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分子细胞。作者手稿；PMC 2013年6月29日提供。
以最终编辑形式发布为：
分子细胞。2012年6月29日；46(6): 833–846.
2012年5月9日在线发布。 数字对象标识：2016年10月10日/j.molcel.2012.04.07
预防性维修识别码：项目经理3389276
NIHMSID公司：NIHMS370271
PMID：22575674

SH3BP4是氨基酸-Rag GTPase-mTORC1信号的负调控因子

Young-Mi Kim（金永美）,1 马特·斯通,1 黄泰贤,2,三 延吉·金,4 简·R·邓利维,5 蒂莫西·格里芬,1和Do-Hyung Kim先生1,2,*
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补充资料

总结

氨基酸通过激活mTORC1刺激细胞生长并抑制自噬。氨基酸激活mTORC1是由溶酶体上的Rag鸟苷三磷酸酶（GTPase）异二聚体介导的。氨基酸调节Rag GTPase异二聚体的分子机制尚待阐明。在这里，我们确定SH3BP4（SH3域结合蛋白4）是Rag GTPase复合物的结合蛋白和负调节蛋白。在氨基酸饥饿条件下，SH3BP4通过其Src同源性3（SH3）结构域与非活性Rag GTPase复合物结合，并抑制活性Rag-GTPase复合物的形成。因此，这种结合消除了mTORC1与Rag GTPase复合物的相互作用以及mTORC2向溶酶体的募集，从而抑制氨基酸诱导的mTORCl活化和细胞生长，促进自噬。这些结果表明，SH3BP4是Rag GTPase复合物和氨基酸依赖性mTORC1信号的负调控因子。

简介

在真核生物中，氨基酸不仅作为蛋白质的构建块，而且作为细胞生长的信号转导介质。氨基酸，特别是分支链氨基酸（如亮氨酸）的信号传递功能主要通过哺乳动物雷帕霉素靶点（mTOR）介导，雷帕霉素是一种从酵母到哺乳动物的保守的Ser/Thr激酶。mTOR与猛禽相互作用形成mTOR复合物1（mTORC1），根据氨基酸、葡萄糖和生长因子的可用性调节蛋白质合成、细胞生长和自噬(Hara等人，2002年;Jung等人，2010年;Kim等人，2002年;Loewith等人，2002年). 在包括前列腺癌、多发性骨髓瘤和错构瘤综合征在内的许多人类癌症中发现了mTORC1的过度激活，并且mTOR调节受损也与糖尿病、肥胖和衰老有关(Goberdhan和Boyd，2009年;Harrison等人，2009年;Selman等人，2009年;Um等人，2004年;Wullschleger等人，2006年). 鉴于mTOR的广泛功能及其在许多人类疾病和生理状态中的意义，了解氨基酸依赖性mTORC1信号的机制非常重要。

氨基酸通过Rag GTPases激活mTORC1，Rag GTPases在从酵母到哺乳动物的真核生物中进化保守(Binda等人，2009年;Kim等人，2008年;Sancak等人，2008年). 哺乳动物细胞有四种Rag GTPase：RagA、RagB、RagC和RagD(Sekiguchi等人，2001年). Rag GTP酶与其他小GTP酶不同，因为它们形成由RagA或RagB和RagC或RagD组成的异二聚体复合物(Dubouloz等人，2005年;Hirose等人，1998年;Kim等人，2008年). 在酵母中，Gtr1p和Gtr2p分别是RagA和RagC的同源物，它们形成了一个异二聚体复合物，与Rag GTPase复合物起着类似的作用(Binda等人，2009年;Dubouloz等人，2005年). Rag GTPase异二聚体的活性取决于RagA和RagB是否与GTP或GDP结合。含有GTP-结合的RagA或RagB的Rag GTPase复合物在刺激mTORC1以响应氨基酸方面是活跃的，而含有GDP-结合RagA和RagB复合物是不活跃的(Kim等人，2008年;Sancak等人，2008年).

最近的研究发现了Rag GTPases的几种结合蛋白。Ragulator是一种溶酶体蛋白复合物，结合Rag GTPase复合物并使其能够将mTORC1募集到溶酶体膜上，其中mTORC2被Rheb GTPases激活(Sancak等人，2010年). Ragulator还被证明与空泡H（+）-腺苷三磷酸酶（v-ATP酶）结合，该酶根据溶酶体腔中的氨基酸调节Rag GTPase(Zoncu等人，2011年). 在果蝇属，Rag GTPases与丝裂原活化蛋白4激酶3（MAP4K3）相互作用(Bryk等人，2010年). 在哺乳动物细胞中，MAP4K3根据氨基酸调节mTORC1(芬德利等人，2007年;Yan等人，2010年). Rag GTPases与p62（SQSTM1）相互作用，p62是一种通过自噬降解的泛素结合蛋白(Duran等人，2011年). 它们还调节mTORC1定位到TOR-自噬空间耦合室（TASCC）(成田等人，2011年)表明Rag-mTORC1通路和自噬之间存在密切的串扰。最近，人们发现亮氨酸tRNA合成酶（LRS）以氨基酸依赖的方式与RagD相互作用，并作为RagD的GTP酶激活蛋白（GAP）发挥作用(Han等人，2012年). 在酵母中，Vam6p被鉴定为Gtr1p的结合蛋白和Gtr1p的鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）(Binda等人，2009年). 尽管这些研究为Rag GTP酶的调节提供了重要的见解，但氨基酸调节Rag GTP酶活性的分子机制仍不清楚。

