Set1对H3K4的二甲基化将Set3组蛋白脱乙酰酶复合物招募到5′转录区

H3K4二甲基化导致基因5′端组蛋白乙酰化减少

重要的是要问启动子近端乙酰化是否在设置1Δ是由于H3K4甲基化的缺失，如果是，甲基化水平是多少。组蛋白H3K4突变为丙氨酸的菌株组蛋白乙酰化的ChIP分析在5′区乙酰化增加，类似于设置1Δ（数据未显示），说明Set1效应可能是通过H3K4甲基化介导的。组蛋白H3K4甲基化的过程受到多种因素的复杂调控，这些因素特别有助于H3K4-二甲基化或三甲基化(Laribee等人，2005年;Lee等人，2007年;Mueller等人，2006年;Shahbazian等人，2005年;Wood等人，2005年). 我们利用各种突变体来操纵H3K4的甲基化水平。

组蛋白H2B的Rad6-Bre1复合物泛素化酶K123和这种修饰对于H3K4的多重甲基化是特别需要的(Dehe等人，2005年). 与早期研究一致，我们的ChIP结果表明RAD6型或巴西雷亚尔1导致H3K4me3和H3K4me2完全丧失，但H3K4-me1水平未受影响(图2A). 有趣的是，这些缺失导致组蛋白乙酰化增加是的3和其他基因测试，类似于设置1Δ(图2A、B和数据未显示）。因此，H3K4的单甲基化不足以降低启动子下游的乙酰化水平。Rad6-Bre1的H2B泛素化对于Dot1的H3K79甲基化也是必需的(Shahbazian等人，2005年). 然而，删除DOT1公司对5′区组蛋白乙酰化水平无影响(图S1)因此，这些影响不能归因于H3K79甲基化的缺失。基于这些结果，我们可以推断H3K4me2或me3的缺失导致基因5′端组蛋白乙酰化增加。

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图2

H3K4me2介导5′区组蛋白乙酰化减少

A.野生型ChIP，rad6Δ，或bre1Δ使用抗H3、抗H3K4me3、抗H3K4me2或抗H3K4me1（左图）和抗H3、抗乙酰基H4或抗乙酰基H3（右图）的菌株在YEF3年。底漆位置如顶部示意图所示。在所有其他测试的基因中也发现了类似的结果。

B.将A部分乙酰H4和乙酰H3的结果归一化为总H3信号，并绘制比率图。误差条显示了多次实验的标准偏差。

C.表达野生型Set1或缺失RRM结构域（ΔRRM）的突变Set1的载体或质粒转化为设置1Δ组蛋白修饰的菌株和ChIP在A和B部分中进行。

D.对C部分的结果进行量化，并按B部分所示绘制图表。

全基因组染色质免疫沉淀实验表明，H3K4me3在启动子处有一个尖峰，而H3K4me2在下游稍远处有一个峰值(Barski等人，2007年;Bernstein等人，2005年;Liu等人，2005年;Pokholok等人，2005年). 这可以在YEF3年基因，其中H3K4me3在转录起始位点附近达到峰值，但H3K4me2在转录区的5′端高度富集(图2A). 由于该区域与乙酰化增加的部位重叠设置1Δ，我们假设H3K4me2可能直接降低组蛋白的乙酰化。Set1蛋白包含SET和RNA识别基序（RRM）域。RRM域的作用尚不明确，但其删除可显著降低H3K4me3，但不会降低H3K4me2(Fingerman等人，2005年;Schlichter和Cairns，2005年). 在我们的研究中，缺乏RRM结构域的Set1的表达导致H3K4me3的完全缺失，而在5′末端H3K4me2仅略有减少YEF3年以及测试的其他基因(图2C、D). 尽管缺乏H3K4me3，但在该突变体中观察到H3乙酰化没有增加，仅H4乙酰化略有增加(图2C、D). 这些结果表明，H3K4me2足以促进基因5′端组蛋白乙酰化的降低。

H3K4me3缺失导致端粒乙酰化增加

虽然H3K4和H3K79的组蛋白甲基化与转录呈正相关，但它们各自的甲基转移酶Set1和Dot1对端粒沉默很重要(Fingerman等人，2005年;van Leeuwen等人，2002年). 目前尚不清楚这两个甲基标记是如何调节沉默的，但在缺乏设置1或DOT1公司(图1E和S2A公司). 为了确定H3K4甲基化的水平有助于端粒乙酰化的抑制，我们测试了各种额外的突变体。缺少细胞rad6Δ或bre1Δ也显示端粒乙酰化增加，认为H3K4me1不足以维持较低的乙酰化水平(图S2A、B). 在维持H3K4me2和K4me1水平的Set1 RRM结构域的缺失也导致端粒乙酰化水平升高(图2C,S2A、B). 因此，H3K4me3（而非H3K4me2或H3K4-me1）需要促进端粒处较低水平的乙酰化，这与H3K4 me3在端粒沉默中的特殊作用一致(Fingerman等人，2005年). 这与H3K4me2在基因5′端附近乙酰化中的特殊作用形成对比，并认为Set1在这两个位置对乙酰化水平的调节是通过不同的机制实现的。

