膜结合PKCαC2结构域的膜对接几何和靶脂化学计量学：分子动力学和实验研究

摘要

介绍

C2结构域是一个分布广泛、保守的信号基序，通常参与Ca²⁺-触发膜对接。^1-4它首先在普遍存在的信号酶蛋白激酶Ca中发现，其中它是第二个保守（C2）结构域。⁵人们早就知道Ca²⁺结合可以通过钙的直接结合驱动PKCαC2结构域与质膜的对接²⁺将站点与其目标PS头组绑定。⁶

然而，最近发现，在生理钙²⁺PKCαC2结构域的特异性质膜对接需要第二个靶脂质PIP₂以及PS。^三,7,8在细胞中，所有内膜都含有PS，但只有质膜具有显著水平的PS和游离PIP₂.PIP的识别₂对于分离的PKCαC2结构域和全长PKCα的质膜靶向至关重要。^三,7,8PIP₂结合位点是C2结构域β3-β4发夹上4个赖氨酸残基的保守簇。两种或两种以上赖氨酸的中和降低了对含有PIP的质膜样膜的C2结构域亲和力₂在体外并降低活细胞的质膜特异性。^三,7,8

全长PKCα亲本蛋白具有另一个脂质结合基序，即C1结构域和C2结构域。¹然而，C1结构域与目标脂质二酰甘油结合不足以驱动靶向反应。相比之下，Ca²⁺-C2结构域与PS和PIP的受激结合₂足以驱动PKCα的质膜靶向，是控制细胞迁移、生长、基因调节、代谢和激素释放的信号通路中的一个中心分子事件。^1,三,7,8其他C2结构域的一个重要亚群（包括其他传统蛋白激酶C和突触素亚型）也具有结合PIP的赖氨酸簇₂，证明PIP₂识别是许多C2域控制通路的中心特征。^三

最近的EPR对接几何研究表明，当PKCαC2结构域与含有PS但缺乏PIP的膜结合时₂，畴平放在膜表面，其长轴几乎平行于双层平面。⁹相反，C2结构域结合到含有PS和PIP的膜上₂表现出倾斜的几何形状，使得畴的长轴旋转远离膜平面，从而使倾角增加40±10°。⁹后一个PS（+）PIP₂脂质结合方式也表现出明显更高的膜结合亲和力和结合态寿命。⁷很可能这两种结合模式都存在于细胞条件下，这增加了PKCα酶的构象和活性可能受局部PIP变化的调节的可能性₂质膜表面的密度。⁹总之，增强了对PKCαC2结构域与其PS和PIP结合的分子理解₂靶脂将阐明细胞信号传递中的一类基本调节事件。

在本报告中，PKCαC2结构域与PS和PIP的结合₂通过EPR引导的分子动力学（MD）模拟研究了双层表面上的分子生物信息学并通过实验结合测量在体外EPR引导的MD模拟为C2畴膜复合体的结构、化学计量和动力学提供了新的见解。令人惊讶的是，模拟预测在足够高的PIP下₂两个相邻的PIP可以同时占据赖氨酸簇的密度₂分子。随后的结合测量证明了这种预测的极限PIP₂化学计量是正确的。这些发现进一步说明了计算和实验相结合的方法的威力。

结果

分子动力学模拟

方法中提供了如何执行MD模拟的详细描述。简单地说，模拟是使用PKCαC2结构域的两种实验EPR膜对接几何形状开始的⁹定义绑定到POPC/POPS（1:1）混合双层的C2域的初始状态。在一次模拟中，初始状态是EPR对接几何形状，其中Ca²⁺结合囊和赖氨酸簇都与PS分子相关。在另外两个模拟中，初始状态是EPR对接几何体，其中Ca²⁺结合囊与PS相关，而赖氨酸簇与PIP相关₂后两个模拟包括一个或两个PIP₂双层中的分子。因此，这三种模拟有效地模拟了不同PIP的质膜微环境₂密度，称为（−）PIP₂，（+）PIP_2（一）和（+）PIP_2（二）.