在这项研究中，我们描述了一种Rag GTPase-binding蛋白SH3BP4的发现，该蛋白负调控Rag GTPase-mTORC1信号传导。我们确定SH3BP4在亮氨酸缺失的条件下与非活性Rag GTPase复合物结合，并抑制活性Rag-GTPase复合物的形成，从而抑制mTORC1信号传导。我们发现，SH3BP4对mTORC1信号传导的抑制作用取决于SH3PP4和Rag GTPases之间的相互作用，后者由SH3BP4SH3结构域介导。基于这些发现，我们将SH3BP4定义为Rag GTPase复合物和氨基酸依赖性Rag GTPase-mTORC1信号的负调控因子。

结果

作为Rag GTPase-binding蛋白的SH3BP4的鉴定

为了鉴定与Rag GTPases结合的蛋白质，我们在HEK293T细胞中稳定表达了标记的RagB，并通过标记亲和层析分离出RagB结合蛋白。按照我们之前描述的程序制备用于质谱分析的样品(Vander Haar等人，2007年) (图S1A)，我们鉴定了用标记的RagB特异性洗脱的蛋白质。经鉴定的蛋白质池中含有RagC和RagD，证实我们的纯化分离出了RagB的生理结合伙伴。该池中还含有一种称为SH3BP4或TTP（转铁蛋白受体转运蛋白）的蛋白质，这是一种脊椎动物特有的963氨基酸蛋白质，先前研究表明它能结合dynamin和Eps15（表皮生长因子受体途径底物15）并调节转铁蛋白接受器（TfR）的内吞(Tosoni等人，2005年). 该蛋白具有一个SH3结构域、三个与Eps15同源结构域结合的NPF基序，以及与氯氰菊酯介导的内吞有关的蛋白质的假定结合位点(图1A) (Dunlevy等人，1999年). TTP是锌指蛋白三四脯氨酸的缩写，从我们的研究中可以明显看出，它的功能独立于TfR。因此，根据HUGO基因命名委员会的命名法，该蛋白在本手稿中被命名为SH3BP4。

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SH3BP4优先结合Rag GTPases的GDP结合状态

(一个)SH3BP4结构特征示意图。SH3BP4具有一个LIDL基序（一个假定的氯菊酯结合基序）、一个SH3结构域、三个NPF重复序列（假定的Eps15同源结构域结合位点）、一种WxxF基序（假定的AP2结合位点）和一个线圈（CC）区域。(B类)SH3BP4与Rag GTPases相互作用。HA-标记的SH3BP4与myc标记的构建物在HEK293T细胞中共同表达。通过Western blotting（WB）分析与myc标记构建物共同免疫纯化的HA-SH3BP4的量。PA-PLA和S6K1是控制蛋白。(C类)SH3BP4直接与Rag GTPases结合。用WB分析谷胱甘肽树脂固定的GST（对照）或GST标记Rag GTPase结合的SH3BP4量。蛋白质是由细菌制备的(D类)SH3BP4优先与RagB结合国内生产总值和RagC国内生产总值在HEK293T细胞中用HA标记的SH3BP4表达标记的RagB和RagC WT或突变体。WB分析与标记Rag GTPases结合的HA-SH3BP4的数量。箭头指向IgG带。(E类)SH3BP4直接与RagB结合国内生产总值通过WB分析与标记的Rag GTP酶结合的SH3BP4的量。这些蛋白质是从细菌中纯化出来的(F类)SH3BP4优先与非活性Rag GTPase复合物结合。Myc-tagged Rag WT和突变体在HEK293T细胞中表达。WB分析与内源性SH3BP4共同免疫纯化的Rag GTPases的数量。Arl1用作对照。(G公司)SH3BP4与非活性Rag复合体结合，但与活性Rag复合物不结合。Rag GTPases和SH3BP4在HEK293T细胞中表达。WB分析与RagC共免疫纯化的SH3BP4和RagB的数量。(H（H）)SH3BP4与RagB共定位国内生产总值但几乎没有WT或RagBGTP公司通过荧光显微镜观察在HeLa细胞中瞬时表达的GFP-SH3BP4（绿色）和mCherry RagB（红色）。（插图）高倍放大显示SH3BP4和RagB的共定位国内生产总值（黄色）。细胞核用DAPI（蓝色）染色。比例尺，10µm。右侧的线扫描显示SH3BP4和RagB之间的共定位程度，这与合并图像的插入框中绘制的线相关。

SH3BP4优先结合GDP-结合形式的Rag GTPases

SH3BP4与RagC或RagD联合免疫纯化，但不与细胞溶质S6K1或膜结合PA-PLA作为阴性对照(图1B). 以互惠的方式，RagC与SH3BP4共同免疫纯化，但不与对照蛋白共同免疫纯化(图S1B). 为了确定SH3BP4是否能直接与Rag GTPases相互作用，我们使用纯从细菌中制备的SH3PP4和Rag GTPases进行了谷胱甘肽S-转移酶（GST）下拉分析。使用GST-标记的RagC和RagD下拉SH3BP4s，但几乎不使用GST标记的Rag A和RagB(图1C). 这一结果表明，SH3BP4对单体形式的RagC和RagD的结合亲和力高于RagA和RagB。

为了评估Rag GTPase的核苷酸结合态对SH3BP4和Rag GTPase之间相互作用的影响，我们分析了SH3PP4对模拟GTP或GDP结合态的Rag GTP酶突变体的结合亲和力(Dubouloz等人，2005年;高和凯撒，2006;Hirose等人，1998年;Kim等人，2008年;Sancak等人，2008年;Sekiguchi等人，2001年). RagB野生型（WT）及其模拟GTP结合态的突变体（RagB全球技术伙伴)不与SH3BP4结合，而其突变体模仿GDP结合状态（RagB国内生产总值)能够绑定SH3BP4(图1D和图S1C). 像RagB国内生产总值、RagA国内生产总值还能够绑定到SH3BP4(图S1C). 这一结果表明，SH3BP4可能只与RagA和RagB的GDP束缚态结合，而不与它们的GTP束缚态或不带电态结合。相反，RagC与SH3BP4相互作用，无论其核苷酸结合状态如何（WT、RagC全球技术伙伴，和RagC国内生产总值) (图1D). SH3BP4对RagC有较强的结合亲和力国内生产总值比WT或RagC全球技术伙伴这表明RagB和RagC的GDP束缚态很可能被SH3BP4所青睐。通过在体外通过分析细菌纯化的重组蛋白之间的相互作用，我们确认了RagB国内生产总值可以直接与SH3BP4相互作用，亲和力与SH3PP4-RagC相互作用相当(图1E).

