美国国家科学院院刊。2013年7月23日；110(30): 12420–12425.
PTEN缺失定义了弥漫性大B细胞淋巴瘤的PI3K/AKT通路依赖性生发中心亚型
,一 ,b条 ,c（c） ,一 ,一 ,一 ,一 ,一 ,一 ,一 ,一 ,一 ,d日 ,
b条 ,c（c） ,d日和a、，1 马蒂亚斯·菲弗
一德国柏林慈善大学血液学、肿瘤学和肿瘤免疫学系，13353；
迈克尔·克劳
b条菲利普斯大学物理系，35032马尔堡，德国；
迪多·伦泽
c（c）德国柏林慈善大学病理学研究所，12203；和
Sören-Sebastian Wenzel先生
一德国柏林慈善大学血液学、肿瘤学和肿瘤免疫学系，13353；
安妮特·沃尔夫
一德国柏林慈善大学血液学、肿瘤学和肿瘤免疫学系，13353；
布里吉特·沃尔夫·沃尔夫
一德国柏林慈善大学血液学、肿瘤学和肿瘤免疫学系，13353；
科尔斯汀·迪特泽
一德国柏林慈善大学血液学、肿瘤学和肿瘤免疫学系，13353；
亨德里克·诺盖
一德国柏林沙里特大学血液学、肿瘤学和肿瘤免疫学系，13353；
本杰明·斯托克
一德国柏林慈善大学血液学、肿瘤学和肿瘤免疫学系，13353；
汉内洛尔·马德尔
一德国柏林慈善大学血液学、肿瘤学和肿瘤免疫学系，13353；
伯恩德·德肯
一德国柏林沙里特大学血液学、肿瘤学和肿瘤免疫学系，13353；
马丁·詹兹
一德国柏林慈善大学血液学、肿瘤学和肿瘤免疫学系，13353；
斯蒂芬·迪恩霍夫
d日瑞士巴塞尔4031大学医院病理研究所
伦兹
b条菲利普斯大学物理系，35032马尔堡，德国；
迈克尔·汉梅尔
c（c）德国柏林慈善大学病理学研究所，12203；和
亚历山大·赞科夫
d日瑞士巴塞尔4031大学医院病理研究所
乔治·伦茨
一德国柏林慈善大学血液学、肿瘤学和肿瘤免疫学系，13353；
一德国柏林慈善大学血液学、肿瘤学和肿瘤免疫学系，13353；
b条菲利普斯大学物理系，35032马尔堡，德国；
c（c）德国柏林慈善大学病理学研究所，12203；和
d日瑞士巴塞尔4031大学医院病理研究所
通讯作者。 已编辑*由德国柏林Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine的Klaus Rajewsky于2013年6月12日批准（2013年3月24日收到供审查） 作者贡献：M.P.、M.J.和G.L.设计的研究；M.P.、D.L.、S.-S.W.、A.W.、B.W.-W.、K.D.、H.N.和H.M.进行了研究；M.J.、M.H.和A.T.贡献了新的试剂/分析工具；M.P.、M.G.、S.-S.W.、B.S.、B.D.、S.D.、P.L.、M.H.、A.T.和G.L.分析数据；M.P.和G.L.写了这篇论文。
- 补充资料
支持信息
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摘要
弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是一种具有不同分子亚型的异质性诊断类别，可通过基因表达谱进行定义。然而，即使在这些定义的亚型中，异质性仍然普遍存在。为了进一步阐明这些实体的发病机制，我们测定了248例原发性DLBCL患者样本中抑癌磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）的表达。这些分析表明，55%的生发中心B细胞样（GCB）DLBCL可检测到PTEN的丢失，而这种异常仅在14%的非GCB DLBCL患者样本中发现。在GCB DLBCL中，PTEN状态与DLBCL细胞系和主要患者样本中致癌PI3K/蛋白激酶B（AKT）通路的激活呈负相关。PTEN通过抑制PI3K/AKT信号转导，在PTEN缺乏的GCB DLBCL细胞株模型中重新表达PTEN诱导的细胞毒性，表明该GCB DLBC亚群对该途径有依赖性。PI3K/AKT抑制诱导转录因子MYC下调。MYC的重新表达使GCB DLBCL细胞免于PTEN诱导的毒性，确定了DLBCL中MYC表达的调控机制。最后，药物PI3K抑制导致PTEN缺陷GCB-DLBCL株选择性毒性。总之，我们的结果表明，PTEN缺失定义了一种依赖PI3K/AKT的GCB DLBCL亚型，该亚型对PI3K和MYC信号有依赖性，并表明药物抑制PI3K可能是治疗这些淋巴瘤的一种有前景的方法。
弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是最常见的淋巴瘤亚型，被认为是一种异质性诊断类别(1). 通过基因表达谱分析，可以区分两种主要的分子亚型，即生发中心B细胞样（GCB）DLBCL和活化B细胞样DLBCL(2). GCB DLBCL来源于生发中心B细胞，而ABC DLBCL则来源于处于分化为浆细胞过渡期的生发后中心B细胞。然而，在ABC DLBCL中，不同的遗传异常抑制BLIMP1调节浆细胞分化的功能，从而阻止了血浆细胞的完全成熟(3–5).
