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摩尔癌症研究。作者手稿；PMC 2012年8月1日提供。
以最终编辑形式发布为：
Mol Cancer Res.2011年8月；9（8）：997–1007。
2011年6月10日在线发布。 数字对象标识：10.1158/1541-7786.MCR-10-0490
预防性维修识别码：PMC3157566
NIHMSID公司：美国国家卫生研究院302815
PMID：21665936

晚期前列腺癌和乳腺癌患者的循环肿瘤细胞同时显示上皮和间质标记物

安德鲁·阿姆斯特朗，1,2,三，4中，6,* 马修·马伦戈，5,7, 塞巴斯蒂安·奥尔坦，5,7,‡ 加博·凯梅尼，5,7, 朗达·L·咬，1,2,三 詹姆斯特恩布尔，6 克里斯蒂娜·赫罗德，1,¶¶ 保罗·马科姆，1,6 丹尼尔·乔治，1,2,三，4中，6和玛丽亚诺·加西亚-布兰科1,三，5,7,*
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

在癌症进展过程中，作为广泛侵袭和转移计划的一部分，恶性细胞会经历上皮-间充质转换（EMT）和间充质-上皮转换（MET）。我们之前在前列腺癌临床前模型的肺转移中观察到MET事件，表明上皮可塑性与转移扩散之间存在关系。因此，我们试图通过检测进展性转移性实体瘤患者的循环肿瘤细胞（CTC）中是否存在EMT，将这些发现转化为临床证据，重点是去势耐受性前列腺癌（CRPC）男性和转移性乳腺癌（BC）女性患者。我们发现，转移性CRPC患者中的大多数（>80%）CTC共同表达上皮蛋白，如EpCAM、CK和E-cadherin，间充质蛋白，包括vimentin、N-cadherin和O-cadherin以及干细胞标记物CD133。同样，我们发现75%以上转移性膀胱癌患者的CTC共同表达细胞角蛋白、波形蛋白和N-钙粘蛋白，进行性转移患者的干细胞标记物对于应用和解释经批准的检测CTC的方法具有重要意义。

关键词：转移性去势抵抗前列腺癌（mCRPC）、上皮-间充质转化（EMT）、间充质-上皮转化（MET）、循环肿瘤细胞（CTCs）、转移性乳腺癌、N-钙粘蛋白、CD133、O-Cadherin、EpCAM

介绍

根据形态、行为和分子特征，大多数后生动物细胞可分为上皮细胞或间充质细胞。成年动物的上皮细胞和间充质细胞通常保持一种表型状态；也就是说，上皮细胞不会改变其性质而成为间充质细胞。然而，在发育过程中，早期胚胎的上皮细胞产生所有三个胚胎层（内胚层、中胚层和外胚层），其中包括间充质细胞(1). 因此，这些早期胚胎细胞具有在上皮和间充质状态之间转换的能力，我们将其定义为上皮可塑性（定义稍有不同，请参见(2)). 事实上，胚胎中的观察结果表明上皮-间充质转变（EMT）和间充质-上皮转变（MET）(三)，这可能被天真地视为同一反应机制的正向和反向（有关审查，请参阅(2，4)).

虽然很容易将EMT/MET表示为二元态之间的可逆反应，但有人建议中间态存在，并且这些中间态可能发挥重要作用。EMT和MET在癌症进展中的重要性现在被广泛接受，尽管不是一致接受（参见最近的综述(4——8)). 在人类癌细胞中观察到EMT在体外在异种移植物和浸润性癌的前缘体内(5，6). 在人类前列腺癌中，E-cadherin表达缺失和N-cadherin过度表达（表明存在EMT）与高Gleason评分、术后系统性和转移性复发独立相关，将EMT与更具攻击性的临床行为联系起来(9——12). 此外，最近的研究证明了N-cadherin表达在前列腺癌临床前模型和人类转移的去势抵抗转移过程中的重要性。这些翻译研究表明上皮标记物的丢失、间充质标记物的获得、，以及促进生存和雄激素受体非依赖性生长的信号通路的诱导(13). 在乳腺癌中，原发性和播散性骨髓肿瘤细胞中的EMT标记物与侵袭性临床行为之间建立了类似的联系(14——18). 同样，MET的证据来自结直肠癌转移的显微镜分析，其采用了原发肿瘤非侵袭性区域的上皮特征(19). 在前列腺癌中，转移细胞与骨细胞的粘附与E-钙粘蛋白的表达相关(20). 这些和许多其他研究描述了致癌过程中这些转变的存在，并对其功能重要性提出了质疑。有强有力的证据表明EMT对转移行为和化疗耐药性很重要(18，21); 然而，MET的重要性更难确定。此前，我们发现，在携带AT3大鼠前列腺癌肿瘤的大鼠中，MET事件在肺转移中的优势表明，恢复到上皮状态的能力与肺实质的转移生长之间存在重要的功能关系(22，23).