SH3BP4优先与非活性Rag GTPase复合物结合

SH3BP4与RagB的优先结合国内生产总值在RagB上全球技术伙伴促使我们测试SH3BP4是否比活性Rag复合物对非活性Rag复合物具有更高的结合亲和力。尽管RagC和RagC全球技术伙伴因为单体形式可以与SH3BP4结合(图1D)，当它们与RagB共表达时，它们没有与SH3BP4结合全球技术伙伴(图1F和图S1D). 该结果表明RagB全球技术伙伴可能会对RagC或RagC的结合产生负面影响全球技术伙伴至SH3BP4。相比之下，RagC国内生产总值与RagB中的SH3BP4相互作用全球技术伙伴-表达细胞(图1F和图S1D). 然而值得注意的是，含有RagC的免疫复合物国内生产总值和SH3BP4不包含RagB全球技术伙伴，表明RagC国内生产总值与SH3BP4相关的不含RagB全球技术伙伴这表明SH3BP4不会与RagB形成稳定的络合物全球技术伙伴和RagC国内生产总值同时。确认SH3BP4未与RagB形成稳定的相互作用GTP公司-含有活性复合物，我们免疫纯化RagB全球技术伙伴-RagC公司全球技术伙伴和RagB全球技术伙伴-RagC公司国内生产总值来自HEK293T细胞的复合物，并分析SH3BP4的存在。SH3BP4未与RagB联合免疫纯化全球技术伙伴-含络合物(图1G). 这一结果表明，SH3BP4可能无法与活性Rag GTPase复合物形成稳定的相互作用。

另一方面，所有三种形式的RagC（WT，RagCGTP公司和RagC国内生产总值)当它们与RagB共表达时，能够与SH3BP4相互作用国内生产总值(图1F和图S1D). 自RagB以来国内生产总值我们假设SH3BP4可能优先与非活性Rag络合物结合。支持这一假设，SH3BP4与RagB联合免疫纯化国内生产总值-含有非活性络合物，如RagB国内生产总值-RagC公司全球技术伙伴和RagB国内生产总值-RagC公司国内生产总值复合物，来自HEK293T细胞(图1G). 为了进一步验证相互作用，我们监测了SH3BP4对RagB、RagB的共定位全球技术伙伴或RagB国内生产总值在HeLa细胞中。证实了SH3BP4与细胞内无活性Rag GTPase复合物的优先结合，SH3PP4与RagB共定位国内生产总值但仅限于RagB WT或RagB全球技术伙伴(图1H和图S1E–S1G). 综上所述，这些结果表明SH3BP4优先与非活性Rag GTPase复合物结合。

在缺乏亮氨酸的条件下，SH3BP4与Rag GTPases的结合增强

如果SH3BP4优先与不活跃的Rag GTPase复合物结合，我们假设在氨基酸饥饿的情况下，SH3PP4与Rag GTPase的结合可能增加。因为亮氨酸是氨基酸中mTORC1信号传导的最强刺激物(Kim等人，2002年)，我们分析了介质中有无亮氨酸时的相互作用。支持这一假设的是，亮氨酸剥夺增加了内源性水平上SH3BP4恢复的RagB数量(图2A). 亮氨酸缺乏诱导的相互作用上调可以通过HEK293T细胞中过表达的SH3BP4和Rag GTP酶来重现(图2B). 亮氨酸剥夺增强SH3BP4与RagB WT和RagB的相互作用国内生产总值但几乎没有RagB全球技术伙伴.绑定到RagB的SH3BP4数量国内生产总值远大于与RagB WT的结合，正如我们从SH3BP4对RagB更强的结合亲和力中所预期的那样国内生产总值比RagB重量(图1D和E). 我们进一步证实SH3BP4与共表达RagB的关联国内生产总值和RagC国内生产总值在培养基中浓度增加时，亮氨酸逐渐减少(图2C). 这些结果表明SH3BP4与RagB的相互作用国内生产总值，但不使用RagBGTP公司，被亮氨酸剥夺增强。通过对HeLa细胞中GFP-SH3BP4和mCherry-RagB的荧光图像分析，可以证实SH3PP4和RagB之间的亮氨酸依赖性相互作用(图2D和图S2). 综上所述，这些结果一致表明，与Rag GTPases结合的SH3BP4受到亮氨酸的负调控。

