抗菌自噬发生在内质网PtdIns（3）富含P的区域，需要Rab1 GTPase

Rab1是自噬所必需的鼠伤寒沙门氏菌。

为了进一步表征ER或ER衍生膜对抗菌自噬的作用，我们检测了早期分泌途径标记物与自噬靶向细菌的定位。我们观察到荧光标记的Rab1A和Rab1B亚型与LC3的共定位显著增加⁺细菌比LC3⁻细菌(图2A和B). 同样，Rab1也与细菌的内源性LC3共定位(图2A). Rab1与LC3共定位⁺ 鼠伤寒沙门氏菌经内源性Rab1B多克隆抗体证实(图2B). 检测到的其他标记物，包括参与ER-Glgi贩运的其他GTPase（Sar1A和ARF1），均未在LC3上显著积累⁺ 鼠伤寒沙门氏菌(图2B和S2A公司).

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图2

Rab1参与细胞自噬鼠伤寒沙门氏菌（A）HeLa细胞联合转染RFP-LC3和CFP-Rab1B（上部）或单独转染CFP-Rab 1B，并用兔抗内源性LC3（抗LC3）多克隆抗体（下部）进行免疫染色，然后感染鼠伤寒沙门氏菌1h。方框区域的放大图像显示在右上角或左下角，表示LC3⁺ 鼠伤寒沙门氏菌(萨尔)用CFP-Rab1B标记。尺寸棒，5µm。（B） 荧光标记GTPase结构的量化或用RFP-LC3对指示的蛋白标记物进行免疫染色⁺或LC3⁻（C）按照（A）中的方法转染和感染细胞，并在感染前30分钟用或不用沃特曼（WTM）处理细胞。对所示结构的阳性细菌百分比进行量化。（D） 野生型或附件5^−/−MEF被转染并感染，如（A）所示。所示结构的阳性细菌百分比如（C）所示。星号表示差异显著，p<0.05。（E） 对HeLa细胞进行对照处理，RAB1号机组和ATG12型siRNA或（F）BET3测试siRNA，转染GFP-LC3并感染鼠伤寒沙门氏菌表达RFP 1小时。LC3的百分比⁺对细菌进行了定量。（G） 用siRNA处理细胞并如（E）中那样感染，然后对泛素化蛋白进行染色。百分比鼠伤寒沙门氏菌与泛素化蛋白共定位的定量如（E）所示。（H） 用siRNA处理细胞，并像（E）中那样感染细胞，并对其进行液泡标记LAMP-1染色。LAMP-1的百分比⁺细菌数量如（E）所示。星号表示与对照siRNA水平存在显著差异，p<0.05。

为了确定Rab1是否因自噬而定位于细菌，我们研究了在何种条件下自噬鼠伤寒沙门氏菌被阻止。²²自噬抑制剂沃特曼（wortmannin）抑制了Rab1向细菌的募集，与LC3募集类似(图2C). 缺乏必需自噬因子Atg5的小鼠胚胎成纤维细胞³⁴表明Rab1和LC3招募抑制鼠伤寒沙门氏菌(图2D). 实时成像期间鼠伤寒沙门氏菌HeLa细胞感染表明GFP-Rab1B和RFP-LC3同时被招募到细菌中(图S3和补充电影1). 因此，Rab1招聘到鼠伤寒沙门氏菌与自噬特别相关，并不是SCV正常成熟的结果。此外，Rab1本地化为DFCP1⁺和LC3⁺细菌(补充电影2)表明Rab1在自噬过程中作用于内质网PtdIns（3）P富集区鼠伤寒沙门氏菌.

