实时体内成像第16页^墨水4a基因表达：研究活体动物衰老应激信号的新途径

实时成像第16页^INK4a公司活体动物的基因表达

为了监控人类第16页^INK4a公司为了尽可能准确地表达基因，我们使用了人类染色体的一个大的基因组DNA片段，该片段包含INK4a/ARF公司基因位点（图​轨迹（图1）。1). 此外，该人类染色体片段被设计用于表达人类p16的融合蛋白^INK4a公司和萤火虫荧光素酶，而不删除INK4a/ARF公司基因位点（图​（图1）。1). 这一点至关重要，因为BMI-1是第16页^INK4a公司基因表达[38]，已被证明不仅与启动子区域结合，还与第16页^INK4a公司基因座[39]. 此外，p16-luc融合蛋白的表达使我们能够指定第16页^INK4a公司基因表达，但不是农业研究基金基因表达，来自这个重叠的基因位点。

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图1

战略体内成像第16页^INK4a公司基因表达人类染色体的一个大基因组DNA片段（195.4 kb），包含整个INK4a/ARF公司基因位点和周围序列被设计用于表达荧光素酶标记的p16^墨水4aFISH技术显示，转基因小鼠系（p16-luc）含有人类染色体片段的一个拷贝。箭头表示转基因。将p16-luc小鼠麻醉体内注射荧光素后的生物发光成像。

通过监测和量化同一生物发光信号p16-luc页在老鼠的整个生命周期中，我们能够揭示人类的动力学第16页^INK4a公司转基因小鼠衰老过程中的基因表达（图​（图2）。2). 此外，重要的是，生物发光信号水平不仅与外源性（人类）密切相关，也与内源性（小鼠）密切相关第16页^INK4a公司基因表达，表明人类的整体调节第16页^INK4a公司基因表达与小鼠非常相似第16页^INK4a公司基因表达，至少在小鼠细胞中[37]. 这与之前的概念一致，即第16页^INK4a公司啮齿动物和灵长类动物在衰老过程中基因表达增加[20,40-43]. 这些结果说明了p16-luc页用于分析的小鼠第16页^INK4a公司体内响应致癌刺激的基因表达。

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图2

实时生物发光成像第16页^INK4a公司衰老过程中的基因表达体内相同的p16-luc小鼠在其整个生命周期内均接受非侵入性BLI。在衰老过程中，整个身体的生物发光信号水平显著增加。

的响应第16页^INK4a公司致癌刺激的基因表达体内

尽管致癌Ras的异位表达通过上调p16启动细胞衰老^INK4a公司培养的正常人成纤维细胞的表达[三,4,13,14,44]，新鲜分离的正常人成纤维细胞并非如此[23]. 因此，尚不清楚第16页^INK4a公司培养细胞中致癌Ras表达的基因表达真正反映了抗癌过程或组织培养施加压力的伪影。为了在更生理学的背景下探索这一概念，而不是使用培养细胞中致癌Ras的异位表达p16-luc页小鼠接受常规化学诱导皮肤乳头状瘤方案，单剂量DMBA，然后用TPA进行多次治疗。因为该方案会诱发良性皮肤乳头状瘤，其中90%以上的乳头状瘤在H-ras公司基因[45,46]，这似乎是研究内源性致癌突变的生理反应的理想方法H-ras公司基因体内.

当p16-luc小鼠接受DMBA/TPA方案治疗时，良性皮肤乳头状瘤在治疗7周后开始出现，并在接下来的18周内继续增大（早期乳头状瘤）。尽管在此期间几乎无法检测到生物发光信号，但随着乳头状瘤停止生长（晚期乳头状瘤），生物发光信号显著增加（图​（图3）。三). 生物发光信号的水平与内源性信号的水平有很好的相关性第16页^INK4a公司表达，以及其他衰老标志物，如衰老相关（SA）-半乳糖苷酶（-gal）活性和pRb去磷酸化[37]表明源自内源性H-Ras基因的致癌Ras信号确实刺激第16页^INK4a公司表达，伴有衰老细胞周期阻滞，体内。这也表明第16页^INK4a公司可能在晚期乳头状瘤中起重要作用，可能阻止良性肿瘤的恶性转化。与这一观点一致的是，在DMBA/TPA治疗后30周，约33%的第16页^INK4a公司敲除小鼠（C57BL/6背景）至少有一种癌症，而野生型小鼠只有5%（未发表数据）。这些结果也与之前的一项研究相一致，该研究表明，DMBA处理小鼠的无瘤生存率在第16页^INK4a公司基因敲除小鼠[47].

