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基因发育。2010年6月15日；24(12): 1281–1294.
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预防性维修识别码：项目经理2885663
PMID：20551174

在淋巴瘤形成和维持过程中，Myc和Miz1之间的相互作用需要对抗TGFβ依赖性自分泌信号

扬·范·里格伦,1,2,7 朱迪思·米勒,三，7 托比亚斯·奥托,4,7 文森特·比格,三，5 阿尔珀·叶蒂尔,1,2 彼得·S·崔,1,2 克里斯蒂安·科桑,6 塔里克·莫雷,6 迪安·W·费尔舍,1,2,8,10和马丁·艾尔斯三，8,9
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

Myc蛋白通过与Miz1结合抑制几种细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（CKI）的转录；这种相互作用对Myc诱导或维持肿瘤发生的能力是否重要尚不清楚。在这里，我们表明选择性缺乏与Miz1结合的Myc点突变株（MycV394D）的致癌潜能大大减弱。Myc与Miz1的结合持续需要抑制CKI表达，并抑制T细胞淋巴瘤中Lys 9（H3K9triMe）三甲基化组蛋白H3的积累，这是细胞衰老的标志。出现的淋巴瘤表达大量转化生长因子β-2（TGFβ-2）和TGFβ-3。Myc抑制后，需要TGFβ信号传导来诱导CKI表达和细胞衰老，并抑制肿瘤复发。Myc与Miz1的结合需要对抗TGFβ的生长抑制和衰老诱导。我们证明，由于淋巴瘤表达高水平的TGFβ，它们在Myc失活后会引发衰老的自分泌程序，证明TGFβ是建立T细胞淋巴瘤癌基因成瘾的关键因素。

关键词：Myc、Miz1、衰老、转化生长因子β、淋巴瘤、T细胞

增强的表达式MYC公司致癌基因是许多人类肿瘤的标志，在组织培养和转基因动物中的多次实验证明了解除管制的致癌潜力MYC公司表达式(Oster等人，2002年). 为了解释这些观察结果，我们需要了解编码蛋白Myc促进和维持肿瘤形成的分子机制。

Myc是一种核蛋白，与一种称为Max的伙伴蛋白形成特定的DNA结合复合物。Myc的大多数但不是全部功能取决于与Max的相互作用：例如，Myc与TfIIIb形成复合物，以独立于Max刺激RNA聚合酶III基因的转录(Steiger等人，2008年). Myc/Max复合物与DNA至少以两种不同的方式相互作用。它们可以直接与特定的E-box序列结合，并在结合后刺激大量靶基因的转录(Eilers和Eisenman 2008). 它们也可以被招募到Miz1转录因子，从而形成一个复合物，结合到几个启动子的核心区域。以此方式，Myc/Max复合物抑制Miz1靶基因的转录。

这些不同的复合物如何促进Myc的转化才刚刚开始。Myc转录激活的靶基因对肿瘤形成至关重要：例如，odc1型（编码鸟氨酸脱羧酶）对于Myc诱导的淋巴腺病来说是单倍体充足的，但对于正常发育来说是不充足的，这表明Myc依赖性上调odc1型对Myc推动肿瘤发生至关重要(Nilsson等人，2005年). 类似地，Myc的多个靶基因编码蛋白质合成机制的组成部分，认为促进细胞生长和翻译是Myc促进转化的机制之一。为了有力地支持这一假设，通过删除一个转速24该基因编码一个大核糖体亚单位的蛋白质，不会损害正常发育，但会消除Myc诱导的B细胞淋巴瘤(Barna等人，2008年).

在组织培养中，由于Myc抑制细胞周期依赖性激酶抑制剂（CKIs）的表达，因此异位表达Myc可抑制细胞周期阻滞，而细胞周期阻滞是对转化生长因子β（TGFβ）等多种抗有丝分裂信号的反应p15墨水4b,第21页第1页、和第57页第2页通过与Miz1的交互(Seoane等人，2001年;Gebhardt等人，2006年). 在c-Myc和N-Myc缺失的小鼠中，CKI表达增强也证明了Myc抑制CKI表达(Knoepfler等人，2002年;Oskarsson等人，2006年). 事实上，CKI的代码缺失改善了Myc缺失突变体的表型，表明CKI表达的抑制可能是Myc在肿瘤发生中的关键功能(Oskarsson等人，2006年;Zindy等人，2006年).

T细胞淋巴瘤以及其他多种肿瘤类型中致癌Myc的失活会导致肿瘤快速持续退化(Pelengaris等人，2002年;Shachaf等人，2004年). 将单个癌基因抑制回生理水平可以导致肿瘤急剧退化的观察结果表明，肿瘤对特定癌基因有依赖性(温斯坦2002;Felsher 2008年). 通过观察Myc失活的肿瘤细胞经历与CKI诱导相关的细胞衰老，提示了癌基因成瘾的可能机制(Wu等人，2007年). 因此，细胞衰老可能有助于癌基因失活后的肿瘤退化。

条件转基因小鼠模型为检测Myc表达在诱导和维持肿瘤发生中的作用提供了一种特别容易掌握的策略(Felsher and Bishop 1999年;D’Cruz等人，2001年;Pelengaris等人，2002年). 在这里，我们使用使用强力霉素调节的条件基因表达系统的转基因小鼠模型来研究Myc与Miz1相互作用在T细胞淋巴瘤发展中的作用。我们发现，Miz1和Myc对TGFβ依赖性反馈回路的调节至关重要，该反馈回路在抑制Myc诱导淋巴瘤的机制以及Myc失活诱导癌基因成瘾和诱导肿瘤退行的机制中起着重要作用。

结果

为了与Miz1相互作用，Myc癌蛋白需要一个螺旋-环-螺旋结构域外部的特定表面，该结构域由一系列失去相互作用点突变体定义。其中一个突变体MycV394D缺乏Miz1介导的抑制，但保留了激活转录的能力(Herold等人，2002年;Gebhardt等人，2006年). 为了研究Myc与Miz1在淋巴腺瘤形成过程中的相互作用，我们在多西环素应答最小启动子（tetO-Myc）的控制下，生成了一系列表达野生型Myc或MycV394D的创始小鼠。先前的研究表明，在免疫球蛋白重链增强子和SRα启动子（EμSR-tTA）的控制下，表达野生型Myc的小鼠与表达强力霉素可抑制反式激活蛋白（tTA）的小鼠杂交后，会迅速发展为T细胞淋巴瘤(Felsher and Bishop 1999年).