图1a-c显示了（−）PIP生成的平衡膜对接几何形状₂，（+）PIP_2（一）和（+）PIP_2（二）模拟和图2显示了C2域对接几何体在仿真期间的时间稳定性。在（−）PIP中₂模拟结果表明，平衡对接几何体的倾斜角度为7°±2°，C2域核的β链几乎与膜表面平行(图1a和图2). 在（+）PIP中_2（一）模拟，用一个PIP占据赖氨酸簇₂头部组件使膜域的长轴远离膜平面旋转，产生37°±2°的显著较大倾斜角(图1b和图2). 在（+）PIP中_2（二）模拟，用两个PIP占据赖氨酸簇₂头群（后者在图中显示为红色和橙色）也会导致β链远离膜平面，产生中间倾斜角（30°±1°）(图1c和图2). 模拟结果表明，C2结构域接触的脂质总量随着倾斜角度的增加而减少，从（−）PIP中的18个开始₂在（+）PIP中添加14种脂质_2（一）和（+）PIP_2（二）状态，如所示图3应注意，从（+）PIP开始的模拟₂缺少PIP时C2域的EPR对接几何₂也执行了（数据未显示）。在此模拟中，C2域的初始倾斜对接几何在20 ns内松弛为平面对接几何。

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图1

脂质双层上PKCαC2结构域的分子动力学模拟

由C2域和（a）缺乏PIP的双层膜₂;（b）包含一个PIP的双层₂分子；和（c）含有两个PIP的双层₂分子。这些模拟被称为（−）PIP₂，（+）PIP_2（一）和（+）PIP_2（二）分别是。脂类显示为灰色，PS头部组显示为小的粉红色球体，由K197、K199、K209和K211侧链形成的赖氨酸簇为蓝色球体。K205附近也被蓝色球体高亮显示。在（+）PIP中_2（一）系统，PIP₂头部组显示为红色球体；英寸（+）PIP_2（二）系统中，两个PIP2头组的红色和橙色球体的颜色不同。在每种情况下，通过放置C2域（PDB条目1DSY，⁶在1:1的POPC/POPS混合脂质双层表面，用两个结合的钙离子（黄色球体）绘制成带状）。C2结构域位于双层贴片的中心，其初始穿透深度和相对于双层表面的角度与先前通过EPR分析确定的对接几何形状相匹配⁹如图所示，零、一个或两个PIP₂分子被放置在赖氨酸簇附近。该初始系统按照方法中所述进行平衡，然后进行30ns无约束MD模拟，在此过程中为该图拍摄了一张代表性的单帧快照。矢量（橙色箭头）可操作地定义了核心β-三明治的长轴（来自Ca²⁺501到N206的Cα原子）。平面（虚线）表示脂质骨架磷酸基团的平均位置。在没有PIP的情况下₂膜结合C2结构域的长轴几乎平行于双层表面，倾斜角度为7°±2°。一个PIP的绑定₂赖氨酸簇使结构域偏离膜平面，产生37°±2°的倾斜角，而两个PIP的结合₂产生30°±1°的中间倾斜角。通过将30 ns的模拟分成5 ns的部分，对六个时间块的平均倾斜角进行平均，计算出每个倾斜角及其标准偏差。

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图2

对接几何体的时间稳定性

显示了在每次30 ns模拟期间三种不同C2畴膜复合体的时变倾角。详细信息见图1图例。（−）PIP₂，黑线；（+）PIP_2（一），绿线；和（+）PIP_2（二），蓝线。

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图3

接触结合C2结构域的脂质

来自（−）PIP的快照₂和（+）PIP_2（二）模拟，分别突出显示与C2结构域接触的18个和14个脂质头组。（+）PIP的脂质足迹_2（一）模拟（未显示）与（+）PIP无法区分_2（二）模拟。两个PIP₂头部组的颜色不同，如红色和橙色球体，与C2域接触的其他头部组为灰色球体。

模拟中观察到的几个参数可以与文献中的测量参数进行比较。（−）PIP₂模拟，如没有PIP的EPR对接几何分析₂，产生一个方向，域长轴几乎平行于膜平面。⁹此外，（−）PIP之间的倾斜角度差为30°±4°₂和（+）PIP_2（一）模拟结果与EPR测得的40°±10°的实验倾角差在误差范围内一致⁹其中含有PIP的膜的主要结合态₂C2域是否绑定到单个PIP₂分子（在EPR研究中，PIP水平为2摩尔%，这产生了一个结合的PIP₂每个C2域的分子-见讨论）。同样，（−）PIP预测的18种接触脂质₂模拟结果在误差范围内与之前定义的足迹脂质数量上限14±4相一致，该上限是针对缺乏PIP的膜的结构域结合进行测量的₂.¹⁰最后，（−）PIP₂模拟表明C2结构域主要接触带电/极性脂质头组，这与之前观察到的这种状态的静电对接机制一致，与细胞溶质磷脂酶A2 C2结构域的疏水性对接机制相反，该结构域渗透到双层烃核中，不会被高离子强度所取代。^10,11

