血管生成的分子机制及其临床应用

摘要

血管在进化过程中出现，使造血细胞能够巡视机体进行免疫监视，提供氧气和营养，并处理废物。血管也以灌流依赖的方式为器官发生产生指导性信号(方框1). 虽然血管有利于组织生长和再生，但它可以助长炎症和恶性疾病，并被肿瘤细胞利用以转移和杀死癌症患者。由于血管几乎滋养身体的每一个器官，血管生长异常会导致许多疾病。仅举几个例子，血管生长或维持不足可导致中风、心肌梗死、溃疡性疾病和神经变性，血管异常生长或重塑会加剧癌症、炎症疾病、肺动脉高压和致盲性眼病^1,2。

已经确定了几种血管形成模式(图1). 在发育中的哺乳动物胚胎中，成血管细胞分化为内皮细胞，内皮细胞组装成血管迷路，这一过程称为血管生成(图1b). 不同的信号表明动脉或静脉的分化^三随后的发芽确保了血管网络的扩张，称为血管生成(图1a). 然后发生动脉生成，内皮细胞通道被周细胞或血管平滑肌细胞（VSMC）覆盖，从而提供稳定性并控制灌注。组织也可以通过其他机制血管化，但这些过程的相关性尚不清楚。例如，已有的血管可以通过肠套叠的过程分裂，从而产生子血管(图1c). 在其他情况下，会发生血管共生，肿瘤细胞会劫持现有的血管系统(图1d)或者肿瘤细胞可以排列血管，这种现象称为血管拟态(图1e). 推测肿瘤干细胞甚至可以生成肿瘤内皮⁴(图1f). 尽管存在争议，但健康成人血管的修复或病理血管的扩张可以通过向血管壁募集骨髓源细胞（BMDCs）和/或内皮祖细胞来帮助。然后，祖细胞在一个称为出生后血管生成的过程中并入内皮衬里。在血运重建过程中，侧支血管向缺血组织输送大量血液，通过不同的机制（如髓细胞的吸引和激活）使其体积增大⁵。

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图1

船舶形成方式

在正常组织和肿瘤中有几种已知的血管形成方法。一–c（c），血管生成可通过新生血管萌芽发生(一)通过招募分化为内皮细胞（EC）的骨髓源性和/或血管源性内皮祖细胞（EPC）；b条)或者是肠套叠这种血管分裂过程(c（c）).d日–（f），肿瘤细胞可以与已有的血管共生(d日)或者肿瘤血管可以由肿瘤细胞排列（血管模拟；e（电子）)或者是内皮细胞，其染色体上有细胞遗传学异常，来源于假定的癌症干细胞(（f）). 与正常组织不同，正常组织利用新生血管生成、血管生成和肠套叠(一–c（c）)，肿瘤可以使用所有六种血管形成模式(一–（f）).

缺血组织的血管重建将使数百万人受益，但治疗性血管生成仍然是一项尚未满足的医学需求。相反，通过靶向癌症和眼病的血管供应取得了更大的成功⁶在这篇综述中，我们描述了血管生成中的关键分子靶点，并讨论了最广泛使用的一类抗血管生成剂——血管内皮生长因子阻断剂（VEGF，也称为血管通透性因子或VPF）的临床经验。我们不提供百科全书式的调查，而是关注一些最近发现的机制和原理，以及具有翻译潜力的目标。

血管分支、成熟和静止

在更深入地讨论涉及的分子因素之前，我们首先提供血管分支的顺序步骤（静止、激活和分解）的当前观点(图2). 在健康成人中，静止的内皮细胞半衰期长，并可通过VEGF、NOTCH、血管生成素-1（ANG-1）和成纤维细胞生长因子（FGF）等维持信号的自分泌作用而免受损伤。由于血管提供氧气，内皮细胞配备了氧传感器和低氧诱导因子，例如分别为脯氨酰羟化酶结构域2（PHD2）和低氧诱发因子2α（HIF-2α），允许血管重新调整其形状以优化血流。静止的内皮细胞形成一层具有流线型表面的方阵细胞单层，由连接分子如VE-粘附素和克劳丁相互连接。这些内皮细胞被周细胞包裹，周细胞抑制内皮细胞增殖并释放VEGF和ANG-1等细胞生存信号。静止时内皮细胞和周细胞产生共同的基底膜。

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图2

血管分支的分子基础

图中显示了血管分支的连续步骤，括号中表示了涉及的关键分子。一在血管生成因子刺激后，静止的血管扩张，选择内皮细胞尖端细胞（DLL4和JAGGED1）以确保分支形成。Tip细胞的形成需要基底膜降解、周细胞脱落和内皮细胞连接松动。通透性增加允许血浆蛋白（如纤维蛋白原和纤维连接蛋白）外渗，以沉积临时基质层，蛋白酶重塑预先存在的间质基质，所有这些都使细胞迁移成为可能。为了简单起见，只描述了内皮细胞和周细胞之间的基底膜，但实际上，周细胞和内皮细胞都嵌在基底膜中。b、，叶尖细胞根据引导信号（如信号蛋白和肾上腺素）进行导航，并粘附在细胞外基质（由整合素介导）上进行迁移。尖端细胞后面的茎细胞增殖、伸长并形成管腔，芽融合形成灌注的新生血管。增殖的柄细胞吸引周细胞并沉积基底膜使其稳定。新生的髓样细胞，如肿瘤相关巨噬细胞（TAM）和表达TIE-2的单核细胞（TEM）可以产生促血管生成因子或从ECM中蛋白水解释放血管生成生长因子。c（c）在相邻分支融合后，管腔形成允许新生血管灌注，新生血管通过促进方阵表型、重新建立连接、基底膜沉积、周细胞成熟和产生血管维持信号而恢复平静。其他因素促进内皮脂质转运。

