缓解自噬和4EBP1对雷帕霉素的耐药性^▿

细胞培养。

细胞保存在37°C和5%CO的加湿培养箱中₂GP2-293和H4细胞在添加10%胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良Eagle’s培养基（[DMEM]11995；Invitrogen）中生长，RT112细胞在添加18 mM的α-哺乳动物必需培养基（[αMEM]12571；Invit罗gen）内生长d日-葡萄糖和10%FBS，补充10%FBS的McCoy’s（16600；Invitrogen）中的U2OS细胞，补充10%的FBS的Eagle’s最低必需培养基（[EMEM]ATCC 30-2003）中的SK-N-SH细胞，以及HN10细胞(45)DMEM（10564；Invitrogen）中添加10%FBS。

mCherry-GFP-LC3表达细胞系的产生。

从pL（mCherry-GFP-LC3）构建体表达单体Cherry（mCherry）-GFP-LC3(29)，基于含有人类LC3A的pLEGFP-C1（Clontech）[PCR从pCMV6-XL5（MAP1LC3A）扩增]({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_032514.2”，“term_id”：“31563519”，“term_text”：“NM_032514.2}NM_032514.2号; Origene）和mCherry（Clontech）分别位于GFP下游和上游。pL（mCherry-GFP-LC3）通过使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）与pVPackVSV-G（其中VSV-G是水泡性口炎病毒G蛋白）（Stratagene）共同转染GP2-293细胞，被包装成逆转录病毒颗粒。在转染后72小时收集逆转录病毒上清液，与8μg/ml Polybrene（美国生物分析公司）混合，用于感染H4、RT112、U2OS、SK-N-SH和HN10细胞。使用250至500μg/ml G418（Invitrogen）筛选稳定的转导细胞，并保留大量G418耐药细胞并用于实验。当细胞被电镀用于实验时，G418被省略。

自噬和S6磷酸化的高含量成像和分析。

将稳定表达mCherry-GFP-LC3的H4、RT112、U2OS、SK-N-SH和HN10细胞以2000至4000个细胞/孔的密度在30μl培养基/孔中镀入384孔板（Greiner）。电镀后第1天，通过添加10μl/孔含有10%FBS和4×浓缩化合物的DMEM，用化合物处理细胞4小时或18小时。饥饿时，抽吸培养基，清洗细胞并在40μl/孔Earle平衡盐溶液（EBSS；HyClone）中培养。处理后，通过添加10μl/孔5×浓缩Mirsky固色剂（National Diagnostics）和25μg/ml Hoechst 33342（Invitrogen），将细胞在室温下固定1h。用Tris缓冲盐水（TBS）清洗细胞六次，使用InCell分析仪1000（GE Healthcare）对384孔板进行自动荧光显微镜检查。使用×20放大倍率在每个孔中成像四个不同的区域，每个孔覆盖400到800个细胞。Hoechst 33342在360 nm处激发，并使用460±40 nm发射滤光片和150 ms的曝光时间成像。GFP在475 nm处激发并使用535±50 nm发射滤光镜和1500 ms的曝光温度成像。使用InCell调查员软件（GE Healthcare）的多目标分析模块量化图像。简而言之，根据Hoechst 33342染色鉴定细胞核，并使用4-8μm衣领确定细胞。使用多顶帽分割法在mCherry图像中检测并量化细胞LC3点，并对每个孔取平均值。将mCherry阳性点的位置信息和掩模转移到GFP图像上，测量掩模内的荧光强度（mCherry-阳性点的GFP强度）并平均每个孔。计算治疗诱导的mCherry阳性点状细胞GFP强度变化，以描述自噬流量。mCherry-GFP-LC3成像后，细胞在室温下在封闭缓冲液中培养2小时（TBS补充0.1%Triton X-100和0.1%牛血清白蛋白），在4°C下用抗磷酸-S6-S240/244抗体染色过夜（封闭缓冲液稀释1:300；4838；细胞信号技术）并在室温下用Cy5缀合的山羊抗兔IgG（在封闭缓冲液中以1:300稀释；AP187S；Millipore）保持2小时。用TBS清洗细胞六次，并使用InCell Analyzer 1000对384孔板进行重新定位。Hoechst 33342和Cy5图像是在每孔两个视野中使用10倍放大率采集的。Cy5在620 nm处激发，并使用700±75 nm的发射滤光片和1000 ms的曝光时间成像。图像使用InCell调查员软件（GE Healthcare）的物体强度分析模块进行分析。简而言之，使用Hoechst 33342图像识别细胞核，使用4-8-μm衣领定义细胞，在细胞衣领内部测量Cy5强度，并计算每个孔的平均值。减去Cy5基线强度，并将对照处理的荧光信号设置为100%。