除了与先前的实验观察结果相类似外，模拟还得出了新的预测，即赖氨酸簇可以自发地与一个或两个PIP结合₂分子放置在附近，产生稳定的1:1或2:1 PIP₂结合化学计量。最近的实验研究表明赖氨酸簇结合PIP₂,^三,7,8但一般认为赖氨酸簇只结合一个PIP₂分子和这种1:1的化学计量比在自由C2结构域和分离的PIP之间的晶体络合物中观察到₂头部组IP_三.¹²因此，两个相邻PIP的明显结合₂分子令人惊讶。

项目实施计划₂化学计量测量

通过实验测量PIP₂化学计量，PKCαC2结构域与PIP的结合₂使用已建立的蛋白质-膜FRET分析（参见方法^13,14). 确保实验测量饱和PIP₂化学计量，选择驱动结合反应完成的条件（在超声处理的单层膜囊泡中为10摩尔%）。因此，当膜滴定到样品中时，可用的PIP₂膜表面的分子立即被蛋白质占据，蛋白质到膜的FRET线性增加，直到所有蛋白质分子都与膜结合，形成一个简单的线性平台（成功化学计量测定的标志），如图所示图4a.三次重复测量的化学计量结果为2.1±0.1 PIP₂每个C2结构域的分子，证实C2结构域结合两个PIP的能力₂MD模拟预测的分子。确保化学计量受到PIP的限制₂结合，而不是通过蛋白质足迹的大小，对低2倍的PIP进行了另一种化学计量测定₂密度（5摩尔%）。这种滴定也产生了接近两个PIP的化学计量比₂每个C2结构域的分子数（1.7±0.1），表明平台是由饱和PIP定义的₂化学计量比，而不是蛋白质分子在膜表面紧密堆积。

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图4

PKCαC2结构域与PIP的结合₂-包含膜

采用标准蛋白-膜FRET分析定量25°C下膜结合C2结构域^13;14.（a）PIP的确定₂化学计量。含有固定PIP的靶膜₂摩尔分数被滴定为固定浓度的C2结构域。选择条件驱动高亲和力PIP₂结合，使滴定产生膜相关C2结构域的线性增加，直到所有蛋白质结合并达到平台。线性增加和高原区域的最佳拟合直线的交点表示饱和点，得出2.1 PIP₂在这个典型示例中，每个C2域的分子数。使用的靶膜是含有10摩尔%PIP的声波单层囊泡₂在类脂混合物中模拟质膜内小叶。样品含有1.0μM C2结构域和10μM游离Ca²⁺生理缓冲液中：25 mM HEPES，pH 7.4，KOH，140 mM KCl，15 mM NaCl，0.5 mM MgCl₂和足够的EDTA生成所需的游离[Ca²⁺]（见方法）。（b）PIP分析₂合作性。含有指定PIP摩尔分数的靶膜₂添加以在固定浓度的C2结构域中产生固定的总脂质浓度。选择条件模拟细胞质钙²⁺信号。对于这个典型的例子，得到的膜结合曲线与希尔方程的非线性最小二乘最佳拟合结果为5.1±0.4，但对这种明显的正合作性的解释是复杂的（见讨论）。样品含有60μM总脂质（成分见（a））、0.5μM C2结构域和1μM游离Ca²⁺在生理缓冲液中（见（a））。

因为C2域可以绑定两个PIP₂分子，PIP的可能性₂结合反应具有正协同性。第二次滴定实验是在更接近生理钙的条件下进行的²⁺信号。这种滴定法固定了钙的浓度²⁺（1μM）、C2结构域（0.5μM）和总脂质（60μM），同时增加PIP的密度₂SUV中的摩尔百分比从0到20。如所示图4b在三个重复中，得到的蛋白-膜FRET结合曲线的Hill系数为6±2。该Hill系数与多个PIP的合作绑定一致₂分子。然而，如下文讨论中所述，PIP₂结合反应很复杂，有几个因素促成了明显的正合作性，因此观察到的希尔系数可能高估了合作PIP的数量₂结合位点。

讨论和总结

当赖氨酸簇被其靶配体PIP滴定时，这些发现共同提供了PKCαC2结构域三种不同的膜对接状态的分子视图₂在所有三个州²⁺结合位点与膜表面的PS相关，但赖氨酸簇的脂质占用状态不同。在没有PIP的情况下₂赖氨酸簇与PS头组相结合，形成一种膜对接几何形状，其中核心β-三明治的长轴几乎平行于膜平面。MD模拟揭示了这种平行几何形状，最初由EPR对接几何形状分析定义，⁹确实很稳定(图2)并且相对于膜平面的倾斜角度为7°±2°。中间PIP₂密度MD模拟描述了先前预期的赖氨酸簇与单个PIP结合的第二状态₂分子，由于PIP的尺寸较大，长轴相对于膜平面倾斜37°±2°₂头部组。最后，在较高的PIP下₂密度MD模拟预测了赖氨酸簇稳定结合PIP两个分子的第三种新状态₂，相对于薄膜平面，倾斜角度略有减小，为30°±1°。直接结合测量证实这是赖氨酸簇的饱和结合状态(图4a). 目前和以前的研究共同提供了EPR对接几何分析、MD模拟和直接结合测量所定义的三种对接状态的详细、自洽的分子视图。