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SH3BP4-Rag相互作用受氨基酸调节

(一个)与RagB结合的SH3BP4受氨基酸负调控。HeLa细胞缺乏亮氨酸40分钟，然后以104µg/ml（+）的浓度补充亮氨酸，或在无亮氨酸的情况下进一步培养10分钟（−）。如前所述，培养基中存在所有其他氨基酸(Kim等人，2002年). 利用抗SH3BP4抗体分离内源性SH3BP4。WB分析SH3BP4回收内源性RagB的量。(B类)SH3BP4绑定到RagB国内生产总值受氨基酸负调控。Myc-tagged RagB WT，RagB全球技术伙伴或RagB国内生产总值在HEK293T细胞中用HA-SH3BP4表达。如图2A所示，用亮氨酸处理细胞。WB分析myc-RagB回收的HA-SH3BP4量。(C类)SH3BP4绑定到RagB国内生产总值-RagC公司国内生产总值随着培养基中亮氨酸水平的增加，复合物逐渐减少。表达myc标记RagB的HEK293T细胞国内生产总值和RagC国内生产总值如图2A所示，用亮氨酸（0、1.04、10.4或104µg/ml）处理。用WB分析与内源性SH3BP4共同免疫纯化的Rag GTPases的数量。(D类)亮氨酸剥夺诱导SH3BP4与RagB共定位。GFP标记的SH3BP4在HeLa细胞中与mCherry-RagB共表达。如图2A所示，用亮氨酸处理细胞。荧光显微镜分析SH3BP4与RagB的共定位。比例尺，10µm。

SH3BP4负调控氨基酸-mTORC1信号

知道SH3BP4优先与不活跃的Rag GTPase复合物结合，我们想知道SH3PP4是否调节氨基酸-mTORC1信号。我们首先研究了SH3BP4敲低对mTORC1信号转导的影响，以响应培养基中的亮氨酸。敲除HEK293T、HeLa或MEF中的SH3BP4后，Thr389（mTORC1依赖性磷酸化位点）处亮氨酸刺激的S6K1磷酸化急剧增加(图3A和B以及图S3A). S6K1磷酸化的增加发生在培养基中广泛的亮氨酸浓度范围内(图3B). 当SH3BP4被敲除时，即使在培养基中没有亮氨酸的情况下也能检测到S6K1磷酸化(图S3A,车道1、7). SH3BP4敲除导致S6K1磷酸化上调，这一点可以通过另一个mTORC1靶点Ser65处4E-BP1磷酸化的增加得到证实(图3A). 与SH3BP4对mTORC1信号传导的负面影响一致，SH3PP4的稳定或短暂过度表达几乎完全抑制了HEK293T和HeLa细胞中亮氨酸诱导的S6K1和4E-BP1磷酸化(图3C和图S3B和C).

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SH3BP4负调节mTORC1信号

(一个)SH3BP4敲除增强氨基酸依赖性mTORC1信号传导。用亮氨酸处理SH3BP4 shRNA或打乱shRNA稳定转导的HEK293T、HeLa和MEF，如图2AWB监测细胞裂解液中p-S6K1（Thr389）和p-4E-BP1（Ser65）的水平。(B类)用0、1.04、5.2、10.4、52或104µg/ml的亮氨酸处理由shRNAs稳定转导的HEK293T细胞，如图2A用WB分析p-S6K1水平。(C类)SH3BP4的过度表达抑制了mTORC1信号传导。用亮氨酸（HEK293T为0、1.04、10.4或104µg/ml，HeLa为104µg/ml）处理稳定表达myc-SH3BP4的HEK293 T和HeLa细胞，如图2A用WB分析细胞裂解液中p-S6K1（Thr389）和p-4E-BP1（Ser65）的水平。(D类)SH3BP4对mTORC1信号的负作用与TSC2无关。Myc-SH3BP4和HA-S6K1在TSC2-silenced或打乱siRNA转导的HEK293T细胞中表达。用亮氨酸处理细胞，如图2A用WB分析HA免疫沉淀中p-S6K1的水平。(E类)SH3BP4-Rag相互作用受亮氨酸调节，但不受胰岛素或培养基中葡萄糖的调节。表达myc-RagB的HEK293T细胞国内生产总值将HA-SH3BP4饥饿40分钟以获取亮氨酸或葡萄糖，并补充亮氨酸（104µg/ml）或葡萄糖（11 mM）10分钟。将胰岛素（150 nM）处理至细胞，并在隔夜血清饥饿后培养1小时。用myc-RagB回收的HASH3BP4量国内生产总值WB分析。(F类)TfR敲除并不抑制HEK293T细胞中的mTORC1信号。用亮氨酸处理TfR沉默的细胞，如图2AWB监测p-S6K1水平。(G公司)动力蛋白1和动力蛋白2的缺乏不影响MEF细胞中S6K1的磷酸化。用亮氨酸处理缺乏动力蛋白1和2的MEF，如图2AWB监测p-S6K1水平。

由于mTORC1不仅被氨基酸激活，还被胰岛素和葡萄糖激活，我们研究了SH3BP4可能通过胰岛素或葡萄糖依赖性信号调节mTORC1。因为如果缺乏来自氨基酸、葡萄糖或胰岛素的任何信号，mTORC1就不能被完全激活(Fingar和Blenis，2004年;Sancak等人，2008年;Shamji等人，2003年)，我们预计SH3BP4也会对胰岛素和葡萄糖依赖的mTORC1信号产生抑制作用。正如预期的那样，胰岛素刺激的S6K1磷酸化通过SH3BP4敲除而增强，通过SH3PP4过度表达而抑制(图S3D). SH3BP4的敲除或过度表达均不影响Akt在Ser473的磷酸化状态(图S3D). SH3BP4过表达显著抑制S6K1磷酸化，即使在mTORC1高度活跃的结节性硬化复合物2（TSC2）沉默细胞中也是如此(图3D). 鉴于TSC2在Akt-mTORC1通路中发挥作用，这一结果表明SH3BP4以独立于Akt-TSC2轴的方式调节mTORC1。我们还发现，葡萄糖刺激的S6K1磷酸化通过SH3BP4敲除而增强，通过SH3PP4过度表达而抑制(图S3E). SH3BP4的敲除或过度表达均不影响AMPK在Thr172的磷酸化状态，Thr172是AMPK活性的指示物(图S3E). SH3BP4-RagB国内生产总值在培养基中，相互作用受亮氨酸调节，但不受胰岛素和葡萄糖的调节(图3E)，证实SH3BP4对氨基酸依赖的mTORC1信号具有特异性作用。