5周龄双转基因小鼠胸腺裂解物的免疫印迹显示，来自10个创始系中的8个的动物体内人类Myc的表达强劲，与HeLa细胞中Myc蛋白的水平相当（补充图1A）。在初步实验中，我们选择了两个表达MycV394D的品系（指定为VD-1和VD-2）和一个表达野生型Myc（wt-1）的品系的动物，野生型Myc表达人类Myc的水平相似（补充图1A、B）。我们监测了在缺乏强力霉素的情况下维持至少60周的双转基因和单转基因小鼠的肿瘤发展情况。结果表明，相对于wt-1小鼠，两种双转基因V394D株系的淋巴腺病显著延迟(P（P）=0.0084，VD-2和P（P）VD-1分别<0.0001）（补充图1C、D）。在单转基因小鼠中未发生淋巴瘤。研究结果表明，与野生型Myc相比，MycV394D的致癌潜力显著受损。

为了排除本实验中观察到的肿瘤发育差异是由于发育过程中转基因诱导时间进程的创始人特异性差异，我们使用一种在出生后3周诱导转基因表达的方案重复了实验(图1A). 对照实验证实，在强力霉素的存在下，MycV394D和野生型Myc的表达受到严格抑制(图1B). 我们还包括来自另外两个创始系（VD-3和wt-2）的小鼠，以进一步减少由于个体创始系之间的差异而导致的潜在差异；来自所有创始系的小鼠表达了相似水平的人类Myc（不到两倍的变异）（补充图1A、B）。监测这组小鼠表明，表达MycV394D的小鼠的中位生存时间是表达野生型Myc的小鼠的两倍多（47周对20.57周；P（P）< 0.0001) (图1C). 和以前一样，在单转基因动物中没有发生肿瘤，这表明肿瘤的发生是由于Myc转基因的表达（“对照”）(图1C). 与两个野生型创始株系相比，所有三个V394D株系的肿瘤发展较慢，尽管相同基因型的创始株之间存在一些差异（补充图2）。免疫印迹显示，这种差异不是由于Miz1蛋白水平不同所致（数据未显示）。我们通过FACS分析的所有29例肿瘤均为淋巴母细胞T细胞来源，因为它们表达T细胞特异性表面抗原CD3（数据未显示）和CD4，以及不同水平的CD8抗原。在表达野生型Myc或MycV394D的小鼠中产生的淋巴瘤之间，CD4和CD8表面标记物的表达并没有一致的差异(图1D). 我们得出结论，MycV394D诱导T细胞淋巴瘤的能力受损。

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相对于野生型Myc，MycV394D诱导淋巴瘤的能力受损。(A类)实验的时间进程。(B类)多西环素可调节来自五个实验创始品系的动物体内Myc的表达。在所示的时间点处死双转基因小鼠A类胸腺裂解物的免疫印迹用检测人类Myc的抗体9E10和作为负荷对照的Cdk2进行检测。为了进行比较，在最后一条车道上装载了等量的HeLa细胞裂解物。(C类)Kaplan-Meier图总结了表达野生型Myc和MycV394D的双转基因小鼠以及单转基因对照小鼠的肿瘤发展；这里用一张图表总结了具有相同基因型的不同创始系的双转基因小鼠。分析的小鼠数量显示在正确的以及每个基因型小鼠的中位生存率。这个P（P）-显示了表达野生型Myc和MycV394D的双转基因小鼠之间的差异值，并使用log-rank检验进行了计算。所有单转基因或非转基因小鼠作为一个对照组。(D类)记录非转基因小鼠（对照）胸腺中表达T细胞标记CD4和CD8的细胞百分比的FACS分析摘要(n个=2），胸腺（野生型Myc：n个= 7; MycV394D：n个=7）和淋巴瘤（野生型Myc：n个= 10; MycV394D：n个=11）在所示基因型的小鼠中产生。

我们通过免疫组织化学和免疫印迹分析了4到10个在表达野生型Myc或MycV394D的小鼠中产生的单个肿瘤，以确定这种差异的原因。末端脱氧核苷酸转移酶（TUNEL）染色显示，MycV394D小鼠肿瘤中凋亡细胞的百分比显著降低，表明凋亡增强不能解释肿瘤发生的延迟(图2A). 较低的凋亡程度与几个观察结果一致，这些观察结果证明了Myc/Miz1复合物的促凋亡作用(帕特尔和麦克马洪2006;Herkert等人，2010年). 使用Ki67作为标记物来确定未退出细胞周期的细胞百分比，结果表明两种肿瘤类型之间没有差异(图2A). 肿瘤的发生也受到一种称为衰老的不可逆的细胞周期阻滞的限制(2008年获奖者和同行). 组蛋白H3在Lys 9（H3K9triMe）的三甲基化染色显示，与野生型Myc相比，表达MycV394D的小鼠肿瘤中H3K9-triMe阳性细胞的百分比显著增加，这是一种与衰老有关的组蛋白修饰(图2A;Braig等人，2005年). 引人注目的是，双重染色显示，表达MycV394D的淋巴瘤，而不表达野生型Myc的淋巴瘤，其特征是存在大量Ki67和H3K9triMe染色阳性的细胞，表明与Miz1结合是防止H3K9-triMe积聚所必需的，但不是为了维持Ki67的表达(图2B). 值得注意的是，表达衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）的细胞百分比低于表达H3K9triMe的细胞，并且只显示了MycV394D淋巴瘤中阳性细胞数量增加的趋势(图2A). 类似地，Dec1和DcR2这两个致癌诱导衰老的标志物的表达并不能区分MycV394D和野生型Myc转基因小鼠中产生的淋巴瘤(Collado等人，2005年; 数据未显示）。数据表明，与野生型小鼠相比，MycV394D小鼠的肿瘤延迟发展与表达一种衰老标记物（H3K9triMe）的细胞聚集有关，而与其他标记物（例如SA-β-Gal）无关。因此，我们称这些“衰老样”细胞。