当静止的血管感应到缺氧、炎症或肿瘤细胞释放的血管生成信号，如VEGF、VEGF-C、ANG-2、FGFs或趋化因子时，周细胞首先从血管壁上分离（对ANG-2作出反应），并通过蛋白水解降解从基底膜中解放出来，由基质金属蛋白酶（MMPs）介导(图2a). 内皮细胞松动连接，新生血管扩张。VEGF增加内皮细胞层的通透性，导致血浆蛋白外渗，并奠定临时细胞外基质（ECM）支架。作为对整合素信号传导的反应，内皮细胞迁移到ECM表面。蛋白酶释放储存在ECM中的血管生成分子，如VEGF和FGF，并将ECM重塑为血管相容性环境。为了构建灌注管并防止内皮细胞向血管生成信号大量移动，选择一个内皮细胞，称为尖端细胞，在存在VEGF受体、神经胶质（NRP）和NOTCH配体DLL4和JAGGED1等因素的情况下领导尖端(图2a). 尖端细胞的邻近细胞作为柄细胞占据辅助位置，柄细胞分裂以拉长柄（受NOTCH、NOTCH调节的锚蛋白重复蛋白（NRARP）、WNTs、胎盘生长因子（PlGF）和FGF刺激）并建立管腔（由VE-cadherin、CD34、唾液酸、VEGF和刺猬介导）(图2b). 叶尖细胞配备有丝足类，以感知环境引导线索，如肾上腺素和信号素，而茎细胞释放分子，如EGFL7进入ECM，以传递有关其相邻位置的空间信息，从而使茎伸长。HIF-1α驱动的低氧诱导程序使内皮细胞对血管生成信号作出反应。髓样桥接细胞有助于与另一血管分支融合，从而启动血液流动。血管要发挥功能，就必须成熟稳定。内皮细胞恢复其静止的方阵状态(图2c)，以及血小板衍生生长因子B（PDGF-B）、血管紧张素-1、转化生长因子-β（TGF-β）、肾配蛋白B2和NOTCH等信号导致细胞被周细胞覆盖。蛋白酶抑制剂（称为金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP）和纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1））导致基底膜沉积，并重新建立连接以确保最佳流量分配。如果无法灌注，血管会倒退。

VEGF家族

鉴于血管生成等过程的复杂性，值得注意的是，单个生长因子VEGF对这一过程的调控如此显著。VEGF家族仅由少数成员组成，其成员的非冗余作用使其与其他血管生成超家族不同。VEGF（也称为VEGF-A）是主要成分，通过VEGF受体-2（VEGFR-2，也称为FLK1）发出信号，刺激健康和疾病中的血管生成^7,8神经毛蛋白如NRP1和NRP2是VEGF共受体，可增强VEGFR-2的活性，但也可独立发出信号⁹与VEGFR-2缺乏类似，VEGF的缺失会中止血管的发育²根据可溶性和基质结合亚型建立的VEGF梯度，叶尖细胞上调DLL4表达，从而激活茎细胞中的NOTCH；这下调了VEGFR-2的表达，使茎细胞对VEGF的反应减弱，从而确保尖端细胞发挥主导作用¹⁰可溶性VEGF亚型促进血管扩张，而基质结合亚型促进分支。肿瘤、髓细胞或其他基质细胞释放的旁分泌VEGF增加血管分支并使肿瘤血管异常¹¹而内皮细胞释放的自分泌VEGF维持血管内稳态¹²新的证据表明，VEGFR-2信号的生物学效应取决于其亚细胞定位，例如，VEGF诱导动脉形态发生时，VEGFR-2必须从细胞内隔间发出信号¹³.激活血管内皮生长因子2基因突变导致血管肿瘤和基因多态性血管内皮生长因子和/或其受体共同决定病理性血管生成^14,15而VEGF信号的阻断可以针对人类恶性和眼部疾病中的血管生成血管。VEGF蛋白或基因转移刺激缺血组织中的血管生长，但通常与意外渗漏和血管异常有关。

VEGF-C是VEGFR-2和VEGFR-3受体的配体，激活血管尖端细胞¹⁶VEGFR-3是早期胚胎发育过程中血管形成所必需的，但后来成为淋巴管生成的关键调节器，即从原有淋巴管形成新的淋巴管¹⁷在斑马鱼中，第一个胚胎静脉是由静脉营养内皮细胞从共同的前体血管中分离出来的，静脉内皮细胞的萌芽受VEGFR-2的限制，但受VEGFR 3的促进（参考文献。18). 动脉干中的静脉衍生血管生成也依赖于VEGFR-3信号。抑制受体二聚化或配体结合的抗-VEGFR-3抗体协同减缓肿瘤生长，并通过阻断VEGFR-2增强对肿瘤生长的抑制，使VEGFR-3成为另一种抗血管生成候选物¹⁶。

PlGF最初被发现是一种VEGF同源物，也被认为是一种血管生成因子。然而，与VEGF不同，PlGF对发育是不必要的，只与疾病有关^19,20PlGF是一种多任务细胞因子，通过直接或间接机制刺激血管生成，并激活骨髓源性内皮祖细胞和髓样细胞以及基质细胞，为肿瘤细胞创造一个养育“土壤”，此外还激活肿瘤细胞¹⁹通过扭曲肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的极化，PlGF的丢失改善了血管灌注和成熟，并增强了对化疗的反应²¹通过中和抗PlGF抗体阻断PlGF-复制基因的抗血管生成作用Plgf公司（也称为血小板生长因子)自发小鼠肿瘤模型的缺陷与眼部新生血管等疾病²²然而，在可移植肿瘤模型中，其他PlGF-blocking策略无法抑制肿瘤的生长²³因此，PlGF阻断剂对癌症患者的治疗潜力尚待确定。在临床前模型中，PlGF蛋白或基因传递增加缺血组织的血运重建。