我们还考虑了一种可能性，即SH3BP4可能通过TfR的动态内吞作用调节mTORC1，这种内吞作用基于先前报道的SH3PP4的功能(Tosoni等人，2005年). 都没有击倒(图3F)也不过度表达(图S3F)HEK293T细胞中的TfR影响了亮氨酸刺激的S6K1磷酸化。在MEF中缺乏动力蛋白1和动力蛋白2几乎不影响亮氨酸刺激的S6K1磷酸化(图3G)或者只是因为dynamin1的过度表达(图S3G). 我们还考虑了SH3BP4可能通过改变氨基酸摄取来调节mTORC1的可能性。SH3BP4的敲除或过度表达均未引起HEK293T细胞氨基酸摄取的任何显著变化(图S3H和I). 这些结果表明，SH3BP4以独立于TfR、动态蛋白和氨基酸摄取的方式负调控氨基酸-mTORC1信号。

SH3BP4抑制细胞生长并促进自噬

了解到SH3BP4与非活性Rag GTPase复合物结合并抑制mTORC1信号，我们研究了SH3PP4是否对细胞生长和增殖有负面影响。SH3BP4的敲除显著提高了HEK293T和HeLa细胞的增殖率，并增加了HEK2903T细胞的平均大小(图4A-C和图S4). 一直以来，HEK293T细胞中SH3BP4的过度表达显著降低了细胞增殖率(图4D). 我们还研究了SH3BP4是否对mTORC1下游的自噬过程有影响(细川等人，2009年;Jung等人，2009年). SH3BP4过表达增加了内源性微管相关蛋白1轻链3-II（LC3-II）水平和LC3点的形成，并降低了p62的表达水平(图4E-G)所有这些都支持自噬的增加(水岛和吉森，2007年). 这些结果支持SH3BP4在氨基酸-mTORC1通路中的抑制功能。

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SH3BP4负调节细胞生长并促进自噬

(A、 B类)SH3BP4敲除增加HEK293T（A）和HeLa细胞（B）的增殖率。结果表示为平均值±标准偏差（SD）（n=3）。(C类)SH3BP4基因敲除增加了HEK293T细胞的平均大小。对照细胞和SH3BP4细胞的平均±SD细胞直径（µm）分别为16.7±0.08和17.1±0.01。(D类)SH3BP4在HEK293T细胞中的稳定过表达显著降低了细胞增殖率。误差条表示平均值±标准差（n=6）。(E类)SH3BP4促进自噬。稳定表达SH3BP4的HEK293T细胞饥饿亮氨酸30分钟（−），然后补充亮氨酸（104µg/ml）（+）2小时。用WB分析LC3-I、LC3-II和p62的水平。(F类)SH3BP4过度表达诱导LC3点的形成。GFP标记的LC3在HeLa细胞中用HA-SH3BP4表达。空载体（模拟）用作SH3BP4的对照。在荧光显微镜下观察到GFP-LC3点。比例尺，10µm。(G公司)每个细胞GFP-LC3点的定量分析（*，第页<0.001来自学生吨-试验，n=23）。平均值显示为水平条。

SH3BP4抑制Rag GTPase与mTORC1的结合，从而抑制mTORC1-定位于溶酶体

由于SH3BP4与Rag GTPase复合物结合，因此可以合理地推断SH3BP5对mTORC1信号的抑制作用可能通过Rag GTPase复合物介导。如果SH3BP4通过Rag GTPases抑制mTORC1，那么在表达显性负RagB的细胞中，SH3PP4的敲除不会对mTORC2信号产生任何积极影响国内生产总值-RagC公司全球技术伙伴复杂。这种情况是因为SH3BP4敲除并没有增加表达非活性复合物的细胞中S6K1的磷酸化(图5A). 与此结果一致，SH3BP4过度表达并没有抑制表达组成活性RagB的细胞中的mTORC1信号全球技术伙伴-RagC公司国内生产总值复杂(图5B). 综上所述，这些结果表明SH3BP4以依赖Rag GTPase复合物的方式负调控mTORC1信号。

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SH3BP4在Rag GTPases上游起作用，对mTORC1起负调节作用

(一个)Myc-tagged RagB和RagC构建物在打乱shRNA-转导或SH3BP4-silenced HEK293T细胞中用HA-S6K1表达。用亮氨酸处理细胞，如图2A用WB分析HA免疫沉淀中p-S6K1（Thr389）的水平。(B类)Myc-SH3BP4和HA-S6K1在HEK293T细胞中表达Myc-tagged RagB和RagC构建物。用亮氨酸处理细胞，如图2A通过WB分析HA免疫沉淀物中p-S6K1的水平。(C类)SH3BP4负调节溶酶体mTOR定位。GFP标记的SH3BP4或GFP单独（模拟）在HeLa细胞中瞬时表达。转染后两天，用亮氨酸处理细胞，如图2A用mTOR（绿色）和LAMP1（红色）特异性抗体对细胞进行染色，并用荧光显微镜观察。（插图）高倍放大显示mTOR和LAMP1的共定位（黄色）。比例尺，10µm。(D类)SH3BP4抑制Rag GTPases和猛禽之间的相互作用。在HEK293T细胞中，HA标记的猛禽和SH3BP4与myc标记的RagB和RagC共表达。WB分析用myc-Rag GTPases共免疫纯化的HA-受体数量。