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表达野生型Myc或MycV394D小鼠淋巴瘤的分子分析。(A类)左边面板显示用所示抗体或试剂染色的代表性切片，以检测周期G1、S或G2（但不是G0）期细胞的标记Ki67的存在；凋亡细胞（使用末端脱氧核苷酸转移酶和生物素化dUTP“TUNEL”）；以及使用SA-β-Gal或H3K9triMe作为标记物的衰老细胞。这个正确的面板显示了每个标记的多个淋巴瘤染色的量化，以及P（P）-通过双尾Mann-Whitney检验确定的值。(B类)用Ki67和H3K9triMe抗体染色的淋巴瘤代表性切片的免疫荧光图片。中的图片底部行显示所示区域的扩大，证明MycV394D淋巴瘤中存在双阳性细胞。(C类)免疫印迹定量记录野生型Myc或MycV394D淋巴瘤中Tyr 15磷酸化的p27、Cdk1和Cdkl的表达。(D类)上的面板正确的显示包含BrdU的淋巴瘤细胞的百分比。在处死患有淋巴瘤的每种基因型小鼠前3 h注射BrdU（野生型Myc：n个= 8; MycV349D型：n个= 5). 图片显示了用α-BrdU抗体染色的代表性切片。

为了更好地理解为什么V394D淋巴瘤的肿瘤发展延迟，我们用针对细胞周期抑制剂p27Kip1的抗体检测淋巴瘤的免疫印迹(图2C). 与表达野生型Myc的淋巴瘤相比，由MycV394D驱动的淋巴瘤中p27的表达显著增加，表明MycV294D淋巴瘤的增殖缺陷。由于Ki67在细胞周期的G1中期后表达，而p27阻止G1/S边界的进展，数据表明细胞周期的进展存在缺陷(Gerdes等人，1984年;Polyak等人，1994年). 表达MycV394D的淋巴瘤显示Cdk1（Cdc2）水平显著降低，Cdk2在细胞周期的G2和M期表达，是进入有丝分裂所必需的(图2C). 此外，在MycV394D淋巴瘤中，Tyr 15磷酸化的Cdk1比例升高。Cdc25磷酸酶在Tyr 15处的去磷酸化是激活Cdk1所必需的，认为Cdkl在MycV394D淋巴瘤中是不活动的(图2C;Kumagai和Dunphy 1991年). 最后，我们标记了总共13个（野生型Myc:n个= 8; MycV394D：n个=5）体内携带BrdU的淋巴瘤，并观察到与表达野生型Myc(P（P）= 0.024) (图2D). 我们得出结论，表达MycV394D的淋巴瘤细胞在细胞周期的S期和G2期进展中存在缺陷。

有几种途径与衰老有关。在人类成纤维细胞中表达致癌RAS系统，衰老涉及由以下因素引起的DNA损伤反应RAS系统-诱导过度复制，最终通过Chk1激酶导致p53磷酸化和活化(Di Micco等人，2006年). 衰老也可能是Arf蛋白诱导的结果，Arf蛋白抑制Mdm2泛素连接酶，导致DNA损伤无关的p53稳定(Kamijo等人，1997年).

为了探讨这两种途径的差异是否解释了MycV394D转基因小鼠淋巴瘤形成延迟的原因，我们用针对p19Arf、p53和p53的特异性抗体检测了野生型Myc和MycV294D小鼠淋巴瘤的裂解物，这些抗体在Ser 18磷酸化，这是DNA损伤依赖性激活p53的标志(图3A;Shieh等人，1997年). 相对于非转基因胸腺和淋巴癌前细胞，两种基因型的淋巴瘤中Arf蛋白的水平升高到了类似的程度（补充图3A）。这些水平与在p53中发现的水平相比较低−/−成纤维细胞，显然不足以完全抑制Mdm2，因为相对于淋巴癌前细胞和正常细胞，淋巴瘤中的p53水平保持不变。类似地cdkn2a（p19Arf）mRNA在两种基因型淋巴瘤之间没有差异(图3B). 为了进一步排除Arf水平变化导致存活差异的可能性，我们分析了wt-1和VD-2创始系所有动物中Arf的表达，并排除了所有Arf水平可检测到的动物；对剩余动物的分析仍然显示了生存率的显著差异（补充图3B）。我们观察到淋巴瘤中未发现p53在Ser 18磷酸化的显著积累，认为在这种肿瘤模型中，Myc诱导的DNA损伤程度可能较低。与这一概念一致，对9例个体淋巴瘤中编码p53的DNA-结合域的DNA进行测序，发现两种基因型淋巴瘤中该域均无突变（数据未显示）。最后，Ser 345处的Chk1磷酸化水平（这是复制应激的指标）在我们分析的几种肿瘤中非常低，野生型Myc和MycV394D小鼠中产生的淋巴瘤之间没有一致的差异（补充图3C）。综上所述，这些观察结果表明，活性p53水平升高不太可能导致MycV394D淋巴瘤中衰老样细胞的积聚。

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提升的表达cdk2nb公司和cdkn1c在表达MycV394D的淋巴瘤中表达。(A类)免疫印迹记录所示基因型小鼠淋巴瘤中所示蛋白的表达。为了进行比较，如图所示，包括淋巴癌前胸腺和对照胸腺。此外，显示了小鼠胚胎成纤维细胞的裂解物；如有指示，这些细胞在收获前接受UVB照射，以诱导Ser18处p53的Atr-依赖性磷酸化。(B类)RQ-PCR分析记录了在表达野生型Myc或MycV394D的淋巴瘤中所示mRNA的表达。每个点表示一个淋巴瘤的表达。这个Y（Y）-轴显示了相对于非转基因小鼠胸腺的表达水平。P（P）-数值是指两种不同基因型之间的差异，并使用双尾Mann-Whitney检验进行计算。