最近的工作表明PI3K/蛋白激酶B（AKT）通路的组成性激活在通过磷酸化AKT（p-AKT）免疫组织化学染色测定的大量DLBCL患者样本中的生长、增殖和细胞存活中起着关键作用(6,7). 然而，这些研究并没有研究导致PI3K/AKT信号传导的分子机制。抑癌基因PTEN是PI3K/AKT的主要负调控因子。PTEN作为一种脂质磷酸酶，使磷脂酰肌醇-3，-4，-5-三磷酸的3′位去磷酸化，从而触发AKT活化(8,9). 然而，最近的研究表明PTEN具有额外的PI3K/AKT非依赖性肿瘤抑制功能。例如，核PTEN通过上调参与DNA修复的RAD51发挥着保护基因组完整性的作用(10). 此外，核PTEN可以通过促进APC/C与CDH1的结合来增强APC/C的E3连接酶活性。这些复合物降解癌蛋白，如polo样激酶1和极光激酶(11,12).
导致DLBCL中PI3K/AKT信号构成性激活的分子机制仍不清楚。在ABC DLBCL中，约20%的患者样本存放在港口CD79A型或CD79B型突变，导致慢性活性B细胞受体信号传导促进PI3K/AKT活化(13). 相反，约10%的GCB DLBCL的特征是PTEN公司轨迹。有趣的是，在ABC DLBCL中未检测到这些畸变，这表明PTEN在GCB DLBCL发病机制中的作用(14).
在本研究中，我们研究了PTEN在DLBCL生物学中的功能作用。我们检测到PTEN表达在大多数GCB DLBCL中丢失。PTEN缺失与这些淋巴瘤中PI3K/AKT的激活呈负相关，从而确定了PTEN缺乏PI3K依赖的GCB DLBCL亚群。PTEN缺陷细胞中PTEN的再表达诱导了由PI3K/AKT信号抑制和转录因子MYC下调引起的毒性。最后，我们发现PI3K的药物抑制对PTEN缺乏的GCB DLBCL具有毒性，从而确定PI3K是这些淋巴瘤的潜在靶点。
结果
PTEN在DLBCL子类型中有不同表达。
为了研究分子DLBCL亚型中PTEN的表达，我们对34例DLBCL患者样本进行了PTEN的免疫组织化学染色，这些样本通过基因表达谱分为ABC、GCB和未分类的DLBCL（队列1）。扁桃体染色建立免疫组织化学检测PTEN(n个=8）和正常淋巴结(n个= 2) ()以及PTEN阳性和阴性DLBCL细胞系。不出所料，扁桃体和正常淋巴结中的绝大多数细胞染色呈阳性。PTEN在高达80%的中心体细胞和高达50%的中心核母细胞中检测到表达。此外，滤泡间区和滤泡周区60-80%的细胞被PTEN染色。为了检测在DLBCL中完全失去PTEN表达的样本，我们应用<5%阳性淋巴瘤细胞的阈值来区分PTEN阳性和阴性样本。DLBCL细胞系TMD8、OCI-Ly10和OCI-Ly19通过免疫组织化学表达PTEN，而所有其他细胞系（OCI-Ly、BJAB和HT）均未检测到PTEN水平(). 如下所示，这些免疫组化结果证实了我们的Western blot数据(). 在队列1中，共有22个原始DLBCL样本（65%）表达PTEN。然而，PTEN在分子DLBCL亚型中的表达频率不同。八分之七（88%）的ABC DLBCL和八分之六（75%）的未分类DLBCL表达PTEN。相比之下，18个（50%）GCB DLBCL中只有9个检测到PTEN水平(P（P）= 0.08; PTEN在GCB DLBCL中的表达与其他亚型的比较；费希尔精确测试）。