两种PIP的饱和化学计量比₂MD模拟预测并经实验证实的每个C2结构域的分子数与C2结构域和可溶性PIP单分子之间的复合体的最新晶体结构形成了对比₂与赖氨酸簇结合的类似物。¹²对于这个明显的矛盾，至少可以提供两种解释：（i）与可溶性PIP相反₂，膜结合PIP的头部₂具有强烈的空间约束，这可能导致肌醇环的不同结合几何结构，或（ii）水性PIP之间的环境差异₂和双层嵌入式PIP₂可能以复杂的方式改变结合反应。与可溶性和膜结合PIP的想法一致₂具有不同的结合几何形状，IP的晶体结构_三复合物揭示了IP之间的直接联系_三和保守残基Tyr 195和Trp 245。¹²相比之下，MD模拟没有检测到PIP之间的直接接触₂以及这两个残基。相反，（+）PIP_2（一）和（+）PIP_2（二）模拟显示直接PIP₂与残基Lys 197、Lys 209和Lys 211接触，并且从晶体结构中也观察到这些接触。然而，在MD模拟中，与Lys 197、Lys 209和Lys 211的接触仅限于PIP的4-和5-磷酸基团₂它们暴露在双层表面上，而在晶体结构中，还观察到与1-磷酸根的接触，而在双层中，1-磷酸根更难接触到。

在细胞内的生理条件下，膜结合C2结构域群体可能包括此处描述的所有三种状态：（−）PIP₂，（+）PIP_2（一）和（+）PIP_2（二）这一结论来自于全球质膜PIP₂密度（2摩尔%）远低于产生一半最大蛋白质结合所需的水平(图4b)，而PIP的局部密度₂由于脂蛋白微结构域具有高PIP，因此认为质膜中存在异质性₂水平。¹⁵因此，C2域位于PIP低的区域₂密度可以由零或一个PIP占据₂分子，而C2结构域位于高PIP中₂密度区域可能具有两个束缚PIP₂分子。由于这些不同的PIP₂化学计量学产生不同的薄膜倾角(图1)倾斜角度原则上可以调节激酶结构域的活性，这种不同的化学计量学可能提供PKCα激酶活性的局部调节。₉

PIP滴定时观察到的大希尔系数（6±2）₂摩尔密度(图4b)与PIP中的积极合作一致₂与C2结构域结合，但可能高估了协同PIP的数量₂结合位点。对于简单的缔合反应，两个配体与一对正合作位点的结合将产生不大于2.0的希尔系数。然而，Ca²⁺-C2结构域与膜表面的触发结合表现出一些复杂性，使协同性分析复杂化。作为PIP的密度和浓度₂在反应中增加钙²⁺-游离蛋白质更有可能结合PIP₂在膜表面，这将大大增加其对钙的亲和力²⁺这种效应被称为靶激活信使亲和力或TAMA，⁷将增加视希尔系数。增加的PIP₂密度还增加了膜表面的负电荷，并加强了其与C2结构域的碱性区域（包括赖氨酸簇）的非特异性静电相互作用，从而进一步增加了表观希尔系数。最后，PIP的任何趋势₂以高摩尔密度聚集将促进赖氨酸簇与相邻PIP的结合₂分子，再次增加表观希尔系数。因此，虽然PIP观测到的希尔系数较大₂摩尔密度滴定与PIP的数量没有直接关系₂分子与C2结构域结合，进一步支持了PIP局部变异的假设₂质膜上的密度可以改变PKCαC2结构域与生理钙的对接²⁺浓缩并调节全长PKCα的激酶活性。

总之，MD模拟预测PKCαC2结构域的赖氨酸簇被两个PIP的结合饱和₂分子通过直接PIP确认₂膜表面的结合测量。生理学PIP₂密度可能与单个PIP结合₂分子，但在PIP₂密度高，两个PIP饱和₂可能会出现分子。赖氨酸簇是C2结构域的一个重要子集共享的保守基序，这表明一系列重要的信号通路可能通过在由零、一个或两个PIP占据的不同膜结合状态之间切换而得到很好的调节₂分子。

方法

鸣谢

脚注

工具书类