衰老也可能是由以p53依赖性方式持续抑制细胞周期素依赖性激酶引起的。具体而言，p16Ink4a、p15Ink4b和p21Cip1参与了对致癌应激的调节衰老(Missero等人，1996年;Serrano等人，1997年;Malumbres等人，2000年). 反转录/定量PCR（RQ-PCR）分析表明，表达MycV394D或野生型Myc的淋巴瘤显示相同水平的cdkn1a型（编码p21Cip1），cdkn1b型（第27Kip1页），以及cdkn2a（p16墨水4a）(图3B). 相比之下，MycV394D淋巴瘤表达的cdkn2b型（p15Ink4b）和cdkn1c（p57Kip2）与表达野生型Myc的淋巴瘤相关。

两者都有cdkn2b型和cdkn1c通过Miz1被Myc直接抑制，表明其表达增强可能反映了MycV394D小鼠淋巴瘤中缺乏Miz1依赖性抑制(Staller等人，2001年;Adhikary等人，2003年). 染色质免疫沉淀（ChIP）实验证实，Myc和Miz1都结合到cdkn2b型淋巴瘤细胞中的启动子，与Myc通过与Miz1的相互作用积极抑制p15Ink4b表达的建议一致(图4A). 为了直接测试这一概念，我们培养了Myc和MycV394D淋巴瘤的细胞，并添加多西环素来阻断Myc的表达。添加强力霉素可快速诱导cdkn2b型表达野生型Myc的细胞中mRNA和p15Ink4b蛋白(图4B、C). 表达MycV394D的细胞显示cdkn2b型mRNA和p15Ink4b蛋白，即使在没有强力霉素的情况下，尽管MycV394D蛋白表达强劲，但证实MycV294D在转录抑制cdkn2b型(图4B、C;Gebhardt等人，2006年). 向表达MycV394D的细胞中添加多西环素导致cdkn2b基因表达，辩称MycV394D在与Miz1的相互作用中受到损害，但并非完全不足。对于表达cdkn1c还有cdkn1a型mRNA(图4C).

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持续需要Myc/Miz1复合物来抑制cdk2nb公司和cdkn1cT细胞淋巴瘤。(A类)ChIP分析证明了多西环素调节的Myc的存在和Miz1在细胞起始位点的组成性存在cdkn2b型T细胞淋巴瘤中的基因。淋巴瘤细胞要么是未经处理就采集的，要么是在培养基中添加强力霉素，24小时后采集细胞。Myc和Miz1在cdkn2b型与−1-kb上游控制区相比，显示了转录起始位点。(B类)添加多西环素后表达Myc或MycV394D的培养淋巴瘤细胞的时间进程实验总结。用针对Myc（9E10）、p15Ink4b和Cdk2的抗体检测免疫印迹。细胞在不含强力霉素的培养基中生长，或在添加强力霉素后的指定时间收获。(C类)淋巴瘤细胞如图所示B类通过RQ-PCR分析证明cdkn2b型,cdkn1a型、和cdkn1c型在这些实验条件下的mRNA。(D类)表达多西环素调节野生型Myc的淋巴瘤细胞被组成性表达野生型Myc或MycV394D的逆转录病毒感染。选择后，添加强力霉素以关闭强力霉素调节的Myc等位基因的表达，48小时后收获细胞。对照实验证实，6小时后检测不到强力霉素调节的Myc。面板显示RQ-PCR和免疫印迹分析，记录了所示mRNA和蛋白质的表达。(E类)记录细胞生长的生长曲线C类在强力霉素存在下。

为了证实淋巴瘤中表达的差异不是由于克隆变异，而是反映了Myc和MycV394D抑制淋巴瘤细胞中这两个基因表达能力的内在差异，我们用组成性表达野生型Myc或MycV394D的逆转录病毒感染表达四环素调节的野生型Myc等位基因的淋巴瘤细胞，并通过添加强力霉素关闭四环素调控等位基因表达。在这些条件下，只表达逆转录病毒Myc等位基因。随后的分析表明，表达MycV394D的淋巴瘤细胞的cdkn2b基因mRNA和p15Ink4b蛋白相对于表达野生型Myc的细胞，尽管它们强烈表达MycV394D蛋白(图4D). 事实上，我们一直观察到MycV394D在这些检测中的表达水平略有升高，这很可能是因为它诱导凋亡的能力受到损害(帕特尔和麦克马洪2006). MycV394D细胞也表现出适度升高的cdkn1cmRNA，而cdkn1a型mRNA没有改变，与淋巴瘤中观察到的表型非常相似。此外，载体感染的淋巴瘤细胞在强力霉素存在下完全停止增殖（数据未显示）。表达野生型Myc的病毒感染的细胞在强力霉素的存在下生长旺盛，而在强力环素的存在下，MycV394D在挽救生长时受到损害(图4E). 总的来说，这些数据表明Myc持续抑制cdkn2b型和cdkn1c通过与淋巴瘤细胞中的Miz1相互作用。而由MycV394D驱动的淋巴瘤表达的cdkn1a型在体外，这在体内没有观察到，这表明Myc的额外蛋白质相互作用有助于抑制cdkn1a型Myc体内试验(Gartel等人，2001年).