小鼠VEGF家族成员VEGF-B的缺乏不会损害正常发育中的血管生成，也不能补偿出生后VEGF的阻断¹⁹.VEGF-B仅在某些组织（如心脏）中限制血管生成活性，但它促进神经元存活并诱导代谢效应^19,24VEGF-B对病理性血管生成的发散作用已经有报道，并且已经证明它可以促进心脏血管的生长，而不会引起诸如通透性增加或渗漏等不良影响²⁵。

VEGFR-1受体（也称为FLT-1）在血管生成中的确切作用尚不明确^19,26VEGFR-1以膜锚定信号竞争形式和可溶性分泌形式（也称为sFLT-1）存在。通过捕获配体，sFLT-1可以帮助引导新生枝条或完全抑制发芽。由于其弱酪氨酸激酶活性，VEGFR-1可能充当VEGF的诱饵，调节可用于激活VEGFR-2的游离VEGF数量，并解释为什么VEGFR-1缺失导致血管过度生长¹⁹然而，血管生成内皮细胞、基质细胞和髓细胞中的细胞内VEGFR-1信号刺激病理性血管生成²⁶VEGFR-1信号也促进VEGFR-1的生长⁺肿瘤细胞对血管生成依赖性自分泌VEGF产生的反应²⁷并上调转移前部位内皮细胞中的MMP9。有证据表明VEGFR-1⁺造血祖细胞在远处器官形成转移前生态位，但这一发现仍有争议^28,29中和抗PlGF、抗VEGFR-1和抗VEGFR-2抗体处于早期临床开发阶段。

PDGF系列

血管要正常工作，必须成熟并被壁细胞覆盖。几个生长因子家族，如PDGFs、血管生成素和TGF-β，参与了这一过程³⁰为了稳定内皮细胞通道，血管生成性内皮细胞释放PDGF-B以化学吸引PDGF受体-β（PDGFR-β）⁺周细胞^31,32因此，PDGF-B消融后周细胞缺乏会导致血管渗漏、迂曲、微动脉瘤形成和出血。小鼠中编码PDGF-B蛋白保留基序（周细胞粘附所必需）的基因敲除导致肿瘤血管脆性和过度扩张，而PDGFR-β-低形态小鼠脑血管周围周细胞不足，导致血脑屏障（BBB）有毒物质泄漏导致的缺陷和神经退行性损伤³³肿瘤衍生PDGF-B还通过上调基质细胞衍生因子-1α（SDF-1α；由CXCL12系列). 除了局部来源外，周细胞也可能来自血管周围PDGFR-β⁺周细胞祖细胞，来自骨髓³⁴VEGF通过抑制壁细胞中PDGFR-β信号传导，降低周细胞覆盖率，使肿瘤血管异常。

PDGFR抑制通过导致周细胞脱离来减少肿瘤生长，导致未成熟血管易于退化³⁵其他缺乏蛋白多糖NG2（也称为CSPG4）的周细胞缺陷小鼠菌株也形成异常的肿瘤血管和较小的肿瘤。矛盾的是，小鼠PDGF-B的过度表达通过促进周细胞募集和诱导内皮细胞生长停滞来抑制肿瘤生长³⁶由于内皮细胞的存活取决于周细胞VEGF的产生，周细胞保护内皮细胞免受VEGF撤回的影响，并对VEGF阻断产生抵抗。这种保护需要密切的内皮细胞-周细胞相互作用，因为PDGF-B阻断仅当VEGF由周细胞产生而不是由较远的肿瘤细胞产生时，才会减少周细胞覆盖率和血管数量³⁷使用多靶点受体酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）的初步研究表明，通过耗尽周细胞的血管，阻断PDGF-B使成熟血管对VEGF阻断更敏感³¹最近使用更特异性抑制剂的研究表明，联合治疗并不比抗血管内皮生长因子单一治疗更有效³⁸。

PDGFR-β⁺周细胞在转移中具有双重作用。在原发性肿瘤中，周细胞限制了肿瘤细胞的灌注，因为周细胞耗尽后，更松散的血管壁不再是传播肿瘤细胞的屏障³⁹血管周围周细胞的缺乏也与患者的转移相关，一项评估PDGF-B阻断的试验因过度渗漏而中止。这些研究表明，阻断血管成熟可以促进恶性肿瘤。然而，其他报道表明，周细胞在微转移部位被肿瘤细胞所选择，通过释放血管生成因子使肿瘤定植。总的来说，需要未来的研究来探索PDGF阻断治疗癌症的益处和风险。

PDGF-B阻断剂可用于治疗非恶性血管疾病，如肺动脉高压，而PDGF-B激活可提供稳定血管畸形的治疗机会⁴⁰PDGF-CC是VEGF抑制性肿瘤中癌相关成纤维细胞释放的另一个家族成员，刺激血管生长和成熟，并减弱对抗VEGF治疗的反应^41,42.通过阻止血管周围PDGFR-α的激活⁺星形胶质细胞与周细胞共同构成血脑屏障，阻断PDGF-CC可在中风期间保持血脑屏障的完整性。抑制PDGF-DD可抑制眼部新生血管，而PDGF-DD-过度表达可使肿瘤血管正常化并改善药物输送。