PTEN在DLBCL亚型中有差异表达。(A–F)免疫组织化学PTEN染色(A类)扁桃体(B)表达PTEN的ABC DLBCL细胞系TMD8(C类)PTEN阴性细胞株HT(D类)PTEN阳性DLBCL病例(E类)一例PTEN阴性DLBCL病例，内部对照阳性（肿瘤浸润淋巴细胞），以及(F类)1例PTEN阴性DLBCL患者，内部控制（血管）阳性。（放大倍数：A类，120倍；B和C类，400倍；D–F型, 320×.) (G公司)与非GCB DLBCL相比，GCB中通过免疫组织化学测定的PTEN丢失更频繁(P（P）= 2.1 × 10−11). (H（H）)DLBCL细胞系PTEN表达和AKT磷酸化分析。在GCB DLBCL细胞系中，PTEN表达和p-AKT状态呈负相关。条表示不同的斑点。OCI-Ly1细胞被用作两个印迹上p-AKT的内部阳性对照。用pan-PI3K抑制剂Ly294002处理的OCI-Ly1细胞作为p-AKT的阴性对照。(我)PTEN表达和p-AKT状态在GCB DLBCL原代样本中呈负相关。条表示不同的斑点。患者样本12被用作两个印迹上p-AKT的内部阳性对照。
为了调查第二个明显较大的患者队列，我们分析了249例原发性DLBCL患者样本的独立队列中PTEN的表达（队列2）；214个样本（86%）可用于PTEN染色(). 在这个队列中，71例（44%）GCB DLBCL中只有31例PTEN阳性。相比之下，143例非GCB DLBCL中124例（87%）表达PTEN(P（P）= 1.0 × 10−10; 费希尔精确测试）。结合这两个队列的结果，我们在89例（55%）GCB DLBCL患者样本中的49例中检测到PTEN丢失，而在159例非GCB DLBC患者样本中只有22例（14%）(P（P）= 2.1 × 10−11; 以<10%的阳性淋巴瘤细胞为界的PTEN表达结果在表S1) (). 这些结果表明(我)PTEN的丢失几乎只在GCB DLBCL和(二)PTEN表达式将GCB DLBCL划分为两个子集。
接下来，我们分析了建立的DLBCL细胞系是否代表了功能分析的适当模型。为此，我们通过Western blotting筛选了14个DLBCL细胞系的PTEN表达(). 所有三种ABC DLBCL细胞系均检测到PTEN表达，而只有四种GCB DLBCL系表达PTEN的水平相当（OCI-Ly2、OCI-Ly 7、OCI-Ly19和DB）。相反，11个GCB DLBCL细胞系中有7个（64%）PTEN完全丢失，表明这些细胞系代表了足够的功能模型。
不同的分子机制导致PTEN丢失。
确定PTEN公司10q23位点有助于PTEN的丢失，我们对12个DLBCL细胞系（TMD8、OCI-Ly10、HBL-1、OCI-Ly1、OCI-Ly2、OCI-Ly7、BJAB、HT、SUDHL-10、K422、DB和RL）进行了阵列比较基因组杂交（aCGH）。我们检测到杂合子PTEN公司仅在GCB DLBCL细胞系（SUDHL-10、OCI-Ly1、K422和DB）中出现缺失(,图S1A类、和表S2). 在OCI-Ly1、K422和SUDHL-10中，未检测到PTEN蛋白表达，表明第二个等位基因沉默(). 相反，在DB细胞中，PTEN蛋白水平并没有降低，表明第二种蛋白的表达PTEN公司等位基因(). 我们进行了定量基因组PCR以确认这些结果，并确定PTEN公司两个附加细胞系（OCI-Ly4和OCI-Ly19）中的拷贝数。该测定在除OCI-Ly1外的所有细胞系中复制了aCGH数据，其中检测到纯合缺失(图S1B和表S2). OCI-Ly1 DNA的PCR分析证实PTEN公司影响外显子6-9的第二等位基因缺失(图S1C类)aCGH没有检测到。要确定PTEN公司主要患者样本中的拷贝数状态，我们将此定量PCR检测应用于队列1的所有34个DLBCL样本。我们检测到杂合子PTEN公司删除18个GCB DLL中的3个和8个ABC DLL中的1个(和表S3).