在人类成纤维细胞中cdkn2b型在肿瘤诱导衰老过程中由白细胞介素-6（IL6）依赖性自分泌机制上调(Kuilman等人，2008年). 然而，IL6 mRNA的表达在没有任何衰老迹象（数据未显示）的T淋巴细胞和淋巴瘤细胞之间没有差异，这表明IL6在这些实验条件下可能不起关键作用（补充图4A）。在造血细胞中，TGFβ刺激p15Ink4b和p57Kip2的表达，提示TGFβ可能是其在T细胞淋巴瘤中表达的生理诱导剂(马萨格2008). 作为对这一假设的第一次检验，我们测量了TGFβ-1、TGFβ-2和TGFβ-3 mRNA在幼稚T细胞和表达野生型Myc或MycV394D的淋巴癌前T细胞以及两种基因型的T细胞淋巴瘤中的表达(图5A). 在幼稚和淋巴癌前T细胞中几乎未检测到任何TGFβ亚型的表达。虽然TGFβ-1的表达没有增加，但我们观察到淋巴瘤细胞中TGFβ-2和TGFβ-3的表达强烈增加。MycV394D淋巴瘤有表达TGFβ两种亚型增强的趋势；目前尚不清楚这是否反映了Myc/Miz1复合物对任一基因启动子的直接影响。使用识别TGFβ-2的抗体的免疫组织化学证实，相对于正常T细胞，淋巴瘤表达了强烈增强的该蛋白水平(图5B).

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在培养的淋巴瘤细胞中，细胞周期抑制剂的表达和衰老需要TGFβ依赖的信号转导。(A类)淋巴腺病期间TGFβ途径的激活。该小组记录了非转基因胸腺中编码TGFβ亚型的mRNA的RQ-PCR分析(n个=2），在转基因胸腺中（野生型Myc:n个= 2; MycV394D：n个=2），在表达野生型Myc的淋巴瘤细胞中(n个=8）或MycV394D(n个= 11). 此面板和后续面板显示了所示样本数的平均表达值。非转基因胸腺中的表达被任意设置为1。(B类)利用识别TGFβ-2的抗体进行免疫组织化学(顶部行）和磷酸化Smad2和Smad3(底部行）。染色显示了针对每个基因型分析的三种肿瘤的代表性示例。(C类)RQ-PCR分析记录了TGFβ途径的选定下游靶基因在相同样本中的表达，如A类面板显示了相对于非转基因胸腺的表达水平。(D类)需要TGFβ依赖性信号传导来诱导cdkn2b型和cdkn1a型当Myc表达被抑制时。用表达可溶性TβR-II-ED的对照病毒或逆转录病毒转导T细胞淋巴瘤细胞。如有指示，向培养基中添加多西环素，48小时后收获细胞。小组记录了RQ-PCR分析，用于测量所示mRNA的表达。(E类)FACS分析记录了抑制Myc表达后，对照淋巴瘤细胞和表达TβR-II-ED的淋巴瘤细胞在细胞周期G1期的积聚。(F类)免疫印迹分析显示，添加重组TGFβ1仅在表达MycV394D的淋巴瘤细胞中诱导p15Ink4b蛋白表达。(G公司)在表达MycV394D的淋巴瘤细胞中添加重组TGFβ1可诱导细胞周期阻滞，但在表达野生型Myc的细胞中没有。(H（H）)添加重组TGFβ1可诱导表达MycV394D的淋巴瘤细胞衰老，但不诱导表达野生型Myc的细胞衰老。使用SA-β-Gal染色分析衰老。

TGFβ受体的参与导致Smad2和Smad3转录因子磷酸化(2008年按摩). 为了测试TGFβ通路在淋巴瘤中是否活跃，我们使用针对磷酸化Smad2和Smad3的抗体进行了免疫组织化学，发现在表达野生型Myc或MycV394D的T淋巴瘤细胞的细胞核中存在高水平的磷酸化Smad2/3蛋白；相反，在正常T淋巴细胞中只发现弱染色(图5B). 此外，我们测量了该途径的四个目标基因的表达：pai1（pai1）和混合物1TGFβ信号转导的靶基因在T细胞淋巴瘤中的表达水平高于原始T细胞和淋巴癌前T细胞(图5C). 相反，势利的人在T细胞淋巴瘤中表达较低水平，TGFβ依赖性信号抑制其表达。与这些观察结果一致，cdkn2b型在幼稚和淋巴癌前T细胞中以极低水平表达。其表达在表达野生型Myc的淋巴瘤中中度升高，在MycV394D淋巴瘤中强烈升高(图5C). 总之，数据表明TGFβ通路在T细胞淋巴瘤中是活跃的，但在正常和淋巴结前T细胞中不是，并且Myc抑制cdkn2b型而不是TGFβ途径的其他靶基因，通过与Miz1的相互作用。与TGFβ在淋巴瘤中选择性活性的概念一致，CKI的表达没有明显差异，包括cdkn2b型，在对照胸腺和表达野生型Myc或MycV394D的前淋巴标记T细胞之间（补充图4B）。

为了确定TGFβ是否确实是增强淋巴瘤细胞p15Ink4b表达的驱动力，我们在表达野生型Myc(图5D;托马斯和马萨格2005). 添加多西环素导致Myc转基因在对照细胞和表达TβR-II-ED的细胞中快速丢失表达(图5D). 此外，这导致Myc直接诱导的两个基因的TGFβ非依赖性下调：核仁蛋白(ncl标准)和odc1型(图5D). 与我们之前的观察结果一致，添加多西环素导致cdkn2b型和cdkn1a型表达式。TβR-II-ED的表达消除了这一点，证明两种CKI的诱导都需要TGFβ信号。

FACS分析表明，当Myc被关闭时，淋巴瘤细胞以TGFβ非依赖性的方式进行细胞周期阻滞，这表明拮抗TGFβ信号并不是Myc维持淋巴瘤细胞增殖的唯一功能(图5E). 与这个概念一致，当Myc被关闭时，表达Myc或MycV394D的淋巴瘤细胞经历细胞周期阻滞和凋亡（补充图5A）。

为了测试对TGFβ的反应是否是表达野生型Myc或MycV394D的淋巴瘤细胞不同生长行为的关键决定因素，我们将TGFβ添加到表达野生型Myc或Myc V394d的淋巴瘤细胞中。TGFβ的添加导致p15Ink4b表达增加，特别是在表达MycV394D的淋巴瘤细胞中，但在表达野生型Myc(图5F). 与这些发现一致，TGFβ诱导表达MycV394D的淋巴瘤细胞在细胞周期G1期的聚集，而对表达野生型Myc的淋巴瘤细胞的细胞周期分布没有影响(图5G). 类似地，TGFβ的添加诱导了表达MycV394D的培养淋巴瘤中衰老细胞的积累，但在表达野生型Myc的细胞中没有(图5H). 我们还观察到TβR-II-ED的表达优先加速表达MycV394D的细胞的生长，而它对表达野生型Myc的淋巴瘤细胞的生长几乎没有影响（数据未显示）。我们得出结论，Myc与Miz1的相互作用是特异性必需的，以拮抗淋巴瘤细胞生长中的TGFβ信号。