对癌症中上皮可塑性的严格观点认为，EMT后达到的间质样状态是恶性适应症的驱动因素。事实上，有强有力的证据表明，侵袭性和运动性的间充质特性是转移所必需的（见上文），EMT导致癌症干细胞标记物的表达，包括CD44(24). 尽管如此，上述观察结果表明间充质特性就其本身而言不足以实现最佳恶性行为(19，22，23，25). 更广泛的解释表明，上皮样和间充质样状态之间容易转换的能力，我们将其定义为表型可塑性，可能与干细胞样特性有关，并且是侵袭性转移行为的一个更重要的决定因素，而不是末端状态的特性。在一个研究干细胞和癌症生长重要性的临床前模型中，将CD133阳性细胞（预测为干细胞样）皮下注射到免疫缺陷小鼠中会导致肿瘤生长，而注射CD133阴性细胞则不会(26). 最近的一项临床研究测量了切除的结直肠癌患者血液中干样标记物的mRNA编码，发现CD133、CEA和细胞角蛋白RNA的表达与复发性疾病和整体预后不良有关(27).

因此，我们假设大多数可塑性细胞是那些栖息于过渡或中间状态的细胞，具有上皮和间充质的特性，并且这些过渡细胞将是特别恶性的干细胞。为了在人类疾病中测试这一建议，我们从转移性去势耐受性前列腺癌（CRPC）和转移性乳腺癌（BC）患者的CTC中寻找间充质和干细胞表型标记物的证据。

材料和方法

人循环肿瘤细胞分析

符合CTC生物标记物方案的患者包括：1）患有mCRPC的男性，PSA或放射标准（RECIST或新骨扫描病变）显示其转移进展（PSA≥5，年龄≥18岁，连续两次高于最低值，间隔>1周）；或2）患有mBC且病情进展或开始新的系统治疗的女性，年龄>18岁，使用含蒽环类药物治疗至少7天。作为IRB批准的前瞻性临床方案的一部分，所有受试者都提供了知情同意书。在杜克大学分子病理学系和临床病理学实验室使用细胞搜索系统（Veridex，Raritan，NJ）收集患者的血液（15ml），并在48小时内进行处理。Veridex profile试剂盒用于收集CTC，该试剂盒使用铁磁免疫吸附试验分离EpCAM阳性细胞，无需额外染色。使用标准试剂盒，使用Veridex Cellsearch方法收集并并行处理额外的试管，以进行CTC计数。在轮廓试剂盒处理后，分离的细胞要么立即处理，要么在4%多聚甲醛（PFA）中储存过夜，然后第二天处理。使用台式磁铁对EpCAM结合细胞进行初步清洗，以进一步分离CTC，在磁铁释放到100μL PBS中后，细胞颗粒重新悬浮。在特氟隆涂层载玻片上进行免疫染色。简单地说，用移液管将细胞移到载玻片的微孔中，静置约30分钟，然后进行标准的免疫染色程序，仔细抽吸，以将室温下的细胞损失降至最低。在4%PFA固定、PBT渗透（0.2%v/v Triton的PBS）和10%山羊血清封闭30分钟后，使用标记有Alexa 647的CD45抗体、标记有Alexa 555的细胞角蛋白和Vimentin（BD Biosciences，San Jose CA，550513）、N-钙粘蛋白（BD生物科学）、，O-cadherin（Invitrogen，Carlsbad CA）或CD133（Novus Biologics，Littleton CO）标记Alexa 488。补充表1提供了有关控制细胞、稀释液和所用产品的详细信息。然后用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）进行核染色。CTC被定义为完整的细胞，包含细胞核并表达细胞角蛋白，但缺乏CD45表达。对照细胞与每个患者样本并行评估免疫荧光染色强度和评分（参见补充表1用于所用控件和补充图1这些实时控件的图像）。人类外周血单个核细胞（PBMCs）由Micah Luftig（Duke）善意提供，通过Ficoll纯化来自美国红十字会正常捐赠者的浅黄色外套获得，用作CD45表达的阳性对照细胞和CK和钙粘蛋白的阴性对照细胞。此外，在EpCAM采集的CD45阴性DAPI阳性细胞上检测E-cadherin（BD Biosciences）与N-cadherin的共同表达，而不管其细胞角蛋白的表达如何。在这种情况下，手动计数所有CD45阴性细胞，并对表达E-或N-cadherin的CD45阴性有核细胞比例进行评分。为了确保抗E-和N-钙粘蛋白抗体(补充表1)没有与各自的抗原发生交叉反应，通过针对E-和N-钙粘蛋白以及肌动蛋白的蛋白质印迹分析检测了一系列具有已知E-和N-钙粘蛋白表达水平的对照细胞作为负载对照。