TGF-β信号

人类遗传性出血性毛细血管扩张症以血管畸形为特征。人类遗传学研究表明，这种疾病是由编码内切蛋白的基因突变引起的(发动机)或激活素受体样激酶(ALK1型，也称为ACVRL1）-TGF-β家族的受体。小鼠研究证实，TGF-β受体ALK-1、TGFR-1（也称为ALK-5）、TGFR-2或ENG的缺失会导致动静脉畸形，这与遗传性出血性大血管扩张症患者的情况类似⁴³然而，由于结果不一致，理解该途径的分子基础一直是一个挑战。这部分是由于TGF-β家族成员的促血管生成和抗血管生成作用的上下文依赖性。此外，尽管TGF-β促进VSMC分化，ENG或ALK-1缺乏会损害壁细胞发育，但其他TGF-α成分是否介导其血管效应尚不清楚体内通过内皮细胞或血管平滑肌细胞⁴³临床前研究表明，针对ENG或ALK-1的抗体可以抑制肿瘤血管生成和生长。一些TGF-β受体阻滞剂目前正在进行早期临床试验。

FGF超家族

FGF超家族及其受体控制着广泛的生物功能⁴⁴bFGF是最早发现的血管生成因子之一，与FGF1一样，具有血管生成和动脉生成特性；FGF9刺激骨修复中的血管生成。FGFs激活内皮细胞上的受体（FGFR），或通过诱导其他细胞类型的血管生成因子的释放间接刺激血管生成⁴⁴例如，在心脏中，FGF介导的信号传导通过刺激刺猬、ANG-2和VEGF-B的释放来促进血管生长。维持血管完整性需要低水平的FGF，因为静止内皮细胞中FGFR信号传导的抑制会导致血管解体⁴⁵异常的FGF信号促进肿瘤血管生成，并介导肿瘤血管从VEGF或表皮生长因子受体（EGFR）抑制剂治疗中逃逸⁴⁶用于阻断血管生成的特定FGF或FGFR抑制剂的开发滞后，部分原因是Fgf1型或Fgf2型小鼠体内的缺陷不会产生血管缺陷，FGF超家族显示出大量冗余⁴⁴FGF蛋白或基因转移已被测试用于治疗性血管生成，但在临床上没有持续成功。

ANG和TIE信号系统

健康的血管必须配备保持静止的机制，同时保持对血管生成刺激的反应能力。ANG和TIE系列是提供这种交换机的二进制系统。人类ANG家族由两个受体TIE-1和TIE-2以及三个配体ANG-1、ANG-2和ANG-4组成。ANG-1作为TIE-2激动剂发挥作用，ANG-2以上下文依赖的方式作为竞争性ANG-1拮抗剂发挥作用（ANG-4尚未得到很好的研究，但被认为与ANG-1类似）。由于还没有确定TIE-1的配体，这个孤儿受体可能作为TIE-2的负调控因子，但其确切作用仍不明确⁴⁷ANG-1由壁细胞和肿瘤细胞表达，而ANG-2则由血管生成的尖端细胞释放。在汇合内皮细胞中，ANG-1诱导TIE-2聚集在trans中在细胞-细胞连接处维持内皮细胞静止⁴⁸.ANG-1还刺激壁画覆盖和基底膜沉积，从而促进血管紧密性。在存在血管生成刺激物的情况下，新生内皮细胞释放ANG-2，ANG-2拮抗ANG-1和TIE-2信号，从而增强壁细胞分离、血管通透性和内皮细胞新生⁴⁷.根据，第2级（也称为德)小鼠的缺乏会导致血管缺陷，激活生殖系和体细胞轮胎2(TEK公司)人类的突变会导致静脉畸形。肿瘤衍生的ANG-2还通过招募促血管生成TIE-2表达的单核细胞（TEM）促进血管生成⁴⁹。

ANG–TIE系统对肿瘤的总体影响取决于环境⁴⁷.ANG-1通过促进内皮细胞存活和血管成熟刺激肿瘤生长，但它也抑制肿瘤细胞外渗并保持肿瘤外健康血管的完整性。当考虑将ANG-1作为抗癌靶点时，这些相互冲突的生物活性值得谨慎。相反，ANG-2可能是一个更具吸引力的治疗靶点，因为它刺激肿瘤血管生成并招募促血管生成的TEM，而ANG-2的抑制促进血管退化和正常化⁵⁰鉴于ANG-2和VEGF协同增加血管生成，VEGF和ANGs的联合阻断在抑制肿瘤血管生成、转移和渗漏方面更为优越⁵¹在早期临床试验中，正在评估阻断TIE-2或ANG-2的各种药物。

NOTCH和WNT信号通路

血管分支模型假设，一般来说，顶端细胞迁移，柄细胞增殖。最近的研究表明该模型中存在NOTCH信号¹⁰作为对VEGF的反应，VEGFR-2的激活上调了尖端细胞中DLL4的表达。在邻近的柄细胞中，DLL4激活NOTCH，NOTCH下调VEGFR-2但上调VEGFR-1；因此，茎细胞对VEGF的萌发活性反应较低，但对PlGF等分子更为敏感。总的来说，DLL4和NOTCH信号限制分支，但产生灌注血管¹⁰通过上调NOTCH中的PDGFR-β⁺内皮细胞中的壁细胞DLL4也刺激血管成熟。JAGGED1是由柄细胞表达的另一种NOTCH配体，通过干扰从柄细胞到尖端细胞的DLL4和NOTCH信号转导，促进尖端细胞的选择⁵²茎细胞中的NOTCH信号随着时间的推移是动态的，因为它上调了自身的抑制剂NRARP⁵³。