复合协同分析。

如前所述，RAD001和Ku-0063794化合物相互作用使用Bliss相加性或最高单剂（HSA）模型进行分析(三,50). 对于每种化合物组合，通过将二甲基亚砜的作用设置为0%，并将最高化合物组合（12μM Ku-0063794+0.15μM RAD001）的作用设为100%，计算对自噬激活（LC3 punta/cell）或S6磷酸化抑制（免疫染色强度）的相对作用。Bliss加成法模型计算给定化合物组合的实际测量效果与单剂量的总效果之间的差异（超额百分比）。HSA模型计算给定化合物组合的实际测量效果与两种单一药物产生的较大效果之间的差异。

细胞裂解、交联和mTOR免疫沉淀。

使用放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液（细胞信号技术）和蛋白酶抑制剂鸡尾酒（罗氏应用科学）制备全细胞裂解物，在16000×克持续10分钟，根据蛋白质浓度进行归一化（Bio-Rad蛋白质分析），并在添加2%硫醇的NuPAGE十二烷基硫酸锂（LDS）样品缓冲液（Invitrogen）中煮沸。对于交联和mTOR免疫沉淀，细胞在10厘米培养皿中生长，并用0.1%二甲基亚砜或250 nM RAD001处理18小时。如上所述，用1 mg/ml二硫代双琥珀酰亚胺丙酸酯（DSP；Pierce）进行交联(37). 然后用冷磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗细胞单层，并在40 mM HEPES中溶解，pH 7.5，120 mM NaCl，1 mM EDTA，10 mM焦磷酸钠，10 mM-甘油磷酸，50 mM NaF，1.5 mM Na_三VO（旁白）₄和添加蛋白酶抑制剂鸡尾酒的0.3%CHAPS（3-[（3-胆酰胺丙基）-二甲基氨]-1-丙磺酸）（罗氏应用科学）。在16000×克持续10分钟，并根据蛋白质浓度进行归一化（生物-Rad蛋白质分析）。在4℃下添加蛋白G Sepharose珠（GE Healthcare）之前，将1毫克裂解物样品与10μl抗mTOR（2972；细胞信号技术）在4℃培养过夜。然后用裂解缓冲液洗涤珠子三次，并在添加2%ß-巯基乙醇的NuPAGE LDS样品缓冲液（Invitrogen）中煮沸。

米⁷GTP帽分析。

细胞生长在10厘米的培养皿中，并用图中图例所示的抑制剂处理。然后用冷PBS清洗细胞单层并在10 mM KH中溶解₂人事军官₄/K₂高性能操作₄，pH 7.05，5 mM EGTA，10 mM氯化镁₂、0.5%NP-40、0.1%Brij35、0.1%脱氧胆酸钠补充磷酸酶和蛋白酶抑制剂鸡尾酒（罗氏应用科学）。在16000×克持续10分钟，并根据蛋白质浓度进行归一化（生物-Rad蛋白质分析）。500微克的裂解物样品与7-甲基-GTP Sepharose珠（GE Healthcare）在4°C下孵育4小时，然后用裂解缓冲液洗涤珠三次，并在添加2%巯基乙醇的NuPAGE LDS样品缓冲液（Invitrogen）中煮沸。

免疫印迹法。

蛋白质样品通常使用吗啉丙基磺酸（MOPS）流动缓冲液（Invitrogen）在NuPAGE 4至12%双三凝胶上分离。为了分离4EBP1和LC3，使用了NuPAGE 12%Bis-Tris凝胶。将蛋白质转移到硝化纤维素膜（Invitrogen）上，用图中所示的一级抗体进行探测，并使用辣根过氧化物酶（HRP）结合的山羊抗兔IgG（AP307P；Millipore）和增强化学发光（Pierce）进行可视化。

mTOR抑制剂对自噬的调节。

不同的mTOR抑制剂在多大程度上调节自噬途径？为了解决这个问题，H4 mCherry-GFP-LC3细胞被不同剂量的变构mTOR抑制剂雷帕霉素和RAD001以及mTOR催化抑制剂Ku-0063794处理18小时(13)和WYE-354(49). 雷帕霉素和RAD001增加了纳米范围内LC3点的数量(图2A和D），以及自噬流量的量化证实了自噬的诱导。浓度为250 nM的雷帕霉素或RAD001可显著增加亲代H4细胞内源性LC3的脂质化(图2C） ●●●●。Ku-0063794和WYE-354需要微摩尔浓度来激活自噬，但比变构抑制剂更大程度地增加了LC3点和自噬流量(图2A和D）。在饱和浓度下，所有四种化合物都完全抑制S6K1-T389和核糖体蛋白S6-S240/244的磷酸化，而只有催化型mTOR抑制剂靶向mTORC2底物位点Akt-S473(图2B和C）。我们得出结论，变构mTOR抑制剂确实激活H4细胞的自噬，但不如催化mTOR抑制物有效。