载玻片用凝胶/载玻片培养基（Biomeda，Foster City，CA）固定。用奥林巴斯（纽约州梅尔维尔）IX 71表观荧光显微镜对载玻片进行分析，并使用奥林巴斯DP70数码相机获取图像。使用DP Controller软件（Olympus）进行图像处理。按顺序分析每张幻灯片上的所有字段，将CD45阴性的每个细胞角蛋白阳性有核细胞计数为CTC。在病例和对照细胞的分析过程中，始终使用针对每种抗体优化的标准化暴露时间。

转移瘤的免疫组织化学（IHC）分析

根据相同的知情同意协议，接受CTC采集的男性还同意接受放射导向的转移活检，以通过IHC分析生物标记物的表达。在轻度镇静期间，通过芯针活检获得样本，并立即进行福尔马林固定和石蜡包埋。为了进行分析，将载玻片脱蜡、再水化，并在0.3%H中使内源性过氧化物酶失活30分钟2哦2甲醇中的（过氧化氢）。针对单个抗原执行特定的抗原检索步骤。通过IHC评估三种标记物：波形蛋白（M7020，Dako，1:150；胃蛋白酶在37ºC下处理15分钟的抗原回收）、细胞角蛋白混合物（18-0132，Invitrogen，1:50和349205，BD Biosciences 1:50，胃蛋白酶在37ºC下处理15分钟的抗原回收）和CD45（M0701，Dako，1:200；用10 mM柠檬酸钠、100ºC pH 6.0进行抗原回收30分钟）。一级抗体在室温下孵育60分钟。Dako Envision辣根过氧化物酶二级抗体在室温下使用30分钟，用DAB试剂（Vector kit SK 4100）检测信号。用苏木精和伊红对玻片进行反染，并由训练有素的病理学家使用每个标记物的适当阳性（局部前列腺组织微阵列切片）和阴性对照（模拟抗体）评估玻片的表达。

统计分析

我们使用简单的描述性统计来估计EpCAM采集的CTC上间充质和CD133抗原共同表达的流行率，并从诱导水平和组内（CRPC和BC）水平总结这些发现。为了比较CTC计数（标准Cellsearch®方法）与共表达波形蛋白、N/O-cadherin或CD133的CTC比例，进行了线性回归分析。通过方差分析测试拟合优度。