一个出乎意料的复杂性是，内皮细胞通过微调VEGFR-2和VEGFR-1的表达，不断竞争尖端细胞的位置，这表明当细胞遇到新的邻居时，这种信号通路不断被重新评估⁵⁴据此，DLL4和NOTCH信号的抑制可诱导更多但灌注不足的血管形成，从而导致肿瘤缺氧和生长抑制⁵⁵然而，健康动物的慢性DLL4阻塞会导致血管肿瘤⁵⁶以及NOTCH下游转录因子RBP-J的内皮细胞失活也会导致血管生成失控。尽管这些数据表明静止的方阵细胞需要低水平的NOTCH信号，但它们也值得警惕，不要滥用DLL4和NOTCH抑制剂来治疗癌症。刺猬家族成员的信号传递还通过调节NOTCH的表达，参与胚胎血管生成、血管形态发生和导管形成，以及动脉规范^三。

内皮细胞表达各种类型的WNT配体及其卷曲（FZD）受体，其中一些刺激内皮细胞增殖。NOTCH在血管分支过程中激活增殖的茎细胞中的WNT信号传导⁵³解释了为什么通常抑制增殖并促进静止的NOTCH刺激茎细胞增殖体内WNT还激活了双向反馈系统中的NOTCH，因为内皮细胞中的WNT信号诱导了一种NOTCH样表型，其特征是分支缺陷、静脉特性丧失和异常血管重塑⁵⁷.小鼠中某些WNT和FZD成员的基因激活(Wnt2、Wnt5a、Fzd4和Fzd5公司)导致血管缺陷，而Wnt7a型和重量7b损害脑血管生成和BBB形成⁵⁸由于一些WNT成员抑制血管生成，因此需要这些蛋白的特异性阻断剂。

整合素和蛋白酶

ECM在血管细胞及其周围组织之间提供物理连接。内皮细胞具有与基质相互作用和改变基质的机制。整合素是介导ECM和免疫球蛋白超家族分子粘附的异二聚体受体^59,60整合素α的上调_v（v）β_三和α_v（v）β₅使生长中的内皮细胞与肿瘤环境中的临时基质蛋白结合；这些蛋白质包括天然形式和降解形式的卵黄凝集素、纤维蛋白原和纤维连接蛋白。这些粘附相互作用为入侵的内皮细胞提供生存线索和牵引力。其他参与血管生成的整合素包括α₁β₁, α₂β₁, α₄β₁, α₅β₁, α₆β₁, α₉β₁和α₆β₄（参考文献^59,60).

除了通过连接ECM成分诱导的信号外，整合素还通过其他机制调节血管生成。鉴于整合素能够与几个细胞外分子相互作用并以双向方式传递信号，整合素发挥“中枢”的作用，在血管生成过程中协调内皮细胞和VSMC的行为^59,61因此，整合素与生长因子（如VEGF、FGF和ANG-1）或其受体（VEGFR-2和FGFRs）的结合刺激血管生长。整合素还上调和激活入侵尖端细胞中的酶原蛋白酶，并通过调节内皮细胞、周细胞和基底膜之间的相互作用促进血管成熟。其他整合素促进血管生成性BMDC与肿瘤内皮细胞的粘附。最近的研究强调了理解α的作用的复杂性_v（v）β_三在病理性血管生成中，肿瘤血管生成受到基因缺陷的刺激，但受到药物阻断的抑制^59,60尽管如此，整合素阻滞剂目前正在临床上进行评估。

静止的内皮细胞和周细胞共享一个共同的基底膜，这不仅在物理上限制了这些细胞，而且由于ECM成分的抗增殖特性，使它们保持静止。在分支过程中，ECM的蛋白水解酶重塑使这些细胞自由运动，并将基底膜的特性转化为促血管生成环境。不同的蛋白酶如基质金属蛋白酶通过几种机制调节血管生成⁶²通过蛋白质水解重塑基底膜、执行定向基质蛋白水解（膜型1-MMP）或暴露ECM中的趋化性隐秘基序位点，促进内皮细胞迁移和管形成。基质金属蛋白酶和纤溶酶也能从固定化基质中释放血管生成因子，如VEGF和FGF⁶³VEGF亚型被基质金属蛋白酶（因此是可溶的）裂解，优先扩大血管，而基质金属蛋白酶抗性结合的VEGF支持血管分支⁶⁴巨噬细胞、中性粒细胞和肥大细胞通过MMP9介导的VEGF激活启动血管生成^65,66蛋白酶（如MMP9）还通过释放可溶性形式的膜结合细胞因子（如KIT配体；也称为干细胞因子或SCF），参与动员骨髓祖细胞⁶⁷MMPs通过招募骨髓祖细胞建立转移前生态位²⁹鉴于蛋白酶的破坏潜力，必须严格控制其活性。例如，抑制剂PAI-1的丢失会阻止血管分支，因为过度的ECM分解不会为芽留下基质支持⁶⁸此外，血管成熟过程中的基底膜沉积需要MMP抑制剂如TIMPs的活性。因为ECM成分的降解也会产生抗血管生成片段，如tumstatin和angiostatin¹蛋白酶抑制剂必须审慎评估其生物效应。

连接分子

细胞-细胞通讯是血管沿其纵轴作为同步单位发挥作用的基础。这种协调是通过缝隙连接的细胞-细胞通信来完成的，缝隙连接是由连接蛋白建立的，它将下游组织的灌注状态告知上游供血血管，以防止分流，这是肿瘤血管中的一种众所周知的缺陷⁶⁹除了这些远程通讯连接外，内皮细胞和周细胞还有短程通讯连接。