在GCB-DLBCL中，PTEN被不同的分子机制解除调控。(A类)SUDHL-10细胞的特征是PTEN公司轨迹。(B)分析PTEN公司DNA拷贝数使用定量PCR。每个条形代表一个患者样本。(C类)PTEN域的示意图概述。显示了GCB（橙色）和ABC（蓝色）DLBCL样本中检测到的突变。
为了研究体细胞突变是否导致DLBCL中PTEN的丢失，我们对PTEN公司在我们的14个DLBCL细胞系和34个主要DLBCL患者样本（队列1，表S4). 以前的工作表明PTEN公司突变率相当低(15–17). 然而，这些分析并没有研究突变是否优先发生在某些分子DLBCL亚型中。我们在四种细胞系中检测到突变，这些细胞系均来自GCB DLBCL患者（OCI-Ly4、SUDHL-10、K422和RL）(和图S2A–D). 这些突变导致氨基酸改变、终止密码子或帧移位。PCR产物的克隆和测序表明，两个细胞系（SUDHL-10和RL）在同一等位基因上有两个突变(和图S2A类和B). 有趣的是，所有受影响的细胞系都没有检测到PTEN表达(). 此外，我们检测到PTEN公司一个初级GCB和一个ABC DLBCL患者样本的突变。这两种畸变都是通过身体获得的，因为它们在相应的非肿瘤DNA中无法检测到(图S2E类和F类). 受影响的ABC DLBCL患者样本通过免疫组织化学检测到PTEN水平。相反，GCB DLBCL样本PTEN完全阴性(图S2G公司). 全部PTEN公司突变仅限于磷酸酶和C2结构域。磷酸酶结构域对PTEN的磷酸酶活性至关重要，而C2结构域已被证明影响膜结合和膜表面磷酸酶结构区的生产取向(12,18). 总的来说，我们的结果表明PTEN公司突变很少见，但似乎与GCB DLBCL中PTEN的丢失有关。
结合我们的突变和拷贝数分析，我们检测到了单等位基因PTEN公司DB、OCI-Ly4和RL细胞以及两个初级GCB和两个ABC DLBCL样品中的失活，而K422、SUDHL-10、OCI-L1和GCB DLBCL样本028的特征是双等位基因PTEN公司损失。
接下来，我们研究转录因子MYC是否参与DLBCL中PTEN的调节。研究表明，MYC通过上调microRNA-17-92（miR-17-92）下调PTEN表达(19,20). 为此，我们评估了来自队列1和2的283个患者样本中的128个（45%）是否存在MYC公司使用FISH进行易位。在GCB DLBCL中，我们发现7例MYC公司易位和1例携带MYC公司扩增（8/46；17%）。相比之下，82个（2%）非GCB DLBCL中只有2个窝藏MYC公司易位(P（P）= 0.004). 然而，MYC畸变与PTEN丢失无关，因为8个GCB DLBCL中只有2个与PTEN缺失相关MYC公司与38例（47%）无PTEN异常的患者中的18例相比，PTEN异常为阴性MYC公司像差(P（P）= 0.44).