结果

为了检测转移性疾病患者CTC上间充质和/或干细胞抗原的共同表达，我们利用FDA批准的现有捕获方法，最初从全血中捕获和分离细胞。CTC在多种上皮性恶性肿瘤中具有独立的预后和预测意义，包括mCRPC和mBC(28，29)，可以收集、分离和分析与癌症生物学相关的各种生物标记物(30——32). 批准的CTC捕获技术依赖于上皮细胞表面EpCAM（上皮细胞粘附分子）的表达，因此目前测量的CTC必须是类上皮细胞。然而，这些细胞已经从原发肿瘤中逃逸出来，可能是EMT/侵袭性计划的结果，并且可能具有间充质特性。

为了检测间质样CTC的存在，采集了41例男性mCRPC患者和16例女性mBC患者的血液（参见表1和补充表2)使用CellSearch处理和CTC®基于EpCAM的免疫捕获方法，并通过免疫荧光（IF）分析CD45（PTPRC）（白细胞标记物）、细胞角蛋白（CK）和E-cadherin（CDH1）（上皮标记物），波形蛋白（VIM）、N-钙粘蛋白（CDH2）和O-cadherin(10，33) (补充表1). 白细胞定义为有核（DAPI阳性）、CD45阳性和CK阴性细胞(图1A)而CTC被定义为有核（DAPI阳性）、CD45阴性和CK阳性细胞(图1B–G). 在CTC中，我们确定了额外表达波形蛋白的细胞亚群(图1C)或N-钙粘蛋白(图1D&E)或O-钙粘蛋白(图1F&G). 在个体患者CTC分析时使用实时阳性和阴性对照细胞，以在不改变的情况下使用相同的暴露、抗体浓度和相机设置来确定阳性或阴性IF表达。每个相应抗原和受试者的实时对照细胞图像如图1，​,3三和​和44中提供了补充图1.

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转移性去势抵抗前列腺癌（mCRPC）患者CTC上皮和间质蛋白的共表达

所有面板均表示来自相位/DAPI、CD45/DAPI、CK/DAPI以及vimentin（Vim）/DAPI、N-cadherin（N-cad）/DAPI表达或O-cadherin。所示为以下示例：（A）CD45表达的白细胞，（B）不表达vimentin的CTC，（C）vimentin表达的CTC（D）N-cadherin表达的TCC，（E）三个CTC，两个具有N-cadherin表达（箭头），（F）具有O-cadherin表示的CTC和附近的白细胞以及（G）具有O-钙粘蛋白表达的额外CTC。比例尺代表20μm，从相同放大倍数和分辨率的图像中添加。在收集和分析每组患者样本的CTC的同时，平行分析对照细胞，如所示补充图1.

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转移性CRPC患者CD45阴性有核细胞中E-cadherin和N-cadherin的共同表达

如图所示，所有面板均表示来自相位/DAPI、CD45/DAPI、E-cadherin（E-cad）/DAPI和N-cadherin/DAPI表达的合并图像。（A） 具有CD45表达的白细胞，（B）CD45阴性有核细胞，具有E-钙粘蛋白和N-钙粘蛋白共表达，（C）CD45阴性有核细胞，具有N-钙粘蛋白表达和不具有E-钙粘蛋白表达，（D）CD45阴性有核细胞，具有E-钙粘蛋白表达和不具有N-钙粘蛋白表达，和（E）一种缺乏CD45、E-cadherin和N-cadherin表达的有核细胞。比例尺代表20μm，从相同放大倍数和分辨率的图像中添加。在收集和分析每组患者样本的CTC的同时，平行分析对照细胞，如所示补充图1.

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干细胞标记物CD133在男性mCRPC患者CTC中的表达

所有面板均表示来自相位/DAPI、CD45/DAPI、CK/DAPI和CD133/DAPI表达的合并图像，如图所示。所示为（A）CD45表达的白细胞，（B）CD133阴性CTC，（C）CD133-阳性CTC，以及（D）CD133-阳性CTC的另一个例子。比例尺代表20μm，从相同放大倍数和分辨率的图像中添加。在收集和分析每组患者样本的CTC的同时，平行分析对照细胞，如所示补充图1.