静止的内皮细胞形成相互连接的单层细胞，而血管生成性内皮细胞则分离其连接点进行迁移。紧密连接分子克劳丁、闭塞素和连接粘附分子维持屏障，如BBB，而粘附连接建立细胞-细胞粘附、细胞骨架重塑和细胞内信号传递⁷⁰VE-cadherin的缺失不会阻止血管的发育，但会导致血管重塑和完整性的缺陷²VE-cadherin也需要用于定位CD34及其唾液酸受体与细胞间的接触，以形成管腔⁷¹在静止的指骨内皮细胞中，VE-卡德林通过抑制VEGFR-2信号传导而激活TGFR通路来促进血管稳定。值得注意的是，氧传感器在反馈回路中控制VE-cadherin的表达，因此当氧气供应不足时可以优化血管灌注⁷².N-钙粘蛋白稳定内皮细胞和周细胞之间的接触。在萌发过程中，VEGF和血管生成因子的内吞作用降低了VE-cadherin在相邻细胞之间的粘附功能⁷⁰同时，VE-cadherin在丝足纲的定位允许尖端细胞与外伸芽上的细胞建立新的接触。抗体可识别在萌芽期间粘附连接分离后暴露的VE-cadherin新表位，为选择性阻断内皮细胞生长提供机会，而不影响内皮细胞的维持。

趋化因子和G蛋白偶联受体

趋化因子通过招募促血管生成免疫细胞和内皮祖细胞，或通过直接激活内皮G蛋白偶联趋化因子受体（GPCR）来调节血管生成。一种众所周知的趋化因子是SDF-1α，它与尖端细胞上的受体CXCR4结合⁷³SDF-1α在缺氧时被HIF-1α上调，并支持促血管生成CXCR4的动员和保留⁺骨髓间充质干细胞促进缺血器官的血运重建。癌相关成纤维细胞也释放SDF-1α。另一种趋化因子是具有生物活性的1-磷酸鞘氨醇脂质（S1P），它与G蛋白偶联受体（S1PRs）的S1P家族结合，部分通过与PDGF和VEGF受体的交叉对话调节内皮细胞屏障功能、血管稳定性和血管生成，这一过程称为GPCR顶升⁷⁴SDF-1α、CXCR4和S1P抑制剂正在开发用于癌症治疗⁷³另一种最近发现的GPCR是GPR124，它调节BBB分化⁷⁵。

翻译中的其他途径和挑战

其他途径也调节血管生成，其中一些途径为引导尖端细胞提供指导信号(方框2). 鉴于血管的祖先供氧功能，血管的形成受氧传感器的控制(方框3). 如前所述，除VEGF阻断外，各种抗血管生成途径正在开发中¹⁴未来的一个挑战是确定这些药物的最佳治疗方案，无论是单一治疗还是与VEGF阻断联合治疗。

将上述见解转化为临床成功治疗的一个主要障碍是，各种抗血管生成方法具有不同的效果，或者在临床前比在临床上更有效。这种分歧可能是由几个因素造成的。首先，大多数临床前研究检查了抗血管生成药物对可移植、快速生长的原发性肿瘤的影响，而大多数抗血管生成药已被批准用于转移环境中自发发生、缓慢发展的癌症或患者的晚期疾病。基因工程小鼠的自发性肿瘤模型也不能概括人类疾病的各个方面。人类和小鼠在恶性肿瘤、血管形成和基质微环境方面的差异导致了不同的反应。其次，只有少数临床前研究分析了抗血管生成药物在细胞消融治疗后残留疾病或辅助治疗中的作用，并且通常不进行化疗。第三，临床前小鼠研究中使用的剂量通常高于给患者的剂量，从而在小鼠中产生更显著的抗血管和抗肿瘤作用。第四，大多数遗传学研究使用在肿瘤形成之前相关血管生成基因已被删除的小鼠，这与癌症检测到后对患者进行的药物干预不同。最后，由于成本和其他因素，临床上抗血管生成药物和化疗药物的剂量和时间表尚未优化¹⁴。

血管内皮生长因子阻滞剂的临床抗血管生成作用

几种血管内皮生长因子阻滞剂已被批准用于癌症和眼病的临床治疗^6,7到目前为止，美国食品和药物管理局已批准使用VEGF-中和抗体贝伐单抗（Avastin）治疗转移性结直肠癌、转移性非鳞状非小细胞肺癌、转移性乳腺癌、复发性多形性胶质母细胞瘤（GBM）和转移性肾细胞癌（RCC）(表1). 此外，一些阻断VEGF等通路信号传导的多靶点TKI已经获得批准，包括索拉非尼（奈沙瓦）治疗转移性RCC和无法切除的肝细胞癌，以及舒尼替尼（苏门汀）和帕佐帕尼（沃特丽特）治疗转移的RCC(表1). 最近，vandetanib（Zactima）已被批准用于无法切除或转移的甲状腺髓样癌，舒尼替尼已被推荐用于晚期胰腺神经内分泌肿瘤，但临床数据尚未公布。VEGF抑制剂治疗通常可延长癌症反应患者数月的生存期(表1). 两种抗血管内皮生长因子化合物-玻璃体内注射血管内皮生长因子适体聚乙二醇（Macugen）和抗血管内皮生长因子Fab抗体雷尼珠单抗（Lucentis）-已被批准用于治疗湿性（新生血管）型年龄相关性黄斑变性，该变性因新血管渗漏而导致失明。Bevacizumab也用于这种情况。