PTEN丢失定义了添加到PI3K/AKT信令的GCB DLBCL子集。
为了研究PTEN丢失是否与PI3K/AKT信号通路的组成性激活有关，我们对p-AKT进行了Western blotting，并将其用作PI3K/AKT激活的替代物。在GCB DLBCL细胞系中，我们检测到PTEN表达与p-AKT水平呈负相关。除RL外，无PTEN表达的细胞株AKT（OCI-Ly1、OCI-Ly 4、BJAB、HT、SUDHL-10和K422）的基础磷酸化水平较高，RL仅显示较低的p-AKT水平(). 相反，所有PTEN表达的GCB DLBCL细胞系的p-AKT水平均较低或检测不到（OCI-Ly2、OCI-Ly 7、OCI-L19和DB）(). 为了确定这种PTEN丢失和AKT磷酸化的反向模式是否也在原发性DLBCL样本中检测到，我们从8个PTEN阳性和12个PTEN缺乏的GCB DLBCL患者样本中获得了蛋白质样本(表S5). p-AKT的Western blotting证实了负相关，因为所有PTEN缺失的样本都检测到p-AKT水平（12/12），而八个PTEN表达的样本中只有两个样本的AKT磷酸化。其余病例的p-AKT水平未被检测到或极低(P（P）= 7.2 × 10−4; 双侧Fisher精确试验）(). 相反，组成性AKT磷酸化与ABC DLBCL细胞系PTEN丢失无关。尽管PTEN表达，但所有株系都检测到AKT磷酸化，这表明不同的分子机制激活了ABC和GCB DLBCL中的PI3K/AKT通路().
为了从功能上研究PTEN在DLBCL中的意义，我们用一个PTEN公司cDNA。我们的表达载体共表达GFP，允许我们监测GFP的比例+与GFP相比−细胞随时间的变化作为共存毒性的度量PTEN公司cDNA。PTEN的表达对所有PTEN缺乏的GCB DLBCL细胞株都是致命的(). 相反，PTEN阳性的GCB和ABC DLBCL细胞株在引入PTEN后没有表现出任何毒性，尽管表达水平相似(和图S3A类). 为了进一步了解PTEN表达的生长抑制作用的本质，我们测量了细胞增殖和凋亡。为此，我们转导了BJAB、HT和K422细胞PTEN公司cDNA和SNARF-1染色分析细胞增殖情况。通过流式细胞术测量活细胞中SNARF-1的稀释度来研究细胞分裂。PTEN表达显著抑制HT增殖(P（P）= 1.6 × 10−17)和K422(P（P）= 5.1 × 10−33)细胞与空载体对照的比较(). 相反，对于BJAB细胞来说，增殖抑制是无法检测到的(P（P）= 0.52). 为了研究PTEN是否诱导凋亡，我们测定了凋亡的Annexin-V+/公元7年−之后的单元格PTEN公司cDNA转导。有趣的是，PTEN表达在BJAB细胞中选择性诱导凋亡，而在HT和K422中未检测到凋亡增加(). PTEN再表达后作为凋亡标志物的裂解半胱天冬酶3和9的增加证实了BJAB细胞的凋亡诱导(图S3B).
PTEN缺乏的GCB DLBCL对PI3K/AKT信号上瘾。(A类)PTEN再表达诱导PTEN缺乏的GCB DLBCL细胞株产生毒性。显示了至少八个独立重复的代表性结果。(B)PTEN再表达或空白载体对照后2天和6天测量SNARF-1稀释度。在BJAB细胞中，未检测到细胞增殖的差异(P（P）= 0.52). 相反，HT(P（P）= 1.6 × 10−17)和K422(P（P）= 5.1 × 10−33)PTEN再表达后细胞增殖减少。(C类)PTEN的再表达可诱导BJAB细胞凋亡，但不能诱导HT或K422细胞凋亡（通过Annexin V染色的增加测定）。误差条指示SD(D类)与HT细胞中的PTEN WT相比，DLBCL样本中检测到的不同PTEN突变体的表达水平降低。(E类)与PTEN WT相比，PTEN突变体在PTEN缺乏的GCB DLBCL细胞系BJAB和HT中诱导毒性降低或无毒性(F类)通过对HT细胞中p-AKT的Western blotting测定，WT PTEN突变株G129E和C124S抑制PI3K/AKT信号传导，但不抑制磷酸化PTEN突变。(G公司)磷酸酯酶敏感的PTEN突变体G129E在DLBCL细胞系中不诱导毒性。(H（H）)组成活性AKT等位基因可使PTEN缺乏的GCB DLBCL细胞系BJAB、HT和RL免受PTEN诱导的毒性。