表1

本研究中转移性心肺复苏患者的基线人口统计学和临床特征（n=41）。

人口统计学的n=41
中位年龄，年（范围）71 (50–89)
种族、民族
白人，非西班牙裔73%
黑人、非西班牙裔27%
基线疾病史
Gleason得分中位数（范围）8 (5–10)
平均基线PSA1（ng/dl，范围）248.9 (14.0–13,419.5)
基线疼痛中位数（范围）20（0–7）
Karnofsky性能状态中位数（范围）90 (60–100)
既往激素治疗的中位数（范围）2.5 (0–5)
既往化疗68%
先前的二膦酸盐73%
转移性疾病的部位
内脏（肺+肝）54%
仅淋巴结0%
骨转移：
骨转移伴淋巴结（无内脏转移）24%
无淋巴结骨转移（无内脏转移）22%
1PSA：前列腺特异性抗原。
2疼痛评分采用线性模拟量表（0-10范围）。

在患有mCRPC的男性患者中，我们发现在10/10（100%）的患者中，CTCs共同表达波形蛋白和CK，根据这个标准，所列举的108/126（86%）的CTCs是过渡性的(图1B-C，表2和补充表3，另请参见补充图1用于控制单元和补充图2更多示例）。其中两名患者在初次收集CTC后一周内进行了骨转移活检（其中6名患者和7名患者为表1)CK阳性肿瘤灶中没有波形蛋白表达，但周围骨基质中有较强的波形蛋白的表达，缺乏CK表达(图2). 这些患者在进行CT引导的肿瘤活检的同时进行了CTC检查，该肿瘤活检通常同时表达CK和vimentin。这些发现与随后经历EMT/MET或处于过渡状态的CTC的侵袭和转移相一致；另一种解释可能是波形蛋白在转移瘤中的共同表达可能是异质的，类似于CTC的表达。

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波形蛋白和细胞角蛋白在前列腺癌转移中的表达

图像取自CT引导的靶向骨转移活检，同时收集循环肿瘤细胞，并通过免疫荧光评估波形蛋白的共同表达。图像来自患者6（顶部）和患者7（底部），CK（左侧）和vimentin（右侧）的表达通过免疫组织化学（20倍放大）进行分析。CK面板中的比例尺代表50μm，是从相同放大倍数和分辨率的图像中添加的。

表2

转移性去势抵抗前列腺癌（CRPC）男性和转移性乳腺癌（BC）女性循环肿瘤细胞（完整、有核CK+、CD45-、DAPI+细胞）中EMT和干细胞抗原标记物表达的流行率。右边的列显示了每个标记物的手工评分阳性CTC的数量，以及每个组中至少有一个CTC对给定标记物染色阳性的患者数量。

抗原n个标记阳性CTC（%）标记阳性CTC患者（%）
波形蛋白（CRPC）10第108页，共126页(86%)10/10（100%）
波形蛋白（BC）1065/97(65%)7/10(70%)
N-卡德林（CRPC）11205/244(84%)11/11(100%)
N-Cadherin（公元前）678/95(82%)4/6(67%)
O-钙粘蛋白（CRPC）6107/120(89%)6/6(100%)
CD133（CRPC）11127/153(83%)9/11(82%)

在接下来的11名患有mCRPC的男性队列中，我们发现11/11（100%）患者的CTC同时表达N-cadherin和CK，根据这个标准，205/244（84%）的CTC被确定为同时表达这些标记物(图1D&E，表2也可参见补充表3，补充图1用于实时控制单元和补充图3更多示例）。CTC中N-cadherin的表达不同于未检测到的，这取决于补充表1，到非常强大(图1D). 从患者11的三个CTC检查中可以看出，个体患者的CTC之间存在这种差异(图1E). 虽然我们注意到患者和对照白细胞中存在异质性波形蛋白表达，但我们没有观察到患者或对照白细胞的N-钙粘蛋白表达。