尽管取得了这些成功，但VEGF阻滞剂在癌症患者中的临床应用表明，抗血管生成治疗比预期更具挑战性。例如，VEGF受体TKIs在某些癌症中作为单一疗法有效，但在其他癌症中无效或与化疗联合时有毒^6,14只有当贝伐单抗与细胞毒性或细胞因子疗法联合使用时（GBM患者除外），才允许使用贝伐单单抗。许多转移性疾病患者对VEGF抑制剂耐药⁴⁶和识别应答者的生物标记缺失¹⁴在最近的一项试验中，贝伐单抗延长了转移性RCC患者的无病进展，但没有延长患者的总体生存期⁷⁶，在佐剂设置中没有表现出益处⁷⁷此外，关于抗血管生成疗法是否会导致癌细胞变得更加恶性的问题已经开始出现^78,79。造成这些问题的原因是什么？可以采取什么措施来向前推进？下一节的讨论并没有回答肿瘤学实践中的日常挑战，但为制定未来策略提供了一些途径。

晚期癌症对VEGF阻断的难治性

部分癌症患者对VEGF抑制剂治疗无效⁴⁶不同癌症的难治性程度不同，微转移性和大转移性疾病不同，不同类型的VEGF阻滞剂也不同。患者可能具有内在的难治性，在治疗过程中从未表现出任何治疗反应，或产生回避抵抗。已经提出了几种机制来解释这些现象，这些机制与肿瘤细胞、内皮细胞或其他基质细胞的变化有关^6,14,46,80(图3). 值得注意的是，这些机制仅在晚期大转移性疾病中被确定。

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图3

肿瘤对血管内皮生长因子靶向治疗耐药的潜在机制

一些癌症患者对VEGF阻断的抵抗机制不同。这些机制并不是唯一的，很可能在单个肿瘤中同时发生几种。一在已确诊的肿瘤中，VEGF阻断会加剧缺氧，从而上调其他血管生成因子的生成或增加肿瘤细胞的侵袭性。获得其他突变的肿瘤细胞也可以耐缺氧。较恶性的肿瘤细胞显示为深绿色、蓝色和紫色细胞。b条其他肿瘤血管形成模式，包括肠套叠、血管生成拟态、将假定的癌干细胞（CSC）分化为内皮细胞（EC）、血管生成性血管生长和血管合作（均由镶嵌红紫色血管表示），可能对VEGF阻断不太敏感。c（c）周细胞覆盖的肿瘤血管（绿色）对VEGF阻断不太敏感。d日新招募的促血管生成BMDC（黄色）、巨噬细胞（蓝色和紫色）或活化的癌相关成纤维细胞（CAF；橙色）可以通过产生促血管生成因子来拯救肿瘤血管化。

由于其他促血管生成分子的产生，肿瘤血管生成在更晚期可以成为独立于VEGF的，因此对VEGF阻断反应较差。VEGF阻断后血管退化引起的缺氧也可以启动更具侵袭性和转移性的程序，而在其他情况下，癌（干）细胞在获得额外突变时可能会出现低氧耐受性，并在缺氧的环境中生存。VEGF阻断可抑制新生血管的生成，但在抑制其他肿瘤血管形成模式方面可能没有那么有效，这些模式依赖于骨髓基质干细胞的募集、血管共生、血管生成拟态或血管分裂。某些肿瘤，如胰腺癌，含有低血管基质，因此对抗血管生成药物不太敏感。血管内皮生长因子（VEGF）阻断后的血管修剪可加剧缺氧，导致PlGF、FGFs、趋化因子和肾上腺素等血管生成因子的上调，这可能拯救肿瘤血管化⁴⁶一些肿瘤内皮细胞表现出细胞遗传学异常和转化干细胞潜能的迹象⁸¹这可能会改变对VEGF抑制的敏感性。此外，GBM-like干细胞可以分化为肿瘤内皮细胞，而VEGF阻滞剂只能部分抑制这一过程⁴。

其他基质细胞有助于抵抗VEGF阻断。缺氧促进血管活性BMDC的招募，包括TEM、TAM、中性粒细胞、肥大细胞和CD11b⁺GR-1级⁺（也称为ITGAM⁺赖氨酸6G⁺)髓源性抑制细胞，释放血管生成信号，如VEGF、BV8（也称为PROK2）和MMPs⁸²VEGF阻断通常与化疗相结合-通过使内皮细胞对细胞毒性损伤敏感，VEGF抑制剂损害内皮细胞的存活和再生，但化疗后骨髓间充质干细胞的补充可使肿瘤血运重建（“血管生成性反弹”）^6,83癌相关成纤维细胞释放PDGF-CC等血管生成因子也有助于抵抗。此外，大多数肿瘤中的血管被少数周细胞所覆盖，但一些癌症中的微血管具有致密的周细胞膜和厚厚的基底膜；这种成熟血管通常对VEGF阻滞剂不太敏感^31,32了解这些对抗VEGF阻断的癌型依赖性耐药机制的分子基础为改进抗血管生成治疗提供了机会。

佐剂环境中的VEGF阻断剂

根据VEGF抑制剂治疗大转移癌的临床经验，预计VEGF阻断剂在辅助治疗（即原发肿瘤手术切除后）中对微转移疾病有益。然而，与单纯化疗相比，微转移性疾病患者的辅助治疗联合贝伐单抗和化疗未能延长三年后的无病生存期⁷⁷抗血管内皮生长因子抗体最初延长了患者的无病生存期，但三年后这种益处消失了。造成这种情况的确切原因尚不清楚。微转移瘤细胞可能对抗血管内皮生长因子治疗反应较低，因为它们处于血管生成休眠状态⁸⁴促血管生成BMDC的招募可能会将微转移转化为大转移，但VEGF阻断是否会消除这一拯救途径尚不清楚。另一个假设是，如动物模型中记录的那样，血管生成反弹发生在抗血管内皮生长因子治疗停止后⁸⁵然而，GBM患者在长期使用泛血管内皮生长因子受体TKI治疗后并没有发生这种血管反弹⁸⁶。