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图3

p16实时成像^INK4a公司皮肤乳头状瘤发生过程中的表达. Thep16-luc页小鼠接受传统的化学诱导皮肤乳头状瘤方案，单剂量DMBA，然后用TPA进行多次治疗。该方案导致H-ras型基因。DMBA治疗7周后，良性皮肤乳头状瘤开始出现，并持续生长至20周左右。然而，在此之后，大多数乳头状瘤停止生长。因此，我们将这些生长性乳头状瘤分为早期乳头状瘤和晚期非生长性乳头瘤。对p16-luc小鼠进行非侵入性BLI，在晚期乳头状瘤中检测到显著升高的生物发光信号。颜色栏指示具有最小和最大阈值的光子。

表观遗传调控机制第16页^INK4a公司基因诱导

考虑到H-ras公司DMBA治疗后立即出现基因[45]，令人困惑第16页^INK4a公司晚期乳头状瘤（图​（图3）。三). 有趣的是，DNMT1的水平被认为可以抑制第16页^INK4a公司基因表达在早期乳头状瘤中显著增加，随后在晚期乳头状瘤中减少[37]. 此外，有趣的是，组蛋白3 Lys 9甲基化（H3K9me）的状态，而不是CpG甲基化第16页^INK4a公司基因启动子与乳头状瘤发展过程中DNMT1表达水平密切相关[37]. 这些结果，以及最近的一项观察，即DNMT1通过与G9a（一种主要的H3K9单甲基和双甲基转移酶）相互作用，具有增强H3K8甲基化的活性[48]，表明DNMT1有助于平衡第16页^INK4a公司皮肤乳头状瘤发生过程中致癌Ras介导的基因启动子。值得注意的是，在培养的人原代成纤维细胞中，DNMT1的水平最初通过致癌Ras的表达而升高，随后随着细胞达到衰老阶段而降低[37]. 总之，这些结果表明，类似的机制可能参与对第16页^INK4a公司致癌Ras信号转导的基因表达在体外和体内.

DNA损伤反应调节第16页^INK4a公司通过DNMT1进行基因表达

此前已有研究表明，致癌Ras信号通过AP1激活DNMT1基因启动子[49]. 因此，DNMT1表达的诱导似乎是由致癌Ras表达的直接作用引起的。然而，尚不清楚DNMT1在乳头状瘤发展的晚期是如何减少的。我们的结果强烈表明，超细胞增殖引发的DNA损伤反应（DDR）[50-52]在阻止中发挥关键作用DNMT1型晚期乳头状瘤中活性氧（ROS）水平升高导致的基因表达（至少部分）[37]. 自DNMT1型已知基因表达受E2F调节[53]E2F活性降低H₂O（运行）₂治疗（未公布的数据），ROS很可能调节DNMT1型通过E2F表达，至少部分表达。这些结果，再加上DNMT1的缺失导致第16页^INK4a公司培养人细胞中的基因表达[54,37]，表明DDR在诱导第16页^INK4a公司阻断基因表达DNMT1型Ras诱导衰老的表达体内.

因为检测到DNA损伤后，p53抑癌基因立即被激活，防止DNA损伤的累积[55,56]，p53可能阻断DDR通路的激活第16页^INK4a公司基因表达。为了探索这个想法，我们再次利用p16-luc页小鼠，与p16-luc页缺少第53页基因[37]. 事实上，尽管用DNA损伤剂阿霉素（DXR）治疗后，生物发光信号仅轻微诱导p16-luc页小鼠，这种作用通过第53页缺失，尤其是在胸腺或小肠等高度增殖组织中[37]. 此外，DDR-pathway激活第16页^INK4a公司基因表达和随后的细胞衰老在几乎所有缺乏胸腺的小鼠中都是自然引起的第53页出生后10到20周左右的基因[37]. 因此，有可能第16页^INK4a公司在p53意外失活的情况下，特别是在胸腺等高增殖组织中，可能发挥后备肿瘤抑制作用。

p53和p16之间的调节电路^INK4a公司肿瘤抑制剂

我们的结果导致了以下模型，其中致癌Ras信号具有激活的潜力第16页^INK4a公司立即基因表达[13-15]但这种作用最初被DNMT1水平升高所抵消，从而导致超细胞增殖。然而，由于超细胞增殖往往导致DNA损伤和活性氧升高，DNMT1型ROS的增加最终会降低基因表达，导致表观遗传去表达第16页^INK4a公司基因表达和衰老细胞周期阻滞（见图中的模型​图4）。4). 此外，有趣的是，这种途径在p53缺失的情况下增强，因为p53倾向于阻止受损细胞的增殖，从而导致DNA损伤的进一步累积（图​（图4）4) [55,56]. 因此，p16很可能^INK4a公司如果p53失活，则起到备用肿瘤抑制作用。与这一概念一致，最近的研究表明第16页^INK4a公司基因表达在缺乏第53页基因[57]. 此外，Aurora A的过度表达导致p16的显著诱导^INK4a公司p53基因敲除小鼠乳腺的表达[58]. 同样值得强调的是，仅仅p53失活并不足以完全消除端粒导向的细胞衰老，而是p53和p16的联合失活^墨水4a确实如此[59,60]. 这些结果以及我们最近的发现[37]，有助于解释为什么小鼠对p53和p16双重缺乏^INK4a公司肿瘤形成率增加[61,62]，以及为什么p53和p16的结合^INK4a公司在人类癌细胞中经常观察到丢失[63].

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图4

通过DDR的p53和p16通路之间的串扰虽然致癌Ras信号有激活的潜力第16页^墨水4a基因表达，这种效应最初被DNMT1水平的升高所抵消，从而导致强烈的增殖爆发，导致DNA损伤的累积。DNA损伤的积累激活了活性氧的产生，而活性氧又反过来阻碍DNMT1型基因表达，从而导致表观遗传去表达第16页^墨水4a基因表达，从而延缓衰老细胞周期。这种途径被p53途径抵消，因为DNA损伤会立即激活p53，并阻止受损细胞的增殖，从而导致DNA损伤的进一步累积。因此，DDR路径诱导第16页^墨水4ap53失活时表达加快。