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图2。

mTOR抑制剂在H4细胞中的自噬诱导潜能。H4 mCherry-GFP-LC3细胞在384孔板中生长，并用雷帕霉素、RAD001、Ku-0063794或WYE-354的系列稀释液（2.8 pM至12μM）处理18 h。（A） 细胞固定并用Hoechst染色，自噬用高含量成像和分析定量。每个数据点代表三个独立实验的平均数据±标准偏差。（B） 384孔板中的培养物使用磷酸特异性一级和Cy5结合二级抗体对磷酸化核糖体蛋白S6-S240/244进行免疫染色。使用高含量成像和分析对细胞Cy5信号进行量化。每个数据点代表三个独立实验的平均数据±标准偏差。（C） 用所示化合物处理亲代H4细胞18 h并裂解，通过Western blot分析显示内源性蛋白。（D） H4-mCherry-GFP-LC3细胞在四孔培养玻片中生长，用所示化合物处理18小时，固定，并进行荧光显微镜检查。显示了具有代表性的图像，并合并了GFP（绿色）、mCherry（红色）和DAPI（蓝色）通道。（E） 用25 nM非靶向（NT）、raptor或rictor siRNA转染H4 mCherry-GFP-LC3细胞，并在转染后4天进行裂解，并使用指示的一级抗体通过Western blotting分析内源性蛋白。（F） 在添加0.1%DMSO、250 nM RAD001或3μM Ku-0063794 4小时或18小时之前，对H4 mCherry-GFP-LC3细胞进行3天siRNA敲除。使用高含量成像和分析在384孔板中定量自噬。条形图表示20口井的平均数据±代表性实验的标准偏差。

雷帕霉素和RAD001的短期治疗仅针对mTORC1(37)而Ku-0063794和WYE-354可同时抑制mTORC1和mTORC2。为了测试这两种mTOR复合物对自噬诱导的贡献，我们使用了一种遗传方法，并通过敲除猛禽和利克氏猛禽的siRNA分别抑制了mTORC1和mTORC2。在H4 mCherry-GFP-LC3细胞中，猛禽和猛禽的耗竭高效，相应的下游信号事件受到影响，即抑制猛禽的S6K1-T389磷酸化和抑制猛禽击倒的Akt-S473磷酸化(图2E） 。在自噬方面，猛禽的沉默激活了该通路，LC3点显著增加，而利克托的击倒没有影响(图2F） ●●●●。有趣的是，RAD001添加到raptor-depleted细胞中导致自噬激活，其程度与催化mTOR抑制剂Ku-0063794相同。由于转染非靶向siRNA和rictor siRNA的细胞在RAD001处理后均显示出部分自噬激活，因此该效应对猛禽的击倒具有特异性。这表明自噬的激活并不依赖于mTORC2的抑制，而是由mTORC1被抑制的程度决定的，这一发现与雷帕霉素在野生型小鼠和rictor基因敲除小鼠的胚胎成纤维细胞中是一种不良的自噬激动剂相一致(42).

雷帕霉素和RAD001以细胞类型特异的方式诱导自噬。

我们将基于图像的自噬和mTORC1活性分析应用于其他细胞系。在人膀胱癌RT112、人骨肉瘤U2OS和人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞中，Ku-0063794和WYE-354强烈诱导细胞LC3点(图3A和B）。相反，雷帕霉素和RAD001在RT112和U2OS细胞中激活了自噬，但在SK-N-SH细胞中没有激活。重要的是，在RT112、U2OS和SK-N-SH细胞中，S6-S240/244磷酸化对雷帕霉素和RAD001同样敏感(图3C） ●●●●。在第二个神经母细胞瘤细胞系HN10中，自噬对雷帕霉素和RAD001也无影响，尽管S6-S240/244磷酸化被完全抑制(图3).