调查PTEN公司我们在GCB DLBCL样本中发现的突变，我们将这些突变引入GCB DLBC细胞系。逆转录病毒转导后的Western blotting显示，PTEN突变体（SUDHL-10中检测到的D162H突变体除外）的表达水平显著低于PTEN WT，表明这些突变体的稳定性降低(). PTEN缺陷的GCB DLBCL细胞系中突变体的毒性降低或缺乏反映了这种表达模式，但D162H异常除外(和图S3C类). 这些分析表明，绝大多数检测到的突变都是功能丧失突变。相反，D162H突变可能代表PTEN变体。
为了阐明GCB-DLBCL中PTEN丢失的成瘾是否由PI3K/AKT信号通路的组成性激活所致，我们引入了先前描述的磷酸酯酶非活性PTEN突变体（G129E和C124S）(11)在PTEN缺乏的GCB DLBCL细胞系中不能抑制PI3K/AKT信号(). 这些分析表明，PTEN缺陷的GCB DLBCL细胞系不受这些突变体表达的影响，表明PTEN诱导的毒性是由PI3K/AKT信号的抑制引起的(和图S3D类). 我们的观察进一步支持了这一假设，即先前描述的组成型活性AKT等位基因的异位表达(21)从PTEN诱导的毒性中完全拯救PTEN缺陷的GCB DLBCL细胞().
PI3K/AKT信号调节GCB-DLBCL中MYC的表达。
接下来，我们研究了PTEN在PTEN缺乏的GCB DLBCL细胞系BJAB、HT和K422中表达的分子效应。正如预期的那样，PTEN表达显著抑制了通过p-AKT测量的PI3K/AKT信号以及通过p70S6K磷酸化测量的雷帕霉素（mTOR）信号的下游机制靶点(). 为了进一步了解PTEN表达对生物过程的影响，我们分析了在HT细胞中引入PTEN后基因表达的变化。一般来说，更多的基因上调（546个基因；P（P）<0.01）比下调（279个基因；P（P）<0.01）。为了进行生物学解释，我们使用了更严格的截止值，并确定了72个显著下调的基因(P（P）<0.0025）和82个上调的基因(P（P）<0.00025）在PTEN诱导后的所有时间点(和表S6). PTEN诱导参与一般细胞过程的各种基因的表达，如细胞周期控制(CCNG2公司,CDKN1B型、和CDKN2C型)，细胞增殖(行动4,拉萨尔1、和FBXO32型)和B细胞和T细胞受体信号(FYN公司,第1页、和美国残疾人协会). 为了更好地了解全局基因表达变化，我们使用先前描述的基因表达特征数据库进行了无偏见的基因集富集分析(22). 该分析表明，最显著的下调基因集是先前描述的MYC靶基因特征(P（P）≤ 0.001; 错误发现率=0.001）(和表S7). 此外，另一个独立的MYC靶基因集显著富集了下调基因，表明MYC活性受到PTEN诱导的抑制(P（P）≤ 0.001; 错误发现率=0.008）(表S7). 因为MYC公司PTEN诱导后，mRNA水平仅略微下调(P（P）=0.054），我们研究了MYC是否受到PTEN表达的转录后调控。事实上，在GCB-DLBCL细胞系中PTEN再表达下调了MYC蛋白()或使用pan-PI3K抑制剂Ly294002抑制PI3K(图S4A类). 为了研究这种作用是否是通过调节GSK3β活性和随后在苏氨酸58（T58）处MYC磷酸化介导的，我们对PTEN转导的HT细胞中磷酸化的GSK3α和磷酸化的T58-MYC进行了Western blotting。事实上，我们检测到PTEN表达后磷酸化GSK3β减少，随后磷酸化T58-MYC增加(). 这些数据表明PTEN表达导致MYC蛋白酶体降解增加。