在10名患有mBC的女性中，9名患者有可检测到的CTC，其中，我们发现有证据表明波形蛋白在7名（78%）患者中共同表达，而在88名CTC中，有55名（63%）患者同时表达波形蛋白(补充图2，表2和补充表4和中的控件补充图1). 在另外6名可检测到CTC和mBC的女性中，有4名有CK和N-cadherin共同表达的证据，并且全部78/95个CTC（82%）有N-cadherin表达，在特定个体中的表达具有显著的异质性(表2，补充图3和中的控件补充图1). 这些数据表明，mBC和mCRPC患者的大多数CTC共同表达上皮（EpCAM和细胞角蛋白）和间充质（波形蛋白、N-钙粘蛋白）标记，因此存在过渡表型状态，与我们临床前模型中观察到的类似。

鉴于这些发现，我们接下来试图更好地描述循环CD45阴性有核细胞上上皮E-cadherin与更多间充质N-cadherin的双重表达。对照细胞（T47D、BT549、PC-3和PBMC细胞）的Western blot分析表明，我们的E、N或O-钙粘蛋白抗体对其各自抗原缺乏交叉反应性（数据未显示），从而确保这些抗体能够测量预期的靶抗原。在另外一组6名进行性转移性CRPC患者中，我们对所有CD45阴性细胞进行了特征分析，这些细胞最初是使用标准Cellsearch®方法捕获的。鉴于在单个细胞中可以使用IF评估的蛋白质数量有限，我们检查了这些CD45阴性细胞上是否存在E和N-钙粘蛋白表达，但无法额外测量CK表达，因此无法定义如上所述的CTC。有趣的是，如中所示表3，图3、和补充图1，我们发现了CD45阴性细胞的四种不同亚型的明确证据，包括同时表达E和N-钙粘蛋白的细胞（在给定受试者中检测的细胞中有20-71%），表达E但不表达N-钙粘蛋白的细胞（2-22%的细胞），表达N但不表达E-钙粘蛋白的细胞（0-45%的细胞），以及缺乏钙粘蛋白家族成员的细胞（25-48%的细胞）。表达N-cadherin的CD45阴性细胞的比例与表达E-cadherin细胞的比例相似（61%对53%），尽管这在男性个体中差异很大（分别为48-72%对23-75%）。最后，我们注意到，在这些EpCAM采集的细胞中，E-钙粘蛋白阴性/N-钙粘蛋白阳性细胞的亚型相对罕见，但在两名男性（受试者39和40）中，作为实验方案的一部分，他们最近使用mTOR抑制剂替米罗莫司治疗，病情进展。虽然这些分析仅限于基于EpCAM表达捕获的细胞，但结果表明CTC共同表达上皮和间充质蛋白，并表明存在目前未检测到的具有减少或缺失上皮标记的CTC。因此，评估全血中非白细胞有核细胞群而不进行基于EpCAM的初始捕获的方法可能能够识别这些额外的细胞。

表3

进展性转移性CRPC患者中使用基于EpCAM的磁流体（Cellsearch®方法）从循环中分离的CD45阴性有核细胞上E-cadherin和N-cadherin表达的患病率。临床CTC=使用FDA批准的方法进行计数。每一列表示基于双标记表达识别的CD45有核细胞的数量和百分比*表明有两名转移性CRPC患者正在使用mTOR抑制剂替米罗莫司进行治疗。

受试者编号临床CTCCD45阴性细胞E+N+细胞（%）E−N−电池（%）E+N−电池（%）E−N+电池（%）
3572417 (71%)6 (25%)1 (4%)0 (0%)
36552311 (48%)8 (35%)4 (17%)0 (0%)
3711212282 (67%)30 (25%)4 (3%)6 (5%)
3810006527 (42%)22 (34%)14 (22%)2 (3%)
39*45449 (30%)21 (48%)1 (2%)13 (30%)
40*168318 (22%)26 (31%)2 (22%)37（45%）
总结1235361164 (45%)113 (31%)26 (7%)58 (16%)