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图3。

在SK-N-SH和HN10细胞中，自噬与雷帕霉素和RAD001无关。在384孔板中培养稳定表达mCherry-GFP-LC3的RT112、U2OS、SK-N-SH和HN10细胞，并用雷帕霉素、RAD001、Ku-0063794或WYE-354的系列稀释液（11 pM至12μM）处理18 h。细胞固定并用Hoechst染色，自噬用高含量成像和分析定量。（A） 每个细胞定量的mCherry点的绝对数量。给出了一个具有代表性的实验，每个数据点代表四口井的平均数据±标准偏差。（B） 相对自噬激活计算为mCherry puncta的折叠诱导。每个数据点代表三个独立实验的平均数据±标准偏差。（C） 384孔板中的培养物使用磷酸特异性一级和Cy5结合二级抗体对磷酸化核糖体蛋白S6-S240/244进行免疫染色。使用高含量成像和分析对细胞Cy5信号进行量化。每个数据点代表三个独立实验的平均数据±标准偏差。

为什么即使S6-S240/244磷酸化被完全抑制，雷帕霉素和RAD001仍无法诱导SK-N-SH和HN10细胞的自噬？Ku-0063794和WYE-354激活这些细胞系中的自噬，这一事实证明mTOR仍然是自噬的关键负调控因子(图3). 因为我们发现自噬的激活取决于mTORC1被抑制的程度(图2F） ，我们假设雷帕霉素和RAD001在一定程度上抑制SK-N-SH和HN10细胞中的mTORC1，其有效性足以靶向S6K1效应途径，但不能自噬。雷帕霉素和RAD001与其细胞内受体FKBP12复合，结合mTOR并破坏与猛禽的相互作用。我们推测FKBP12、mTOR或猛禽的差异可能是雷帕霉素和RAD001对自噬的细胞类型特异性作用的原因。我们首先比较了显示雷帕霉素耐药自噬（SK-N-SH和HN10）或雷帕霉素敏感自噬的细胞系（U2OS、H4和RT112）中FKBP12、mTOR和raptor的表达水平。Western blot分析显示所有细胞系中mTOR和raptor的表达水平相当(图4A） ●●●●。FKBP12水平在细胞系之间变化，但不随雷帕霉素对自噬的敏感性而变化。为了分析mTOR与受体相互作用的组成和稳定性，从使用或不使用化学交联剂DSP处理的细胞中免疫沉淀mTOR。细胞在0.3%CHAPS中溶解以保持mTORC1完整性(21). 在交联细胞中，在所有五种细胞系中，mTOR都能恢复到类似数量的猛禽(图4B） ●●●●。然而，在缺乏DSP的情况下，在SK-N-SH和HN10细胞中与mTOR共免疫沉淀的猛禽明显增多。即使在RAD001处理后，尽管与mTOR共沉淀的总量显著减少，但一些猛禽仍与SK-N-SH和HN10细胞中的mTOR结合，这一观察结果仍然成立。因此，在每个被测细胞系中，相同数量的猛禽与mTOR相互作用，但mTOR-捕捉器相互作用显示出不同的稳定性。在U2OS、H4和RT112细胞中，raptor-mTOR相互作用不稳定，在细胞裂解和mTOR免疫沉淀过程中大部分丢失。这种不稳定的构象可能有利于变构抑制剂对mTORC1的更完全抑制。在SK-N-SH和HN10细胞中，RAD001可以破坏mTORC1的稳定性，但在这些条件下，残留猛禽仍与mTOR结合，足以抑制自噬。

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图4。

RAD001的自噬诱导电位与mTOR复合物1的稳定性相关。（A） 在RIPA缓冲液中裂解U2OS、H4、RT112、SK-N-SH和HN10 mCherry-GFP-LC3细胞系，并使用指示的一级抗体进行Western blotting分析。（B） 用0.1%二甲基亚砜或250 nM RAD001处理U2OS、H4、RT112、SK-N-SH和HN10 mCherry-GFP-LC3细胞系18小时。一半的培养皿使用1 mg/ml DSP进行化学交联。使用0.3%CHAPS制备细胞裂解物，使用抗mTOR抗体进行免疫沉淀，并通过Western blot分析进行分析。