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图3

Rab1与自噬体相关，其活性是其形成所必需的。（A） 用RFP-LC3和指示的CFP-Rab1B构建物共同转染HeLa细胞，然后用雷帕霉素处理2小时以诱导自噬。方框区域的放大图像显示在右上角。箭头表示CFP-Rab1B（Q67L）与自噬体共定位的进一步实例。尺寸棒，5µm。（B） 定量CFP-Rab1B构建物与自噬体（AP）（RFP-LC3）的共定位⁺圆形液泡，具有清晰可见的中空中心）。星号表示差异显著，p<0.05。（C） 如（A）所示转染细胞，然后不处理（−Rap）或用雷帕霉素处理2 h（+Rap）。定量每个转染细胞的自噬体（AP）平均数量。（D） 用指示的siRNAs处理的HeLa细胞转染GFP-LC3，并用（+）或不使用（−）雷帕霉素处理2小时。量化每个细胞的自噬体（AP）数量。在一项平行实验中，在雷帕霉素治疗期间用自噬抑制剂WTM处理细胞。星号表示与对照siRNA水平（+Rap）存在显著差异，p<0.05。（E） 用所示siRNA处理的HeLa细胞在不存在（−）或存在雷帕霉素（+Rap）、单独存在巴非霉素A1（BafA1）或雷帕霉素和巴非霉素A1一起（+Rap+BafA1）的情况下孵育2小时。然后裂解细胞，收获细胞并通过蛋白质印迹进行分析。用兔多克隆抗体检测内源性LC3-I和LC3-II。β-微管蛋白作为负载对照。使用ImageJ软件进行密度测定，LC3-II与β-微管蛋白密度的比值如下图所示。

为了测试细菌的自噬是否需要Rab1，用siRNA处理HeLa细胞，以靶向两者的表达RAB1号机组异构体(图S2B)然后感染了鼠伤寒沙门氏菌持续1小时。RAB1号机组siRNA降低了LC3的百分比⁺细菌水平与ATG12型siRNA处理(图2E). 转运蛋白颗粒（TRAPP）复合物作为鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）激活酵母中的Ypt1^35——37在这种生物体的自噬中起着重要作用。¹⁸siRNA靶向治疗贝特3，编码TRAPP复合物的保守成分，^38,39显著降低LC3的百分比⁺1小时时的细菌(图2F). 这些结果表明，Rab1对细胞的高效自噬是必要的鼠伤寒沙门氏菌.

自噬鼠伤寒沙门氏菌保护细胞质免受细菌侵染。22因此，在自噬缺陷细胞或用自噬抑制剂治疗的细胞中，更多的细菌逃逸到细胞质中，与泛素化蛋白结合⁴⁰液泡中保留的细菌较少。^22,41 RAB1号机组siRNA导致显著更多鼠伤寒沙门氏菌与对照siRNA相比，感染后1小时细胞溶质中（以细菌与泛素化蛋白的结合为标志）(图2G). 此外，RAB1号机组siRNA导致溶酶体相关膜蛋白-1（LAMP-1）中残留的细菌减少⁺空泡与对照siRNA的比较(图2H). 我们进一步研究了Rab1在细菌降解中的作用。我们发现，用RAB1号机组与用对照siRNA处理的细胞相比，siRNA相对较少(图S4A和B). 这并不奇怪，因为RAB1号机组敲低不仅抑制自噬，还削弱内质网对高尔基体的运输。入侵后，大多数鼠伤寒沙门氏菌在LAMP内-¹⁺液泡和经历快速复制。细胞内生长鼠伤寒沙门氏菌需要一个正常的高尔基体网络，高尔基体的破坏导致细菌复制受到抑制。⁴²因此，RAB1号机组敲除通过破坏自噬导致更多的细胞溶质细菌生长，但导致细菌在液泡中的复制受到抑制。最终结果是，在RAB1号机组siRNA处理的细胞比对照siRNA处理细胞。总之，Rab1似乎是细胞自噬所必需的鼠伤寒沙门氏菌保护胞浆免受细菌定植。