鉴于前列腺癌有向骨转移的趋势，我们接下来假设有利于成骨细胞肿瘤微环境的粘附分子可能在CRPC患者的CTC上可见。在前列腺癌临床前模型中，O-钙粘蛋白最近与骨转移有关(34，35)因此，我们想检测其与CK在CTC中的共同表达。事实上，通过基于EpCAM的铁磁捕获，我们发现六分之六的男性可检测到CTC中存在共表达，并且O-钙粘蛋白在64-96%的CTC中表达，而任何O-钙黏蛋白表达在100%的CRPC男性中都有表达（示例如图1F&G，总结于表2和补充表3带有控件补充图1). 这些发现表明前列腺癌CTC共同表达粘附分子，这些粘附分子可能促进骨归巢和成骨细胞的同型结合。

假设前列腺癌干细胞和其他癌症干细胞群体中干细胞相关抗原CD133的表达(27，33，36)，我们研究了mCRPC患者CTC中CD133的表达。我们发现CD133在11/11（100%）患有CTC的男性中表达，在127/153（83%）来自这些男性的CTC中表达(图4，表2，补充图4和中的控件补充图1). 这些数据表明，来自常见上皮性恶性肿瘤患者的CTC同时表达上皮和间叶标记物，表明EMT/MET转变可能有助于转移进展。此外，在患有转移性CRPC的男性患者中，干细胞抗原CD133在大多数CTC中的共同表达表明，这些细胞可能在迁移到血液中的过程中获得了干细胞的特性(21，24).

讨论

在这些研究中，我们已经确定了一些生物标记物，这些生物标记物暗示了常见转移性上皮性恶性肿瘤（包括乳腺癌和前列腺癌）患者的CTC中的上皮可塑性和干细胞。在大量患者样本的CTC中，对上皮和间充质表型的鉴定提供了几个重要的临床机会。这些数据表明，在转移转移过程中，CTC可能经历从上皮向间充质过渡状态的表型变化，而转移本身在表型和标记物表达上可能更为上皮化。我们的研究结果还表明，除了表达上皮和间充质标志物的细胞外，可能还有数量未知的更像间质的CTC，因此EpCAM阴性。FDA批准的CellSearch将错过这些细胞®方法、Adna测试（AdnaGen-AG）系统和当前的微流体技术，通过免疫吸附表达MUC1或EpCAM的细胞来富集CTC(37). 事实上，最近对乳腺癌的研究表明，过度表达EMT和干细胞抗原（CD44+、CD24-）的“正常”型乳腺癌细胞株可能缺乏EpCAM，因此无法被当前批准的CTC检测系统检测到(38). 因此，转移癌患者的CTC数量可能远高于目前的估计。

众所周知，诱导细胞经历EMT可激活干细胞通路(24). 事实上，最近的一项研究表明，前列腺癌相关成纤维细胞（CAF）趋化因子白介素-6或TGF-β的表达与肿瘤侵袭性、转移倾向、EMT抗原表达和干细胞特征的获得之间存在显著的关系(39). 我们的研究结果表明，使用基于上皮细胞的捕获分析（当前FDA标准方法）捕获的CTC表达干细胞标记CD133。这些发现与Mani等人的结果一致(24)在乳腺癌模型中证明EMT和干状态之间的关系。很容易推测，这些CTC可能代表具有上皮和间充质表型的过渡细胞，这种异质性或可塑性也可能扩展到干细胞标记物以及治疗诱导效应。例如，我们观察到两名最近使用mTOR抑制剂进行治疗的男性CTC中N-cadherin表达增加，表明某些全身性药物可能改变CTC表型。对这种过渡状态理论的另一种解释是，这些标记物存在肿瘤异质性，而无需进行表型转换。对EMT/MET过程被实验性破坏或诱导的转移性肿瘤的进一步临床前和临床研究可能会进一步阐明这些观察结果。