加入强力霉素后，TβR-II-ED的表达也降低了淋巴瘤细胞的衰老诱导(图6A). 为了将这些发现扩展到体内情况，我们将对照细胞和表达TβR-II-ED的细胞注射到同基因免疫活性小鼠（FVB/N）中(图6B). 肿瘤形成后，将多西环素添加到饮用水中，然后在不同的时间点收获肿瘤。RQ-PCR分析显示cdkn2b型和cdkn1a型当Myc被关闭时，在体内以TGFβ依赖的方式诱导cdkn1c添加多西林后也显著增加，但部分独立于TGFβ，认为附加信号可能有助于体内诱导CKI表达(图6B). 如预期odc1型和ncl标准添加强力霉素后，TGFβ非依赖性降低（补充图5B）。我们以前的工作表明，在这些情况下，诱导凋亡和诱导衰老都有助于肿瘤的消退(Wu等人，2007年). TUNEL染色证实，当Myc的表达被切断时，细胞凋亡的快速诱导。重要的是，在对照细胞和表达TβR-II-ED的细胞中，细胞凋亡的诱导程度相似，表明其独立于TGFβ(图6C). 相反，SA-β-Gal染色(图6D)或H3K9triMe(图6E)发现当体内Myc被关闭时，淋巴瘤发生TGFβ依赖性衰老。在这些条件下，SA-β-Gal阳性细胞百分比的增加与H3K9triMe阳性细胞的增加密切相关，表明当体内Myc表达被关闭时，淋巴瘤细胞经历“完全”TGFβ依赖性衰老。

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体内发生TGFβ依赖性衰老。(A类)当Myc被关闭时，诱导衰老需要TGFβ依赖的信号转导。该面板显示了对照淋巴瘤细胞（“GFP”）或表达TβR-II-ED的细胞的百分比，这些细胞在添加强力霉素后SA-β-Gal染色阳性。(B类)TGFβ依赖性信号转导调节体内CKI的表达。将对照淋巴瘤细胞和表达TβR-II-ED的细胞皮下注射到同基因免疫活性小鼠（FVB/N）中。在可触及的肿瘤发生后，将多西环素添加到指定的饮用水中，然后在指定的时间肿瘤恢复。该小组记录了RQ-PCR分析所示基因表达的结果。(C类)当Myc的表达被关闭时，T细胞淋巴瘤中的凋亡诱导独立于TGFβ。按照上述方法注射小鼠并采集肿瘤。面板显示了经TUNEL染色的淋巴瘤组织的代表性切片，以显示凋亡细胞。(D类)TGFβ依赖性诱导T细胞淋巴瘤衰老。如前所述进行实验，冰冻切片并对其进行SA-β-Gal染色(E类)与中所示的平行截面B类H3K9triMe染色。

衰老是一种不可逆转的生长停滞形式；此外，衰老细胞可以被先天免疫系统的细胞清除(Xue等人，2007年). 因此，当Myc被关闭时，衰老的诱导可能有助于肿瘤的稳定消退。事实上，p16Ink4a或其下游介质视网膜母细胞瘤蛋白的耗竭有助于Myc关闭时的复发(Wu等人，2007年). 添加多西环素后，淋巴瘤迅速消退，与是否表达TβR-II-ED无关。然而，与对照组相比，持续向小鼠饮用水中添加多西环素后，表达TβR-II-ED的淋巴瘤复发速度显著加快，与TGFβ对促进衰老至关重要的概念一致(图7). 这些数据有力地支持了这样的观点，即TGFβ依赖性衰老有助于在这些情况下的稳定缓解。

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当Myc的表达被逆转时，TGFβ依赖性衰老是持续退化所必需的。如上所述给小鼠注射，当可触及的肿瘤发生时，向饮用水中加入多西环素。随后，对小鼠进行复发监测。

讨论

我们证明，Myc与Miz1转录因子形成抑制复合物的能力对于Myc诱导和维持淋巴腺病非常重要。我们建议一个模型(图8)其中Myc与Miz1的相互作用拮抗TGFβ途径抑制增殖和诱导衰老特征的能力。我们表明，通过将Myc抑制到生理水平，我们可以通过TGFβ途径恢复生长抑制和衰老诱导，这对于诱导持续的肿瘤退行性和癌基因成瘾至关重要。这种自分泌调节回路对Myc诱导肿瘤发生的能力以及Myc失活诱导肿瘤消退的机制至关重要。

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Myc诱导的T细胞淋巴瘤癌基因成瘾模型。我们认为，由于淋巴瘤细胞表达高水平的TGFβ，因此有一个持续的压力来诱导分化和衰老的自分泌程序，而正常淋巴细胞中没有这种程序。

四个关键观察结果表明，Myc与Miz1的相互作用对淋巴腺病至关重要：首先，由Myc的点突变（MycV394D）诱导的淋巴腺病，该点突变不能与Mizl结合，但保留与Max结合的能力，与野生型Myc诱导的淋巴瘤相比，激活转录明显延迟。在三只独立的创始小鼠中观察到这种延迟，并且在转基因表达水平及其时间顺序都受到严格控制的条件下，强烈认为这是由于MycV394D等位基因在肿瘤诱导中的内在缺陷。第二cdkn2b型和cdkn1c在组织培养中被Myc和Miz1抑制的两个基因，在由MycV394D产生的淋巴瘤中相对于那些表达野生型Myc的淋巴瘤中升高。第三，ChIP实验证明Myc和Miz1都存在于cdkn2b型淋巴瘤细胞中的启动子。第四，体外或体内逆转癌基因表达表明，Myc/Miz1复合物持续需要抑制cdkn2b型和cdkn1cT细胞淋巴瘤中的表达。