Rab1与雷帕霉素诱导的自噬体有关，其活性是其形成所必需的。

接下来我们研究了Rab1参与其他形式的自噬。用mTOR抑制剂雷帕霉素处理HeLa细胞以诱导自噬。⁴³区分自噬体和其他非特异性LC3⁺结构，⁴⁴我们只统计了明显的空心LC3⁺环状物作为自噬体。Rab1B（WT）与雷帕霉素诱导的自噬体共定位(图3A和B). Rab1B（Q67L）不能水解GTP，因此作为组成活性结构，与自噬体的共定位程度更高。然而，显性阴性Rab1B（S22N）与雷帕霉素诱导的自噬体关系不大(图3A和B). 与CFP载体的过表达相比，即使在没有雷帕霉素的情况下，Rab1B（WT）和Rab1B（Q67L）的过表达也增加了每个细胞的自噬体数量(图3C). Rab1B（S22N）的表达减少了雷帕霉素诱导的自噬体形成，尽管这种减少没有统计学意义(图3C). 此外，RAB1号机组与对照siRNA相比，siRNA显著减少了每个细胞形成的自噬体数量，这种效果与siRNA对ATG12型或在沃特曼的存在下(图3C). 为了确定Rab1对自噬通量的影响，我们检测了LC3-II的量，LC3-II是LC3的磷脂酰乙醇胺（PE）共轭形式，³¹存在或不存在溶酶体抑制剂巴非霉素A1。如所示图3E在缺乏巴非霉素A1的情况下，雷帕霉素增加了对照siRNA处理细胞中LC3-II的数量，但在RAB1号机组或ATG12型siRNA处理的细胞。在单独存在巴非霉素A1的情况下，LC3-II的量反映了自噬的基础水平。在这种情况下，用对照siRNA处理的细胞中积累的LC3-II比RAB1号机组siRNA，表明RAB1号机组敲低可降低基础自噬，类似于ATG12型击倒(图3E). 当细胞中同时添加巴非霉素A1和雷帕霉素时，对照siRNA处理的细胞中LC3-II的数量增加比RAB1号机组或ATG12型siRNA处理的细胞(图3E). 总之，这些结果表明，Rab1在雷帕霉素诱导的自噬通量中起着重要作用，特别是在自噬体形成中。

Rab1是通过自噬介导清除泛素化蛋白聚集体所必需的。

泛素化蛋白的聚集物是哺乳动物细胞中大分子自噬的特异性载体。⁴⁵这些聚集体可以在细胞应激时形成，并在蛋白质泛素化和降解之前存储错误折叠的蛋白质。⁴⁶这些聚集物通过自噬依赖和蛋白酶体依赖机制协同清除。⁴⁷用嘌呤霉素处理可以诱导聚集物的形成，嘌呤菌素是一种翻译抑制剂，可诱导多肽链过早终止，随后错误折叠的蛋白质积累。⁴⁷在我们的聚集清除试验中，用嘌呤霉素对HeLa细胞进行脉冲处理4小时，以诱导聚集形成（通过染色泛素化蛋白标记）。然后通过大量清洗去除药物，然后进行8小时追踪，以观察总清除率。如所示图4A和B，～61%用对照siRNA处理的细胞在去除嘌呤霉素后8小时能够清除聚集物。与之前的结果一致，⁴⁷3-甲基腺嘌呤（3MA）对自噬的抑制降低了聚集物的清除率，而对自噬和蛋白酶体的抑制（通过环氧化合物处理）几乎完全阻断了这些结构的清除(图4B). 用siRNA对两种异构体的细胞处理RAB1号机组导致骨料间隙减少，与3MA存在时观察到的情况类似(图4A和B). 这些结果与Rab1在哺乳动物细胞中依赖自噬清除泛素化蛋白聚集体中的作用一致。

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图4

Rab1是通过自噬介导清除泛素化蛋白聚集体和过氧化物酶体所必需的。（A） 用指示的siRNA处理HeLa细胞。将嘌呤霉素添加到细胞中4小时以诱导泛素化蛋白聚集物的形成，然后进行大量洗涤。骨料清理再进行8小时（总共12小时）。固定细胞并对泛素化蛋白进行染色（使用FK2抗体），以显示聚集物。在一项平行实验中，在去除嘌呤霉素后立即用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）处理细胞。尺寸棒，5µm。（B） 在去除嘌呤霉素后8小时清除所有聚集物的细胞百分比的量化。如有指示，在去除嘌呤霉素后立即用3-MA处理细胞，并添加或不添加蛋白酶体抑制剂环氧霉素（环氧）。星号表示与对照siRNA处理的细胞有显著差异，p<0.05。（C） 用指示的siRNA转染HeLa细胞，然后固定并免疫染色过氧化氢酶，并使用抗兔Alexa 488抗体进行可视化。尺寸棒，10µm。（D） 内源性过氧化氢酶荧光信号的总荧光强度按照材料和方法中的描述进行测量。误差条表示至少75个单元格的标准偏差。星号表示与对照siRNA处理的细胞相比，过氧化氢酶强度显著增加，p<0.05。（E） 在D的平行实验中，荧光标记的过氧化氢酶阳性结构或过氧化物酶体的数量按照材料和方法中的描述进行了量化。每100µm磨牙小体的数量^三在两种亚型中RAB1型或ATG12型将siRNA处理的细胞与对照siRNA处理细胞进行比较。星号表示过氧化物酶体数量显著增加，p<0.05。