之前的研究表明，RagA全球技术伙伴和碎布GTP公司与RagC或RagD形成活性Rag GTPase复合物，与猛禽结合，从而将mTORC1招募到溶酶体中，以激活mTORC2(Sancak等人，2010年). 由于SH3BP4通过Rag GTPases抑制mTORC1，因此我们认为SH3PP4可能抑制mTORC 1在溶酶体中的定位。当向培养基中添加亮氨酸时，mTOR和溶酶体标记LAMP1共定位(图5C和图S5). 在SH3BP4过度表达细胞中，mTOR和LAMP1的共定位受到抑制(图5C和图S5). 通过联合免疫沉淀分析，我们证实SH3BP4抑制了猛禽和Rag GTPases之间的相互作用(图5D). 这一结果使我们提出了一个模型，即SH3BP4通过抑制溶酶体上Rag GTPase-mTORC1相互作用来抑制mTORCl信号传导。

SH3BP4通过其SH3结构域与Rag GTPases结合对抑制mTORC1信号传导很重要

尽管上述结果表明SH3BP4通过Rag GTPases抑制mTORC1，但抑制作用是否取决于SH3BP4~Rag GTPases的结合，尚待确定。为了解决这个问题，我们试图确定SH3BP4上的一个点突变，该突变阻止SH3BP4-与Rag GTPases结合。我们首先界定了与Rag GTPases结合相关的SH3BP4区域。我们发现含有SH3结构域的SH3BP4的N端片段与处于异二聚体状态的RagB和RagC结合(图6A)或处于单体状态(图6B). 因为Rag GTPases包含一个已知参与结合SH3结构域蛋白的PxxP基序(图S6A–S6D)我们预测，靠近N末端的SH3BP4的SH3结构域可能对Rag GTPases的结合很重要。为了测试这种可能性，我们引入了一个点突变，将Trp92替换为丙氨酸（W92A）。Trp92位于对SH3区域特异性相互作用重要的保守位置(Erpel等人，1995年;Musacchio等人，1994年;Panchamoorthy等人，1994年;Tosoni等人，2005年). 突变抑制SH3BP4与Rag GTPases的结合(图6C和图S6E)表明相互作用依赖于SH3结构域。被W92A突变破坏的相互作用不能通过培养基中的亮氨酸剥夺而恢复，这种条件加强了SH3BP4-Rag-GTPase的相互作用(图6D). 这一结果表明，SH3结构域介导的相互作用对SH3BP4和Rag GTPases之间的氨基酸反应性相互作用很重要。

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SH3BP4通过其SH3结构域与Rag GTPases结合对抑制mTORC1信号传导很重要

(A、 B类)SH3BP4的N末端片段以二聚体形式（A）或单体形式（B）与RagB和RagC结合。SH3BP4的Myc标记片段在HEK293T细胞中分别用（A）HA标记的RagB和RagC或（B）RagB或RagC表达。转染后48小时，细胞在不含亮氨酸的培养基中培养40分钟。用WB分析与SH3BP4片段结合的HA标记的RagB和RagC数量。(C类)SH3BP4W92A突变抑制SH3BP4与RagB和RagC的结合。用myc标记的RagB表达HA标记的SH3BP4 WT或W92A突变体国内生产总值或RagC国内生产总值在HEK293T细胞中。用myc RagB回收的HA-SH3BP4的量国内生产总值或myc-RagC国内生产总值由WB进行评估。(D类)SH3BP4 W92A突变破坏了SH3BP4-Rag GTPase相互作用的亮氨酸依赖性调节。表达SH3BP4和RagB的HEK293T细胞国内生产总值如上（C）所述，用亮氨酸处理图2A.与myc-RagB结合的HA-SH3BP4量国内生产总值进行了分析。(E类)稳定或(F类)SH3BP4 W92A突变体的瞬时过表达消除了SH3PP4对mTORC1的抑制作用。用亮氨酸处理HEK293T细胞，如图2AWB分析内源性S6K1和4EBP1（E）或myc标记的S6K1（F）的磷酸化状态。(G公司)W92A突变减弱了SH3BP4对细胞增殖的抑制作用。通过模拟载体或SH3BP4构建物稳定转导的HEK293T细胞进行细胞增殖分析。结果表示为平均值±标准偏差（n=6）。(H（H）)W92A突变抑制SH3BP4对细胞生长的负面影响。模拟、WT和W92A细胞的平均±SD细胞直径分别为17.16±0.08、16.96±0.09和17.10±0.01µm。(我)W92A突变抑制SH3BP4对HeLa细胞LC3点形成的刺激作用。GFP-LC3点分析如图4F。比例尺，10µm。(J型)每个细胞GFP-LC3点的定量分析（*，第页< 0.05, **,第页<0.01，n=13）。平均值显示为水平条。

为了测试SH3结构域介导的相互作用是否对mTORC1信号的抑制重要，我们在HEK293T细胞中稳定或瞬时表达SH3BP4 WT或W92A突变，并分析S6K1和4EBP1的磷酸化状态。W92A突变抑制SH3BP4对亮氨酸刺激的S6K1和4E-BP1磷酸化的抑制作用(图6E和F). 与此结果一致，W92A突变减弱了SH3BP4对细胞增殖和生长的抑制作用(图6G和H)SH3BP4对LC3穿孔形成的刺激作用(图6I和J和图S6F). 虽然我们不能排除W92A突变影响SH3BP4其他未知功能的可能性，但这些结果支持我们的假设，即SH3结构域介导的SH3BP4-Rag GTPase相互作用对抑制mTORC1信号传导很重要。