我们的结果可以根据之前的几项研究来解释，这些研究使用Myc依赖性淋巴瘤模型来破译Myc下游靶基因的作用。值得注意的是，两者都是odc1型和转速24对Myc依赖性淋巴腺病来说是单倍的，但对正常发育来说是不够的，强烈认为它们在Myc诱导的肿瘤中的增强表达对肿瘤的发展至关重要(Nilsson等人，2005年;Barna等人，2008年). 重要的是，Myc诱导的蛋白质合成增加和odc1型在淋巴癌前状态下表达明显。相反，我们没有观察到任何CKI在淋巴癌前T细胞中的表达有任何差异。野生型Myc和MycV394D之间的差异仅在淋巴瘤中表现出来，这是由于淋巴瘤形成时TGFβ合成强烈增加所致。导致这一增长的机制仍有待解决。值得注意的是，TGFβ-2和TGFβ-3的表达与该肿瘤模型中p19Arf的表达密切相关，因此这三个基因都可能对肿瘤细胞中特有的致癌应激信号作出反应（参见图4A; 补充图3A、B）。此外，肿瘤中存在的其他细胞可以作为体内转化生长因子β的来源：例如，在Myc驱动的B细胞淋巴瘤模型中，淋巴瘤细胞的凋亡吸引分泌转化生长因子β1的巨噬细胞(Reimann等人，2010年).

相对于表达野生型Myc的淋巴瘤，由MycV394D诱导的淋巴瘤表达p27水平升高，Cdk1水平降低，BrdU掺入较少，这清楚表明细胞增殖缺陷。同时，两种基因型的绝大多数淋巴瘤细胞都表达Ki67。Ki67在增殖细胞的G1中期表达，但在静止细胞中不表达；因此，Ki67的存在表明这些细胞尚未退出细胞周期(Gerdes等人，1984年). 这些发现强烈表明，在一种模型中，Myc依赖于E-box的激活足以阻止退出细胞周期，但Myc与Miz1的结合是促进快速增殖和淋巴瘤发展所必需的。

表达MycV394D的淋巴瘤中有很大一部分细胞H3K9triMe染色阳性，这与增殖延迟一致。H3K9triMe的积累是衰老的标志，在B细胞淋巴瘤模型中，催化这种修饰的酶（Suv39h1）是衰老的原因所必需的(Braig等人，2005年;Reimann等人，2010年). 事实上，MycV394D驱动的淋巴瘤含有大量组蛋白H3K9triMe和Ki67染色阳性的细胞，这表明H3K9triMe的积累可能阻止这些细胞的细胞周期进展。一种可能的解释是，观察到H3K9triMe在衰老细胞中E2F转录因子的靶基因上积累，与这些基因的稳定抑制和细胞周期阻滞相关(成田等人，2003年).

当Myc转基因在体内或体外被关闭时，淋巴瘤细胞以TGFβ依赖的方式聚集H3K9triMe和衰老的第二个标记SA-β-Gal。在体外用转化生长因子β治疗由Myc394D驱动而非野生型Myc驱动的淋巴瘤细胞时，也会积聚SA-β-Gal。相反，在体内表达MycV394D的淋巴瘤中，SA-β-Gal的积累程度与H3K9triMe不同。导致衰老细胞中SA-β-Gal积聚的分子过程尚不清楚；因此，SA-β-Gal的积累在不同程度上反映了两种检测中表达野生型Myc或MycV394D的淋巴瘤细胞的生物学差异，其确切原因尚待确定。

为了确定MycV394D淋巴瘤延迟增殖的基础，我们认为至少有两个机制上不同的过程已知会导致肿瘤诱导的衰老：首先，衰老是以p53依赖的方式发生的，是对DNA损伤或Arf抑癌蛋白表达的反应(Kamijo等人，1997年;Di Micco等人，2006年). 一些论点表明，这一过程与此处观察到的衰老没有因果关系：具体来说，分析p53或Arf的表达水平，监测p53及其上游调节因子Chk1的磷酸化状态，对表达野生型Myc或MycV394D的淋巴瘤中编码p53的DNA-结合域的DNA进行测序，未发现在该肿瘤模型中淋巴瘤发展过程中p53通路激活的证据。

衰老也可能是对多种细胞因子分泌的反应，IL6的合成增强是肿瘤诱导人原代成纤维细胞衰老的原因(Coppe等人，2008年;Kuilman等人，2008年). IL6通过上调cdkn2b型和cdkn2a，但在这里研究的细胞中不受调控(Kuilman等人，2008年). 相反，TGFβ-2和TGFβ-3是这些淋巴瘤细胞周期阻滞和衰老的关键诱导因子；从概念上讲，淋巴瘤细胞分泌TGFβ-2和TGFβ-3与这些研究中描述的分泌性衰老相似。

TGFβ如何在表达MycV394D的淋巴瘤细胞中抑制增殖并增强衰老样状态？转化生长因子β通过上调MXD1型（Mad1），从而促进人类骨髓细胞的衰老(Wu等人，2009年). 类似的机制可以解释TGFβ1在组成性表达Myc的B细胞淋巴瘤中维持一定程度衰老的能力(Reimann等人，2010年). 然而，微阵列分析并未显示TGFβ对任何万加元此处研究的细胞中的mRNA（数据未显示）。此外，几乎所有MycV394D淋巴瘤细胞Ki67染色阳性，而当Myc被关闭时，细胞变成Ki67阴性，这一观察结果表明，MycV294D淋巴瘤的Myc功能通常不会受到损害。与野生型Myc驱动的淋巴瘤相比，MycV394D驱动的淋巴瘤表达水平升高cdkn2b型和cdkn1cmRNA和Cdk2抑制剂p27Kip1水平升高，认为这些淋巴瘤中的Cdk1活性受到损害。值得注意的是，Cdk2最近被证明在抑制Myc转化细胞的衰老中具有特定作用(Campaner等人，2010年). 这至少部分是由于Cdk2磷酸化Ser 62；由于Ser 62的磷酸化是激活Myc靶基因子集所必需的，因此cyclin E/Cdk2是Myc靶基因组子集的辅激活子(Benassi等人，2006年;Hydbring等人，2010年). 综合起来，数据表明MycV394D不能抑制cdkn2b型和cdkn1c表达减缓了细胞周期超过G1期的进程，并且低水平的Cdk2活性加强了这些细胞的衰老状态。