Rab1是过氧化物酶体自噬介导降解所必需的。

哺乳动物细胞具有基本水平的组成过氧化物酶体周转。⁴⁸这是依赖于自噬的，尽管还不清楚降解是通过选择性自噬还是通过大量自噬。为了测试Rab1是否参与过氧化物酶体的自噬介导降解，在Rab1敲除条件下测定过氧化物酶水平。此前已有研究表明，通过ATG12型siRNA导致过氧化物酶体数量增加。⁴⁹过氧化物酶体数量的增加可以通过定量过氧化氢酶（一种丰富的过氧化物酶蛋白）的增加来确定。荧光强度或过氧化氢酶阳性结构（代表过氧化物酶体）的数量被量化。什么时候？RAB1号机组siRNA靶向表达，与非靶向siRNA处理的细胞相比，过氧化氢酶阳性结构也有类似的增加(图4C-E). 因此，这些结果与Rab1在过氧化物酶体自噬介导降解中的作用一致。

细菌菌株和感染。

鼠伤寒沙门氏菌SL1344，⁵³以及表达RFP的细菌。²²晚对数野生型鼠伤寒沙门氏菌如前所述，培养物用于感染细胞。⁵⁴

质粒和转染。

根据制造商的说明使用FuGene 6（Roche Diagnostics，11814443001）或GeneJuice（Novagen，CA80511-358）转染试剂。感染前16-24小时转染细胞。GFP-LC3来自T.Yoshimori博士（日本静冈县国立遗传研究所）；RFP-LC3来自W.Beron博士（阿根廷梅多萨国立库约大学）；GFP-Rab1A来自C.Roy博士（耶鲁大学医学院，康涅狄格州纽黑文），GFP-Rab 1B来自C.Alvarez博士（阿根廷科尔多瓦Cuidad Universitaria）；第23-GFP段来自H.Kai博士（日本熊本熊本大学），NleA-GFP在前面有所描述。⁵¹DFCP1-GFP、ER-FYVE-GFP、FYVE-GFF、TM-GFP和FYVE（C347S）-TM-GFP在前面进行了描述。⁴Mito Cb5-GFP在其他地方进行了描述。^三表达CFP的质粒来自Clontech({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“U55762”，“term_id”：“1377911”，“term_text”：“U55762“}}U55762型).

ARF1-CFP、CFP-Sar1A和CFP-Rab1B构造生成如下：ARF1、SAR1A和RAB1B型用含有适当限制性内切酶位点的基因特异性引物，通过RT-PCR从人类总RNA和人脑总RNA中分离得到。使用的引物为：ARF1（N）-CGG AAT TC公司A TGG GGA ACA TCT TCG CC，ARF1（C）-CGG网关CCT GCT CCT GCG CAC TTC TGG TTCC GGA GC，Sar1A（N）-CGG AAT TC公司A TGT CTT TCA TCT TTG AGT GGA TCT，Sar1A（C）-G型GG ATC CTC AGT CAA TAT ACT GGG AGA GCC，Rab1B（N）-CG公司G AAT TC公司A TGA ACC CCG AAT ATG ACC，Rab1B（C）-CGG网关CCT CAT GAA CGC CTG CTC GA。PCR产物用EcoRI和BamHI消化，并克隆到pECFP-N1（用于ARF1-CFP）或pECFP-C2（用于CFP-Sar1A和CFP-Rab1B）。为了产生每种蛋白质的组成活性和显性阴性形式，根据制造商的方案，使用QuikChange定点突变试剂盒（Stratagene，200519）进行定点突变。在ARF1（Q71L）和Rab1B（Q67L）的G3 GTP结合基序中，Gln被Leu取代，而在Sar1A（H79L）中，His被Leu代替，以形成组成活性形式。G中的Ser或Thr替换为Asn₁GTP-结合基序产生显性负结构ARF1（T31N）、Rab1B（S22N）和Sar1A（T39N）。诱变后，通过测序验证每个克隆。