使自噬和mTOR复合物1对RAD001敏感。

我们的mTOR-受体相互作用数据表明，由于mTORC1抑制不足，SK-N-SH和HN10细胞中的自噬与RAD001无关。因此，mTORC1的敏化应允许RAD001诱导自噬。在H4细胞中，猛禽的耗竭确实使RAD001能够完全激活自噬，类似于催化mTOR抑制剂(图2F） ●●●●。我们测试了猛禽的沉默是否能使SK-N-SH mCherry-GFP-LC3细胞中的自噬对RAD001敏感。猛禽siRNA能够降低猛禽蛋白质水平，但残留量仍可通过Western blotting检测到，并且S6K1-T389的磷酸化不受影响(图5A） ●●●●。与猛禽的不完全击倒一致，细胞LC3点没有变化(图5B） ●●●●。然而，将RAD001添加到raptor-depleted细胞中能够激活自噬(图5B、 比较非靶向[NT]siRNA和猛禽siRNA-处理细胞中的RAD001处理），这表明mTOR-受体复合物数量的减少允许以RAD001敏感的方式将自噬偶联到mTORC1。

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图5。

mTORC1的致敏作用可减轻雷帕霉素耐药性引起的自噬。（A） 用非靶向（NT）或猛禽siRNA转染SK-N-SH mCherry-GFP-LC3细胞并在转染后4天进行裂解，并使用指示的一级抗体通过Western blotting分析内源性蛋白。（B） 在添加0.1%二甲基亚砜、250 nM RAD001或3μM Ku-0063794之前，对SK-N-SH mCherry-GFP-LC3细胞进行4天的siRNA敲除。使用高含量成像和分析在384孔板中定量自噬。条形图表示20口井的平均数据±代表性实验的标准偏差。（C） 用所示化合物处理SK-N-SH mCherry-GFP-LC3细胞4小时，然后进行高含量分析或Western blot分析。（D） SK-N-SH mCherry-GFP-LC3细胞在384孔板中生长，并用RAD001和Ku-0063794的10×10剂量矩阵处理18小时，包括零浓度点。细胞LC3点通过高含量成像和分析进行量化，自噬激活相对于DMSO（设置为0%）和最高化合物组合（设置为100%）进行描述。显示了两个独立实验的平均值。（E） 使用磷酸化核糖体蛋白S6-S240/244的磷酸特异性一级抗体和Cy5结合二级抗体对平板进行免疫染色，并使用高含量成像和分析对细胞Cy5信号进行量化。相对于二甲基亚砜（设置为0%）和最高化合物组合（设置为100%），描述了pS6-S240/244的抑制作用。显示了两个独立实验的平均值。对于自噬激活（F）和pS6-S240/244抑制（G）的每个化合物浓度对，测定超过Bliss加性的百分比。显示了两个独立实验的平均值。请注意，负值、零值和正值分别表示对抗、相加或协同。

为了进一步探索这一点，在不激活自噬的浓度下，使用催化mTOR抑制剂对mTORC1进行药物敏化。有趣的是，作为单一制剂，200 nM Ku-0063794没有诱导自噬，但允许RAD001激活自噬途径，这可以通过增加细胞LC3点以及内源性LC3脂化来证明(图5C） ●●●●。这些数据表明，RAD001具有激活SK-N-SH细胞自噬的潜力，但通常不会这样做，因为mTORC1没有被充分抑制。

由于250 nM RAD001和200 nM Ku-0063794的组合激活自噬的程度比单剂量更大，因此我们检查了它们的组合是否以协同方式靶向mTORC1。Bliss加性模型(三,50)用于分析RAD001和Ku-0063794的10×10剂量矩阵。作为单一制剂，Ku-0063794在微摩尔范围内调节自噬和pS6-S240/244，而RAD001在纳米摩尔范围内抑制pS6-S240/244，但不激活自噬(图5D和E，其中左侧列和最低行反映单个代理活动）。剂量为0.19μM、0.38μM和0.75μM的Ku-0063794能够使自噬对RAD001敏感，Bliss加性模型显示出强烈的协同作用(图5F） ●●●●。重要的是，仅在RAD001剂量下观察到协同作用，该剂量也作为单一药剂抑制S6磷酸化。其作用是双重的：RAD001引起Ku-0063794的效力转移，而Ku-006379提高了RAD001的效力。对于S6-S240/244磷酸化的抑制，协同作用被限制在RAD001和Ku-0063794的窄剂量范围内，可能是因为这两种化合物作为单一制剂在抑制这种读出方面非常有效(图5G） ●●●●。最高单代理（HSA）模型(三,50)产生了非常相似的协同作用值（数据未显示），我们得出结论，RAD001和Ku-0063794联合使用可以协同抑制mTORC1激活自噬。

我们感谢Stephen Helliwell的评论和建议。

所有作者（D.J.K.除外）均为诺华制药的员工。

D.J.K.得到了NIH拨款的支持GM53396号.