另一个问题是，抗VEGF治疗的短暂无病生存益处是否归因于疾病性质的改变，以及VEGF阻断是否导致癌症在最初延迟后变得更恶性。一些临床前模型显示，VEGF阻断会加剧缺氧并诱导促肿瘤原发性炎症状态，尽管会抑制原发性肿瘤生长和延长生存期，但仍会促进侵袭和转移^78,79然而，另一项临床前研究报告，VEGF阻断对佐剂环境下的转移没有影响⁸⁷，临床试验尚未显示VEGF阻断后恶性肿瘤或肿瘤生长反弹的增加，至少在转移性环境中没有。此外，最近的一项随机II期试验表明，持续给药和间断给药（开药四周和停药两周）舒尼替尼对肾细胞癌患者的疗效相同。最后，对晚期癌症的荟萃分析表明，VEGF阻断不会加重转移性疾病⁸⁸复发性GBM是一个例外，VEGF阻断增加了肿瘤的侵袭性，但即使在这些研究中，肿瘤也可能变得更恶性，因为治疗延长了生存期，并使癌症进一步发展。总的来说，迫切需要提高对血管生长和抗血管生成治疗抵抗的机制性理解，尤其是在微转移性病变中。

肿瘤血管异常作为未来靶点

另一个可以决定抗血管内皮生长因子治疗总体疗效的参数是肿瘤血管的异常性质。肿瘤血管在其结构和功能的几乎所有方面都变得异常⁸⁹它们是异质的，曲折的，分支混乱，血管腔不均匀。除了内皮细胞异常外，周细胞和基底膜也异常。由于肿瘤血管的泄漏，溢出的液体会升高间质液体压力。因此，血液流动是不均匀的，氧气、营养物质、免疫细胞和药物分布不均。由于放射治疗和许多化学治疗依赖于氧自由基的形成来杀死癌细胞，肿瘤缺氧会降低其疗效。这些血管异常创造了一个不利的环境，其特征是缺氧、低pH值和高流体压力，这可以选择更多的恶性肿瘤细胞，并降低它们通过泄漏血管逃逸的屏障。

这些发现为未来提出了问题。过度的血管修剪和抗血管生成药物的生长抑制可能通过增加缺氧和产生原发性炎症状态而加剧肿瘤的侵袭和转移。血管正常化可以提供新的治疗机会，减缓肿瘤的侵袭和扩散，增加肿瘤对化疗和放疗的反应⁸⁹另一个考虑因素是血管正常化应如何与抗血管生成治疗相结合。血管正常化首先在结肠癌异种移植小鼠中被发现，并用抗血管内皮生长因子抗体治疗，但在小鼠和患者中是暂时的^14,89,90最近对小鼠的遗传研究表明，持续的血管正常化可以带来益处。事实上，内皮细胞中氧传感器PHD2的单倍型可诱导肿瘤血管持续正常化，而不会改变血管密度或大小⁷²在这些血管中，渗漏、扭曲和重塑减少，而内皮细胞静止、屏障收紧和血管成熟增加，这些变化促进灌注并减少缺氧⁷²此外，还形成了流线型的单层方阵内皮细胞，为肿瘤细胞的灌注提供了更难以穿透的屏障⁷²这些变化不会影响肿瘤生长，但会降低肿瘤细胞的侵袭性、灌注性和转移性⁷²虽然这些基因研究提供了一个很好的例子，但挑战将是制定治疗策略，将这些见解转化为临床的日常实践。

未来的方向

一个重要的问题是如何改进抗血管生成药物。在短期内，应优化目前抗VEGF药物的使用。鉴于低应答率，向前迈出的一步是发现预测性生物标志物，以在大量无应答患者中识别应答者。到目前为止，只有少数候选的预测性生物标志物被确定，但它们是从小型研究中产生的，需要在独立的随机试验中进行前瞻性验证¹⁴另一个考虑因素是抗血管生成药物给药的剂量和持续时间的优化。对于微转移病灶的血管形成机制知之甚少，需要阻断其他肿瘤血管形成模式的药物（如协同作用、肠套叠、血管生成和血管生成拟态）。此外，了解VEGFR TKI和抗VEGF抗体之间的机制差异（例如，前者是否作为单一疗法有效，因为它们抑制多个靶点，而后者在大多数情况下需要联合化疗）将有助于优化抗癌治疗的设计。

在中期，抗血管内皮生长因子药物可以与临床研究中检测到的靶向逃逸途径的药物结合使用（而不是在小鼠中）。示例包括ANG-2、PlGF、SDF-1α和CXCR4（参考。14). 挑战在于何时添加第二种药物——在抗血管内皮生长因子治疗之前、期间或之后。从长远来看，基于最近确定的靶点的血管归一化药物的治疗潜力应在临床前模型中进行评估，但其临床开发需要多年时间。通过使用组合治疗方法，探索根除大多数肿瘤血管和使残余血管正常化的时间比目前仅使用VEGF阻滞剂能够实现的时间更长将是非常重要的。肿瘤血管正常化对提高抗癌免疫治疗的潜力有待进一步探索。最后，重要的是测试批准的抗VEGF药物和正在开发的药物是否可以用于治疗以异常血管系统为特征的各种非恶性疾病，这些疾病折磨着全世界数百万人，在许多情况下没有有效的治疗方法，如导致失明的年龄相关性黄斑变性，神经鞘瘤导致听力丧失，动脉粥样硬化斑块导致破裂后中风和心肌梗死^14,91临床前研究和临床研究的紧密结合对实现这些目标至关重要。

致谢

脚注

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