药物治疗。

除非另有说明，否则将以下试剂添加到培养基中并保存在培养基中，如下所示：3-甲基腺嘌呤（Sigma；M9281；10 mM）、Brefeldin A（Invitrogen；cat.#B7450；10µg/mL，巴菲霉素A1（Sigma；B 1793；100 nM）。

siRNA处理。

RAB1A公司（编号D-008283-02），RAB1B（编号D-08958-03），ATG12型（GUG GGC AGU AGA GCG AAC A）和BET3测试（GGA GAC GGU GUG ACA GAA AUU）siRNA双工体和第13节（编号M-012351-01），第23A节（#M-009582-00）和第23B节（#M-009592-01）SMARTpool siRNAs来自Dharmacon。siCONTROL非靶向siRNA池（#D-001206-13）用于对照实验。在使用前48小时，用50 nM的每个siRNA转染HeLa细胞。根据制造商的说明使用了寡效胺转染试剂（Invitrogen，12252011）。western blot证实成功敲除Rab1B、Atg12和Sec13。通过western blot检测Sec23-GFP表达缺失，证实Sec23基因敲除成功。

抗体。

使用了以下抗体：兔抗沙门氏菌（Difco Laboratories）、鼠抗沙门氏菌（BioDesign，C65336M）、兔抗calnexin（Dr.D.Williams，University of Toronto，ON）、鼠抗蛋白二硫醚异构酶（SPA-891）和鼠抗Grp78/BiP（SPA-826）来自Stressgen，兔抗Atg12（2010）兔抗核糖体蛋白S6（2212）来自Cell Signaling、兔抗Sec24（Dr.W.Balch，The Scripps Research Institute，La Jolla，CA）、兔抗Sec13和抗Sec31（Dr.F.Gorelick，The University of Tennessee Health Science Center，Memphis，TN）、小鼠抗COPI（Dr.J.Rothman，Rockefeller Research Laboratory，New York）、，兔抗β-COP（亲和生物试剂，PAI-061）、羊抗Rab1B（Santa Cruz，sc-26541）、鼠抗ERGIC53（Alexis生化，ALX-804-602）、鼠（A11120）或兔（A11122）抗GFP抗体来自分子探针、鼠抗giantin（S.Grinstein博士，安大略省多伦多市儿童医院）、，小鼠抗GM130（BD Biosciences Pharmingen，610822）、小鼠抗β-微管蛋白（Sigma，T4026）、小鼠泛素化蛋白（FK2；BioMol，PW8810-0500）、，⁵⁵兔抗过氧化氢酶（Calbiochem，219010）、用于western blot的兔抗LC3（Novus Biologicals，NB100-2331）和用于免疫荧光的兔抗-LC3（Dr.K.Kirkegaard，Stanford University，CA USA）。

所有荧光二级抗体均为来自Molecular Probes/Invitrogen的AlexaFluor缀合物（A-11029、A-11031、A-11045、A-11070、A-11036、A-31556、A-21068）。用于免疫印迹的小鼠和兔抗辣根过氧化物酶二级抗体分别来自Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.（115-035-146）和Sigma（A-6154）。

