., 2002). 当线粒体分裂被显性阴性突变体Drp1（Drp1）的过度表达阻断时K38A型)线粒体诱导细胞死亡的下游事件，如细胞色素c（c）释放也被阻断，表明线粒体分裂可能是细胞凋亡的必要步骤(弗兰克等., 2001;布雷肯里奇等2003年). Bax是促凋亡的Bcl-2家族成员，在线粒体病灶中与Drp1共定位(卡博夫斯基等., 2002). 在细胞凋亡启动过程中，Bax从胞浆转运到线粒体外膜上的焦点结构(尼库什坦等., 2001;猫实叮等., 2003)成为细胞器断裂的部位(卡博夫斯基等., 2002)这表明Bax可能激活线粒体裂变机制。

通过筛选酵母中抑制缺乏线粒体融合基因FZO1的细胞表型的突变体，初步确定了线粒体外膜蛋白Fis1在线粒体分裂中的重要性(Mozdy公司等., 2000;Tieu和Nunnari，2000年). 为了进一步探讨线粒体形态与凋亡之间的关系，我们测试了另一种参与线粒体分裂的蛋白质hFis1在凋亡中的作用。据报道，人Fis1在过度表达时可诱导线粒体断裂(詹姆斯等., 2003;Yoon公司等., 2003)hFis1的缺失导致哺乳动物线粒体伸长(斯托扬诺夫斯基等., 2004)，表明FIS1系统真核生物中。在酵母中，金融服务1已经证明基因与DNM1（DNM1）并且似乎对Dnm1p（Drp1）在线粒体上的焦点结构中的募集至关重要(Mozdy公司等., 2000;箫等., 2002). 虽然人类Fis1可以与Drp1交联(Yoon公司等., 2003)，两人似乎没有稳定的联系(詹姆斯等., 2003)hFis1的过度表达也不会增加Drp1与线粒体的结合(铃木等., 2003). 在这里，我们进一步表明，与酵母相比，hFis1的缺失不会降低Drp1与线粒体的结合(图2，A和B). 然而，有趣的是，在同一个含有Drp1的病灶中，Bax招募需要hFis1。

我们发现hFis1的缺失抑制了细胞凋亡的诱导。此前，有报道称hFis1的过度表达会导致细胞死亡，而Bcl-xL的过度表达则会抑制细胞死亡(詹姆斯等., 2003). 有趣的是，hFis1过度表达诱导的细胞凋亡未被显性阴性抑制剂Drp1抑制K38A型，而细胞色素c（c）这些细胞中的释放被阻断。这与我们的结果相关，即hFis1和Drp1在凋亡途径的不同步骤中发挥作用。hFis1的缺失抑制Bax易位，而Drp1的缺失则没有。然而，Drp1的缺失阻止了细胞色素的产生c（c）甚至在Bax转移到线粒体的细胞中释放(图4). 这是抑制凋亡的一个新步骤。典型地，Bax在细胞色素非常接近的时间内易位到线粒体c（c）因此，在一个群体中，细胞主要以Bax易位阴性和细胞色素的形式存在c（c）释放阴性或Bax易位阳性和细胞色素c（c）释放正极。Drp1缺失后，大部分细胞Bax易位阳性，细胞色素阳性c（c）释放阴性，显示出新的凋亡抑制阶段。按照詹姆斯的说法等. (2003)，我们发现Drp1的缺失对细胞色素产生更显著的抑制作用c（c）释放而非抑制细胞凋亡，提示Bax易位可能诱导细胞死亡，与细胞色素无关c（c）释放。其他凋亡抑制剂，如Bcl-2和hFis1的丢失，阻断了这两个步骤，而通用半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂z-Val-Ala-Asp（OMe）-氟甲基酮（zVAD-fmk）两者均不阻断，仅抑制线粒体外膜通透性下游的事件。因此，Drp1似乎在细胞色素Bax易位后发挥作用c（c）凋亡过程中发生的释放过程。

hFis1是如何作为促凋亡蛋白发挥作用的？hFis1结构(铃木等., 2003)显示该蛋白包含四个类似TPR的串联结构。已知TPR基序可促进特定的蛋白质-蛋白质相互作用(布拉奇和拉斯勒，1999年)表明hFis1可能与其他蛋白质结合，并在线粒体外膜上作为分子适配器（受体）发挥作用。除hFis1外，线粒体外膜中的TPR蛋白还包括Tom20(岩桥等., 1997)和Tom70(年轻等., 2003)这两种蛋白都参与向线粒体募集其他蛋白质。虽然hFis1似乎并没有向线粒体募集Drp1，但还有许多其他有趣的候选蛋白值得研究。酵母和人类线粒体分裂和融合机制之间的显著差异可能为细胞凋亡以及线粒体生物发生机制提供见解。

线粒体融合蛋白的丢失与线粒体分裂蛋白的丢失对细胞凋亡的影响相反。当Opa1被RNAi耗尽时，线粒体广泛断裂，细胞对凋亡变得非常敏感，这与其他人报道的结果一致(奥利康等., 2003;格里帕里克等., 2004)线粒体断裂与细胞凋亡敏感性的进一步关联。我们的结果表明，野生型Opa1可能作为一种抗凋亡蛋白正常发挥作用，抑制自发凋亡。然而，如果hFis1下调，则细胞不需要Opa1来阻止凋亡，这表明Opa1可能在正常情况下抵消hFis1的促凋亡作用。因此，尽管线粒体断裂本身并不一定导致细胞凋亡，但线粒体裂变-融合机制的组成部分可以积极或消极地调节细胞凋亡，线粒体裂变和融合的速度可能与程序性细胞死亡过程直接相关。

致谢

我们感谢Craig Blackstone博士（美国国家神经疾病和中风研究所/美国国家卫生研究院）提供Opa1抗体，并批判性阅读了手稿和许多有用的建议。我们还感谢Sang-Joon Park博士和Hyeog Kang博士（国家心脏、肺和血液研究所/国家卫生研究院）对RNAi实验提出的许多建议。这项工作得到了国家神经疾病和中风研究所/国家卫生研究所的内部计划的支持。

笔记

文章在印刷前在线发布。Mol.Biol。细胞10.1091/mbc。E04–04–0294。文章和出版日期可在www.molbiolcell.org/cgi/doi/10.1091/mbc。E04–04–0294.

使用的缩写：Act D，放线菌素D；聚ADP-核糖聚合酶；RNA干扰；短发夹RNA；STS，葡萄孢菌素；zVAD-fmk，z-Val-Ala-Asp（OMe）-氟甲基酮。

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文章来自细胞分子生物学由以下人员提供美国细胞生物学学会