我们的可塑性工作模型还预测，具有最大干细胞特征的细胞（定义为高度恶性）应同时显示上皮和间充质特征，因为它们位于上皮-间充质轴的中间状态。在这里，我们发现转移性乳腺癌和前列腺癌患者的CTC以表型状态存在，可能处于上皮和间充质状态的中间状态。虽然上皮抗原（EpCAM）捕获的CTC或CD133阳性CTC的计数与疾病进展相关，因此，使用基于EMT抗原的捕获方法对CTC检测方法进行进一步改进，可能会提高CTC识别的预测能力(27——29). Aktas及其同事最近表明，富含CTC的细胞群表达编码间充质标记的RNA；然而，该研究无法证明上皮和间充质标记物在同一细胞中的共同表达(40). 基于本文的结果，有必要进一步研究基于这些标记物和EpCAM捕获细胞的方法，以研究它们与转移进展和化疗耐药性的相关性。

这项工作有几个固有的局限性。首先，我们还没有证明CTC中存在真正的干细胞，这需要进一步的实验证据来证明连续克隆传代和移植，或者延长患者CTC的培养时间。用目前的方法，这在技术上是不可行的。我们的茎干标记仅在性质上相关，可能与茎干以外的属性相关。我们还承认，上皮和间充质标记物的共同表达本身并不代表可塑性，因为我们无法观察到这种动态体内患者中。我们的临床观察表明，肿瘤转移过程中CTC上实时共表达的可塑性，以及来自同一患者的成对转移瘤中波形蛋白的缺乏表达。这种可塑性对高度侵袭性转移行为的重要性只能通过临床前系统的实验操作来测试，在临床前系统中预防EMT/MET；未来的实验需要解决这个问题。最后，这些研究没有将CTC上EMT因子的共同表达与临床结果相关联；这些预后研究需要大规模的、适当的研究和长期随访患者，例如最近报道的CD133阳性结直肠CTC和术后结果(27). 然而，我们的研究结果表明，通过EpCAM富集法和EMT抗原富集法收集的CTC测量值可以相互补充，在系统治疗期间提供预后或预测信息，应进行前瞻性评估。

最后，表达间充质或干样标记物的CTC，包括本研究中分离的大多数细胞，以及由于EpCAM丢失而无法检测到的其他细胞，都是一个治疗问题。EMT可以改变药物敏感性(21，41，42)对具有干细胞样特性的癌细胞进行直接治疗一直具有挑战性，可能是因为它们难以接受凋亡(43). 虽然最近的研究表明，筛选方法和实际化合物（例如盐霉素）都可以选择性地靶向癌症干细胞(21)，这些攻击性细胞仍然是一个艰巨的挑战。我们的研究结果表明，这些细胞类型可能在转移性上皮性肿瘤患者中非常普遍，并建议改进体内检测这些细胞的方法，以帮助开发新的治疗策略。

补充材料

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致谢

赠款支持

NIGMS拨款R01 GM63090（M.A.Garcia-Blanco）；NCI拨款R01 CA127727（M.A.Garcia-Blanco）。A.J.Armstrong得到了前列腺癌基金会青年研究员奖计划、杜克癌症研究所K12计划（5K12-CA-100639-05，PI H.K.Lyerly）、国防部医师研究培训奖（W81XWH-10-1-0483）、美国癌症学会试点拨款计划和H.L.Kirkpatrick基金会的支持。M.S.Marengo获得了国家研究服务奖T32-CA059365和F32 CA142095的支持。

我们感谢M.Dewhirst博士、P.Febbo博士、J Somarelli博士和J Pearson博士的重要讨论。我们还感谢M.Luftig博士为普通捐赠者提供浅黄色外套。

脚注

潜在利益冲突的披露：Armstrong博士、Oltean博士、George博士和Garcia-Blanco博士在2010年9月24日提交的相关专利申请（申请号PCT/US10/50233）中被列为发明人。

作者贡献

A.J.Armstrong、S.Oltean、D.George和M.A.Garcia-Blanco构思了最初的研究。A.J.Armstrong和M.A.Garcia-Blanco指导了这项研究。G.Kemeny、S.Oltean和M.S.Marengo进行了实验室实验。A.J.Armstrong、J.Turnbull、C.I.Herold、P.K.Marcom和D.George进行了临床程序和招募。虽然所有合著者都参与了手稿的撰写，但A.J.阿姆斯特朗、M.S.马伦戈和M.A.加西亚-布兰科完成了大部分的写作和编辑工作。

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