蛋白质印迹。

样品在15%SDS-PAGE凝胶上分离，然后转移到聚偏二氟乙烯膜上，并用适当的抗体进行探测。使用ImageJ软件进行密度测定。

免疫荧光。

细胞在37°C下用2.5%多聚甲醛固定10分钟。细胞外和总鼠伤寒沙门氏菌如前所述进行差异染色。⁵⁶对于所有其他染色，使用0.2%皂苷和10%正常山羊血清在4°C下过夜进行渗透和封闭，并按照前面所述进行染色。⁵⁷使用配备100倍油物镜、1.4数字孔径的徕卡DMIRE2表观荧光显微镜进行定殖定量。共焦图像如图所示，使用配备63x油物镜和LSM 510软件的蔡司Axiovert共焦显微镜拍摄。图像被导入Adobe Photoshop并在Adobe Illustrator中组装。

过氧化物酶体评估。

用siRNA转染HeLa细胞ATG12型，两种亚型RAB1号机组或如上所述的非目标序列。转染72h后，用3%多聚甲醛固定细胞，用标准免疫荧光染色法检测内源性过氧化物酶体标记物过氧化氢酶。为了量化过氧化物酶体数量的变化，用兔抗过氧化氢酶和山羊抗兔IgG Alexa 488抗体探测细胞。荧光图像通过激光扫描共焦显微镜（LSM 710；Carl Zeiss MicroImaging，Inc.）使用40×1.3 NA Plan-NeoFluor油物镜获得。使用完全开放的针孔从所有平面获取最大信号。使用Volocity（PerkinElmer）测量过氧化氢酶染色的总荧光强度。将总强度的平均值与模拟转染的对照细胞进行标准化。对每种情况下至少75个细胞进行分析。为了计数细胞内的过氧化物酶体，在蔡司LSM 710上获得了用抗过氧化氢酶染色的整个细胞的高分辨率z截面图像。使用Volocity 3D分析软件（Perkin-Elmer）测定过氧化物酶体数量和细胞体积。简而言之，z截面用于构建3D图像，其中过氧化物酶体的数量使用强度和粒子计数算法进行计算。过氧化物酶体数量表示为100µm内过氧化物酶体的数量^三.

实时图像。

将接种有细胞的盖玻片置于成像室中，并保存在无碳酸氢盐HEPES的RPMI培养基中。按照上述方法培养细菌，并通过造粒收集1mL。为了用与AlexaFluor 647（NHS-647；Invitrogen，A20006）偶联的琥珀酰亚胺酯标记细菌，将造粒细菌洗涤两次，并重新悬浮在250 mL磷酸盐缓冲盐水中。将100 mL再悬浮细菌与NHS-647（0.5 mg/mL）培养5 min，在37°C的黑暗中摇晃。标记的细菌用磷酸盐缓冲盐水清洗一次，再悬浮在RPMI培养基中，然后直接添加到细胞中。使用Volocity软件（Improvision），在37°C的Quorum旋转圆盘徕卡DMIRE2共焦显微镜上进行成像，该显微镜配备63x油物镜。确定感染后（感染后25–30分钟），向培养基中添加庆大霉素（100µg/mL）。使用滨松背向精简的EM-CCD相机每隔1分钟拍摄一次图像，并按照图形图例所示采集z轴堆栈。用Volocity软件进行快速迭代反褶积。

John H.Brumell博士拥有Burroughs Wellcome基金会传染病发病机制奖的研究员。布鲁梅尔实验室的基础设施由加拿大创新基金会和安大略省创新信托基金会的新机遇基金提供。J.H.拥有加拿大胃肠病协会（CAG）/加拿大卫生研究院/加拿大克罗恩和结肠炎基金会（由CAG管理）的博士后奖学金。C.L.B.持有加拿大自然科学和工程研究委员会的加拿大研究生学位。我们感谢Cecilia Alvarez博士、William Balch博士、Walter Beron博士、Fred Gorelick博士、Sergio Grinstein博士、Hirofumi Kai博士、Noboru Mizushima博士、James Rothman博士、Craig Roy博士、Wilam Trimble博士、David Williams博士和Tamotsu Yoshimori博士提供试剂。我们还感谢迈克尔·伍德赛德（Michael Woodside）和保罗·帕罗提斯（Paul Paroutis）对共焦显微镜的帮助，感谢尼古拉·琼斯（Nicola Jones）博士、毛里西奥·特雷比兹尼克（Mauricio Terebiznik）博士和布鲁梅尔实验室对这份手稿的批判性阅读。