PTEN丢失上调GCB DLBCL中的MYC。(A类)PTEN再表达降低AKT和p70S6K的磷酸化。(B)PTEN在HT细胞中重新表达后的基因表达谱。在诱导后的指定时间点对基因表达的变化进行分析PTEN公司cDNA。基因表达变化根据所示色标进行描述。重点介绍了参与关键生物过程的基因。(C类)先前描述的MYC基因表达特征的基因集富集分析。PTEN再表达后，MYC信号显著下调。(D类)PTEN再表达下调PTEN缺乏的GCB DLBCL细胞系BJAB、HT和K422中的MYC蛋白。(E类)PTEN再表达激活GSK3β，导致T58处MYC磷酸化。(F类)MYC表达可使BJAB和HT细胞免受PTEN诱导的毒性。给出了具有代表性的实验。(G公司)shRNA介导的MYC敲除对PTEN阳性和缺陷的GCB-DLBCL细胞系是有毒的。显示了具有代表性的结果。(H（H）)PTEN缺乏的GCB DLBCL细胞系对使用pan-PI3K抑制剂Ly294002抑制PI3K敏感。显示了具有代表性的结果。
为了评估MYC基因敲除对PTEN诱导毒性的影响程度，我们进行了一个救援实验，其中我们引入了一个MYC公司PTEN转导的BJAB和HT细胞中的cDNA或空载体。我们检测到MYC诱导的大量解救，表明MYC敲除对PTEN表达的致死效应有显著作用(和图S4B). 为了证实MYC对PTEN缺乏的GCB DLBCL细胞系生存的关键作用，我们使用两种不同的特异性shRNAs敲除其表达(图S4C类). 正如预期的那样，MYC敲除对所有PTEN缺乏细胞系都是有毒的(和图S4D类和E类). 然而，PTEN阳性GCB DLBCL细胞系同样受到MYC敲除的影响，因为它们表达相似的MYC蛋白水平(和图S4D类和F类).
最后，我们询问对PI3K/AKT通路的成瘾是否可以用于PTEN缺乏的GCB DLBCL的治疗。为此，我们用pan-PI3K抑制剂Ly294002处理PTEN阳性和缺失的GCB DLBCL细胞系，并在培养4天后测定细胞活力。5μM Ly294002浓度显著降低了所有三种PTEN缺乏的GCB DLBCL细胞系（K422、OCI-Ly1和HT）的细胞活力()而PTEN阳性细胞系的细胞活力不受影响（OCI-Ly2、OCI-Ly 7和OCI-Lyl19）。这些数据揭示了PI3K/AKT信号在细胞存活中的重要作用，这种作用可以通过药物阻断，因此可能代表了对PTEN缺失的GCB DLBCL患者的治疗方法。
讨论
在本研究中，我们检测到（在两个独立的主要DLBCL患者队列中）肿瘤抑制因子PTEN在分子DLBCL亚型中有差异表达。我们发现大多数GCB DLBCL患者样本失去PTEN表达，而这种异常在其他DLBCL亚型中很少发生。在GCB DLBCL中，PTEN丢失与PI3K/AKT信号通路的组成性激活呈负相关。相反，GCB DLBCL患者样本和PTEN表达的细胞系很少显示出该通路的激活，这表明PTEN的丢失是GCB DLBC中PI3K/AKT激活的主要机制。PTEN的再表达对PTEN缺乏的GCB DLBCL细胞株是致命的，并显著抑制PI3K/AKT信号传导。这些结果表明，这些GCB DLBCL依赖于PI3K/AKT信号，因此，可能被视为以前未被认可的依赖于PI3G/AKT信令的GCB DLBC子集。
DLBCL中PTEN丢失的分子机制有多种。我们检测到PTEN公司此外，我们发现PTEN公司与早期研究的范围相似(15–17). 功能分析表明，大多数突变都是由稳定性降低引起的功能丧失改变。有趣的是，所有受影响的细胞系均来自GCB DLBCL患者样本，支持PTEN缺失在该实体发病机制中的作用。此外，PTEN蛋白在所有受影响的细胞系中丢失，这表明PTEN沉默的其他分子机制。同样，在携带3-bp缺失的GCB DLBCL患者中，通过免疫组织化学不能检测到PTEN蛋白。在大多数GCB DLBCL中发现PTEN完全缺失是显著的。先前在前列腺癌方面的研究表明，在WT p53的背景下，PTEN公司单倍体不足可能比PTEN完全缺失更容易致癌(23,24). 相反，在p53缺失的晚期恶性肿瘤中，PTEN完全失活比PTEN公司单倍不足。因此，需要额外的工作来区分PTEN公司在DLBCL治疗中，与完全PTEN丢失相比，单倍体不足。