SH3BP4与Rag GTPases结合抑制活性Rag GTPase复合物的形成

上述结果支持我们的假设，即在氨基酸饥饿条件下，SH3BP4与非活性Rag GTPase复合物结合，并抑制Rag GTPase-mTORC1信号的激活。剩下的一个问题是SH3BP4结合如何抑制Rag GTPase复合体的活性。首先，我们想知道W92A突变是否可以减弱SH3BP4对溶酶体mTOR定位的抑制作用。SH3BP4 WT抑制亮氨酸刺激的mTOR在溶酶体中的定位，这种抑制作用被W92A突变抑制(图7A和图S7A). 与这一结果一致，W92A突变减弱了SH3BP4对猛禽和Rag GTP酶相互作用的抑制作用(图7B和C). 这些结果支持我们提出的模型，即SH3BP4和Rag GTPases之间的SH3结构域依赖性相互作用对于抑制raptor-Rag GTPase相互作用和mTORC1向溶酶体的募集很重要。

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SH3BP4抑制活性Rag GTPase复合物的形成

(一个)SH3BP4-Rag相互作用抑制mTOR定位到溶酶体。GFP标记的SH3BP4 WT或W92A在HeLa细胞中瞬时表达。对照细胞通过GFP空载体（−）转导。内源性mTOR（绿色）和LAMP1（红色）的共定位分析如图5C. (B类)SH3BP4-Rag相互作用对于抑制raptor-Rag相互作用非常重要。用SH3BP4 WT或W92A在HEK293T细胞中表达HA标记的猛禽和鞭毛标记的Rag GTPases。对照细胞通过空载体（−）而不是SH3BP4结构体转导。用WB分析Rag GTPases免疫纯化的HA-受体数量。(C类)根据（B）中的数据定量猛禽与RagB的结合。数值为平均值±SD（n=2）。(D类)SH3BP4抑制GDP与Rag GTPases的分离，后者被W92A突变所抑制。y轴表示三Rag GTPases释放的H-GDP占总GDP的百分比三在添加GTPγS之前，H-GDP与Rag GTP酶结合。使用的蛋白质是从细菌中制备的。该图是三个独立实验的代表。(E类)SH3BP4抑制Rag GTPases的GTP水解活性，该活性被W92A突变所抑制。金额32分析Rag GTPases释放的P随时间的变化，并在y轴上表示为相对于单独培养Rag GTPases 30分钟时测得的GTP水解的百分比。该图是三个独立实验的代表。图中使用了与（D）中相同的符号。(F类)在与不同浓度的SH3BP4孵育30 min时，分析了SH3BP4RagB-RagC复合物对GTP水解的抑制作用。误差条表示平均值±标准差（n=4）。(G公司)SH3BP4抑制氨基酸诱导的GTP加载到RagB上。在HEK293T细胞中用myc-RagB表达HA-SH3BP4 WT或W92A。对照细胞通过模拟载体（−）而非SH3BP4结构体转导。细胞与[32P] 如中所述，在存在或不存在氨基酸的情况下补充实验程序结合在免疫纯化myc-RagB上的核苷酸通过薄层色谱和放射自显影术进行分析。底部的数字表示绑定到RagB的GTP的百分比。(H（H）)SH3BP4对氨基酸响应的Rag GTPase-mTORC1信号的抑制功能模型。

SH3BP4抑制raptor-Rag GTPase相互作用的可能机制可能是通过抑制活性Rag-GTPase复合物的形成。鉴于SH3BP4优先与无活性的Rag-GTPase复合物结合，我们考虑了SH3BP4可能抑制RagA/B的GDP结合的无活性形式转化为GTP结合的活性形式的可能性。Rag GTP酶与SH3BP4 WT的孵育在体外抑制了GDP与Rag GTPases的分离(图7D和图S7B和C). SH3BP4 WT的抑制作用几乎被SH3BP4W92A突变完全消除(图7D). 我们还测试了包含SH3结构域的SH3BP4 N末端300氨基酸的片段是否可以抑制GDP与Rag GTPases的分离。我们没有发现这个片段有显著影响(图S7D和E)，表明抑制作用需要SH3BP4区域而不是SH3结构域。我们预测，抑制GDP离解应该伴随着Rag GTPases的GTP水解活性的降低。正如预测的那样，RagB和RagC与SH3BP4 WT（而非W92A突变）的孵育抑制了Rag GTPases的GTP水解活性(图7E和F和图S7F和G). 与此结果一致，SH3BP4 WT抑制了GTP负载到RagB上以响应氨基酸，但SH3BP4W92A没有抑制GTP负载(图7G). 与此一致，SH3BP4击倒增加了RagB上的GTP负载(图S7H). 综上所述，这些结果支持我们提出的模型，即SH3BP4结合到非活性Rag GTPase复合物上会损害活性Rag-GTPase复合物的形成(图7H).