TGFβ可能通过多种机制促进肿瘤的消退。例如，衰老细胞被先天免疫系统瞄准(Xue等人，2007年). 此外，将表达MycV394D的小鼠杂交到cdkn2b型−/−背景并没有显著加速淋巴细胞增多；因此，CKI不太可能是唯一由Myc通过Miz1调节的TGFβ依赖基因（数据未显示）。与这一概念相一致，广泛的微阵列实验表明TGFβ诱导的衰老不仅限于CKI表达增强，还包括一些发育谱系特有的基因表达增强，在淋巴腺病期间，需要持续高水平的Myc表达来阻断这种谱系特异性基因的表达（JM和ME，未定）。由于Myc的致癌特性强烈依赖于其靶组织的发育状态，因此，一旦Myc转基因被关闭，作为TGFβ反应的谱系特异性基因增强表达基础的迄今尚未确定的分子变化可能会阻止肿瘤复发(Beer等人，2004年).

我们的研究结果可能不仅对Myc如何启动肿瘤发生，而且对Myc失活如何诱导癌基因成瘾和肿瘤消退具有潜在的重要机制意义(温斯坦2002;Felsher 2008年). 他们认为，自分泌调节途径可能在癌基因成瘾中发挥重要作用。我们的研究表明，淋巴瘤细胞表达高水平的TGFβ，因此一旦Myc失活后该途径恢复，就会引发衰老的自分泌程序，这有助于肿瘤持续退化。因此，当肿瘤中Myc的生理水平恢复时，只要TGFβ途径仍有功能，衰老程序就会显现出来。值得注意的是，TGFβ信号传导的阻断并不影响最初的肿瘤消退。与我们之前的报告一致，Myc失活诱导增殖停滞、凋亡和衰老(Wu等人，2007年). TGFβ信号转导的消除大大抑制了细胞衰老的诱导，并导致肿瘤复发的频率显著增加，这表明功能性TGFβ通路对肿瘤细胞的永久清除至关重要。

材料和方法

动物实验

转基因小鼠系的制备及鉴定MYC公司（TetO-MYC）已描述(Felsher and Bishop 1999年). 所有动物实验均按照斯坦福大学实验动物护理管理委员会的指南（方案14045）进行。关闭MYC公司转基因小鼠表达，饮用水补充200μg/mL多西环素。

肿瘤监测分析

为了监测肿瘤生长、消退和复发，将无瘤生存率作为多西环素治疗（如果肿瘤消退发生在1周内）和复发之间的时间进行测量，复发被定义为发病迹象的复发。Kaplan-Meier曲线的统计比较基于对数秩检验。对于移植实验，10×106在皮下注射FVB/N同基因小鼠之前，细胞在PBS中清洗一次。为了评估肿瘤的消退，在强力霉素治疗30天期间，使用卡尺测量皮下移植肿瘤的尺寸，并使用长度（mm）×宽度公式计算肿瘤体积2（毫米2) × 0.52.

细胞培养

来自小鼠T细胞淋巴瘤的细胞系在添加了10%FBS、1%青霉素/链霉素、1%谷氨酰胺和50μM 2-巯基乙醇的RPMI1640中生长。要关闭MYC公司将转基因细胞以20 ng/mL的强力霉素处理指定时间。

免疫组织化学

采集移植的皮下肿瘤，并将其固定在中性缓冲的10%福尔马林中进行石蜡切片。从石蜡包埋块上切下组织切片，放在玻璃载玻片上。使用标准程序进行苏木精和伊红（H&E）染色。斯坦福大学组织学核心实验室准备石蜡切片并进行H&E染色。使用的抗体列于补充表3。如前所述，检测细胞株和肿瘤中的SA-β-Gal活性(Serrano等人，1997年).

基因表达分析

按照制造商的方案，使用RNeasy试剂盒（包括DNase-I消化物（Qiagen））从snap冷冻细胞系或小鼠组织中分离出总RNA。使用寡核苷酸（dT）将两微克RNA反转录到cDNA中12–18引物（Invitrogen）和SuperScript II逆转录酶（Invit罗gen）。在ABI Prizm分析仪中使用SYBR Green（ABI）进行实时PCR。定量PCR引物的序列列于补充表1。

ChIP分析

根据制造商的说明，使用Upstate Cell Signaling Solutions Kit进行ChIP分析。细胞在37°C下用1%甲醛交联10分钟，并用含蛋白酶抑制剂的冰PBS鸡尾酒Complete（Roche Diagnostics）清洗。2×10裂解后6细胞，DNA通过超声剪切成200至1000个碱基对片段，并用2μg抗Myc和抗Miz-1抗体进行免疫沉淀。补充表2和3列出了ChIP-QPCR引物的抗体和序列。

荧光辅助细胞筛选分析

对于淋巴瘤细胞系的细胞周期分析，使用碘化丙啶。收集细胞并将其固定在70%乙醇中，用0.1%Triton X-100溶液在含有0.22 mg/mL RNase a和20μg/mL碘化丙啶的PBS中染色。DNA含量用Becton Dickinson流式细胞仪测量。

致谢

我们感谢安东·伯恩斯赠送cdkn2b型−/−老鼠。这项研究得到了德意志联邦基金会通过Transregion 17（“人类癌症中的Ras-dependent途径”）的资助，以及Sander-Siftung到M.E.J.v.R.的资助，得到了淋巴瘤研究基金会的支持。D.W.F.得到了NIH、白血病和淋巴瘤协会以及Burroughs Wellcome基金会的资助。

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文章来自基因与发育由以下人员提供冷泉港实验室出版社