在大多数GCB DLBCL患者样本中，我们无法揭示PTEN沉默的分子模式。仅在三个细胞系和一个初级GCB DLBCL患者样本中，我们就能够发现双等位基因PTEN公司失活，而各种细胞系和患者样本显示出单等位基因沉默。目前尚不清楚是否丢失一个PTEN公司等位基因足以诱导DLBCL中PI3K/AKT激活，因为DB细胞系含有杂合子PTEN公司缺失没有检测到p-AKT水平。由于GCB和ABC DLBCL表达类似水平的PTEN mRNA(P（P）= 0.69;n个=350个患者样本）(25)DLBCL中PTEN的转录后或翻译后调控似乎非常可能。多种miR，如miR-17-92或miR-21，参与PTEN表达的调控(20,26). 同样，PTEN假基因PTENP1公司已经证明通过作为PTEN靶向miR的诱饵来调节PTEN水平(27). 有趣的是PTENP1公司该位点在各种恶性肿瘤中选择性丢失。因此，这些分子机制可能有助于GCB-DLBCL中PTEN沉默。
我们的工作强调了DLBCL中MYC调节的一种以前未被认可的分子机制。在GCB-DLBCL中，PTEN缺失通过PI3K/AKT通路的组成性激活导致MYC上调。PTEN的引入以及PI3K通路的药物抑制均显著下调了各种PTEN缺乏GCB DLBCL细胞系中MYC的表达。最近对Burkitt淋巴瘤的研究表明，MYC和PI3K通路协同平衡MYC的促凋亡特性(28,29). 在GCB DLBCL中，PI3K/AKT信号通过抑制GSK3β增加MYC表达，这是一种以前在其他血液恶性肿瘤中检测到的机制，如B细胞和T细胞急性淋巴细胞白血病，但在DLBCL没有检测到(30,31).
我们评估了在GCB-DLBCL中是否可以利用PTEN丢失和PI3K/AKT组成通路激活进行治疗。PI3K抑制对PTEN缺乏的GCB DLBCL模型具有选择性毒性。相反，PTEN阳性细胞系对PI3K抑制均无反应。我们的结果表明，GCB DLBCL患者可以根据其PTEN状态进行分层治疗。预计PTEN阴性患者对PI3K/AKT的抑制有反应，而PTEN的表达很可能与治疗抵抗有关。这些结果强调了临床试验中使用特定抑制剂来检测对这些化合物有优先反应的患者亚群的患者样本特征描述的必要性。
材料和方法
患者样本。
治疗前，从新发DLBCL患者身上获取肿瘤活检标本。所有样本均按照巴塞尔大学医院和柏林慈善大学医学院当地机构伦理审查委员会批准的方案进行研究。
细胞培养、逆转录病毒构建和转导。
细胞培养条件和逆转录病毒转导在SI材料和方法.
免疫组织化学。
本研究中使用了先前描述的含有249个主要DLBCL的组织微阵列(32). 应用Tally算法将病例分类为GCB或非GCB DLBCL(33). 此外，还调查了34个主要DLBCL样本，这些样本分为ABC、GCB或未分类的DLBCL。如前所述，使用来自cell Signaling的初级单克隆抗体138G6，以1:100的稀释度，在PTEN阳性和阴性DLBCL细胞系、八个扁桃体和两个正常淋巴结上建立PTEN染色(34). PTEN染色是由两位专业的血液病理学家建立的。当存在内部阳性对照时，可对病例进行评估。为了确定完全PTEN阴性的DLBCL病例，我们采用了<5%阳性细胞的下限值。利用这个截止点，我们能够在不同的DLBCL细胞系中重现Western blotting检测到的表达水平。
致谢
这项工作得到了菲利普斯大学马尔堡分校博士奖学金（授予M.G.）和德国研究基金会、德国克雷布什尔大学和Else Kröner-Fresenius-Stiftung（授予G.L.）的研究资助。
工具书类
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