讨论

在本研究中，我们将SH3BP4定义为Rag GTPases的结合蛋白和氨基酸-mTORC1信号的负调控因子。在氨基酸缺乏的条件下，SH3BP4直接与不活跃的Rag GTPase复合物结合，并抑制活性复合物的形成。与此提出的机制一致，SH3BP4-silenced细胞中的mTORC1活性在亮氨酸生成条件下并没有完全被抑制，并且在培养基中的广泛亮氨酸浓度范围内保持在高于对照细胞的水平(图3B和图S3A). SH3BP4的这种功能可能有助于降低mTORC1的基础活性或防止mTORCl的过度激活，并可能与癌症或其他与过度激活的mTORC信号相关的人类疾病有关。与这个概念一致，对人类癌症基因组数据库的分析显示SH3BP4型在2594个肿瘤中的14种癌症亚型中的10种中发现了该位点(表S1). 在这10个亚型中，三个亚型（乳腺癌、肾癌和非小细胞肺癌）在SH3BP4型具有统计学意义的位点。因此，SH3BP4可能是在氨基酸Rag GTPase-MMORC1信号传导中发挥作用的肿瘤抑制因子的潜在候选者。

虽然我们的研究为SH3BP4对Rag GTPases的抑制作用提供了有力证据，但它如何调节Rag GTPases还需要进一步研究。根据我们的研究(图2B和C)，SH3BP4与Rag GTPases结合不仅需要RagB的GDP充电，还需要氨基酸饥饿诱导的未知过程。值得注意的是，RagC与SH3BP4的结合取决于与RagC二聚体复合物中RagB的核苷酸负载状态(图1F和图S1D). 这表明二聚体相互作用在某种程度上影响了SH3BP4与Rag GTPases的结合。因为RagB国内生产总值-RagC公司国内生产总值复合物与SH3BP4的结合强度高于RagB国内生产总值-RagC公司全球技术伙伴复杂(图1G)，SH3BP4可能与RagC结合国内生产总值以及碎布国内生产总值在综合体中。有必要对Rag GTPases和SH3BP4之间相互作用的化学计量学进行详细分析，以更好地了解它们在复合物中如何相互作用，以及SH3PP4如何抑制Rag GTPases。

我们发现，在缺乏氨基酸的条件下，大量Rag GTPases被分离出来作为GTP结合形式(图7G). 最近的报告也显示了类似的结果(Duran等人，2011年;Sancak等人，2008年). 氨基酸饥饿下如此高水平GTP结合形式的一个可能解释是，与GTP结合的形式相比，与GDP结合的Rag GTPases不稳定或免疫纯化效率较低。或者，GDP对Rag GTP的亲和力可能低于GTP在体外，从而导致在在体外Rag GTPases的分离。支持这种可能性的是，RagC与GDP的亲和力明显低于GTP(Sekiguchi等人，2001年). 也有可能存在不受氨基酸调节的Rag GTPases群体。

我们的在体外Rag GTPase活性检测表明，SH3BP4可能不是Rag GTPase的全球环境基金或GAP(图7D和E). 这个在体外实验还表明，SH3BP4在不需要其他分子的情况下抑制Rag GTPases。SH3BP4的抑制功能与之前确定的对动态蛋白的抑制功能相似(Tosoni等人，2005年). 这意味着SH3BP4可能调节多种GTPase，至少包括dynamin和Rag GTPase。鉴于SH3BP4的功能与内吞和胞内转运有关，我们很容易推测，SH3PP4对多种GTPase的调节可能对内吞、囊泡转运和mTOR定位的时空协调以及对氨基酸和其他细胞信号的响应很重要。

SH3BP4如何调节Rag GTPases与Ragulator、v-ATP酶和LRS的关系尚待确定。虽然SH3BP4不是氨基酸的直接传感器，但SH3BP5或Rag GTPase可能会发生构象变化或翻译后修饰，以改变SH3PP4和Rag GTpase之间的相互作用以响应氨基酸。支持这一观点的是，已经报道了SH3BP4的多个磷酸化位点(Chen等人，2009年;千叶等人，2009年;Pan等人，2008年). SH3BP4的磷酸化可能是多种细胞内信号和氨基酸调节mTORC1的重要机制。虽然低等真核生物中是否存在SH3BP4同源物尚不清楚，但仍有可能在低等真核生物中存在序列不同的蛋白质，并发挥与SH3PP4类似的作用。或者，SH3BP4可能已经进化以满足高等真核生物更大的调节复杂性。对SH3BP4功能的进一步研究可能为研究氨基酸-mTORC1信号的调控机制提供重要线索。

实验程序

RagB-结合蛋白的鉴定

稳定表达标记RagB的HEK293T细胞的细胞提取物通过标记亲和色谱进行分析。将与柱结合的部分进行胰蛋白酶化并通过质谱分析。详细程序在补充实验程序.

质粒

通过PCR扩增，将从ATCC（图像#2988648）和Open Biosystems（图像#4947387）中获得的人和小鼠SH3BP4 cDNA克隆到pRK5表达载体中。Rag GTPase突变体构建体是通过定点诱变产生的。pLKO.1 shRNA载体用于敲除人或小鼠SH3BP4。目标序列列在补充实验程序.

细胞图像分析

蛋白质的共定位通过Olympus FluoView 1000 IX2倒置共焦显微镜和Deltavision Personal DV显微镜（Applied Precision）进行分析。详细程序在补充实验程序.

体外GDP分离和GTPase分析

体外使用从细菌中纯化的Rag GTPases和SH3BP4，并使用[三H] -GDP和[γ32P] -GTP，分别如补充实验程序.

其他实验程序

其他实验程序，包括材料、质谱、诱变、联合免疫沉淀、Western blotting、慢病毒转导、重组蛋白生产、细胞数量和大小测量、自噬分析和肿瘤样本基因组分析，在补充实验程序.

补充材料

01

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致谢

我们感谢K.Martemyanov的GTPase分析；W.J.Hong代表Arl1克隆；D.Billadeau检测TfR和dynamin抗体；P.De Camilli代表dynamin KO MEF；H.Towle、A.Lange和Kim实验室成员征求意见；明尼苏达大学质谱和蛋白质组学中心和超级计算研究所，用于仪器和生物信息工具。本研究得到了NIH（DK050456、DK083474和GM097057）和ADA（7-07-CD-08）的支持。

脚注

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。

补充信息

补充信息包括补充实验程序、七张图和一张表。

本研究不存在财务利益冲突。

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