基因5′端的Set3复合体去乙酰化组蛋白

最近的一项研究表明，出芽酵母中的几个PHD指蛋白在体外可以与组蛋白H3的甲基化K4结合(Shi等人，2007年). 可能影响组蛋白乙酰化水平的候选者包括RXT1型,电话23、和设置3Rxt1和Pho23是Rpd3C（L）组蛋白脱乙酰酶复合物的组分(Carrozza等人，2005年;Keogh等人，2005年). Set3是包含两种组蛋白脱乙酰化酶Hos2和Hst1的复合物的一部分(Pijnappel等人，2001年). 为了测试H3K4甲基化是否可能通过这些HDAC复合物直接组蛋白脱乙酰化设置3,RXT1型，或电话23检测转录区组蛋白乙酰化增加。

虽然删除了电话23乙酰化稍有增加YEF3年发起人，两者都不是rxt1Δ也不是磷23Δ影响组蛋白乙酰化的5′转录区(图3A). 相反，设置3Δ导致该部位组蛋白乙酰化显著增加，这种模式与设置1删除(图3A). 类似的影响设置3Δ在项目管理A1,PYK1型,ADH1（ADH1）、和RPS13型基因(图3B). 两者之间的一个显著区别设置1Δ和设置3Δ是那个吗设置3Δ端粒乙酰化水平没有增加。由于H3K4或K36的甲基化缺失增加了转录区的乙酰化，因此这些修饰的水平也在设置3Δ应变。H3K4me2、H3K4me3或H3K36me3水平在设置3Δ和野生型菌株(图S3). 因此设置3Δ不是间接由于H3K4或K36甲基化的丧失。

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图3

Set3复合物调节基因5′端的组蛋白乙酰化

A.野生型ChIP，设置3Δ,rxt1Δ，或磷23Δ使用抗H3、抗乙酰H4或抗乙酰H3的菌株在YEF3年。右侧面板显示了三次重复实验结果的量化。误差条显示了多次实验的标准偏差。

B.野生型ChIP，设置3Δ，或hos2Δ使用抗H3、抗乙酰H4或抗乙酰H3的菌株在项目管理A1,PYK1型,ADH1（ADH1），或RPS13型误差条显示标准偏差。

C.野生型ChIP，设置3Δ,软管2Δ,hst1Δ,cpr1Δ，或snt1Δ使用抗H3、抗乙酰H4或抗乙酰H3的菌株在YEF3年。右侧面板显示了引物对2的多次实验结果的量化。误差条显示标准偏差。完整引物集的定量见图S6.

Set3是包含组蛋白脱乙酰化酶Hos2和Hst1以及Cpr1、Snt1、Sif2和Hos4的复合物（Set3C）的一部分(Pijnappel等人，2001年; 看见图S4). 进行ChIP实验，以确定在没有Set3C每个亚基的情况下组蛋白乙酰化水平。任何Set3C亚基的缺失都会增加启动子区域下游的乙酰化软管2Δ,snt1Δ,f2Δ、和hos4Δ显示与相同的模式设置1Δ(图3C,S5和S6). 两个亚基的缺失有所不同。在cpr1Δ菌株H3乙酰化的增加与设置3Δ，但H4乙酰化在3′端和端粒处也显著升高(图3C和S6系列). 因此，Cpr1除了在Set3C中的作用外，可能还有其他功能。有趣的是，hst1Δ对H4乙酰化的影响较小，而H3乙酰化水平的增加hst1Δ比Set3复合物的其他突变体大(图3C). 这一结果可能表明，在Set3C中，Hst1主要去乙酰化H3，而Hos2在H4起作用。或者，这种差异可能是因为Hst1也是包含Sum1的附加复合物的一部分(谢等人，1999年). 总的来说，ChIP实验表明Set3C在基因的5′端附近脱乙酰化组蛋白。

H3K4甲基化激活Set3复合物

鉴于Set1或Set3C缺失导致5′转录区乙酰化水平升高，我们假设H3K4甲基化可能通过与Set3 PHD指状结构域的结合招募Set3复合物。为了测试体内与核小体结合的Set3C是否需要H3K4甲基化，使用TAP标记的Hos2或Set3从提取物中纯化复合物。沉淀用抗H3抗体进行免疫印迹分析。在含有Set1的菌株中(设置1)，Set3和Hos2都与组蛋白H3相互作用。相反，来自缺乏Set1的细胞的Set3C(设置1Δ)没有可检测到的H3相关性(图4A).

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图4

Set3 PHD指与甲基化H3K4靶向基因Set3C至5′端的相互作用

A.Hos2-TAP或Set3-TAP沉淀自设置1或设置1Δ使用IgG琼脂糖的细胞（括号中表示）。沉淀物（IP）通过免疫印迹分析TAP标记蛋白（TAP）和相关组蛋白（H3）进行分析。

B.染色质片段通过TAP标记的Hhf2（组蛋白H4）固定在珠上设置1或设置1Δ细胞。珠状结合核小体与野生型Set3-HA或PHD指状突变Set3-HA（W140A）菌株的全细胞提取物孵育。沉淀蛋白（IP）通过TAP标记组蛋白H4或表位标记Set3（HA）的免疫印迹分析进行分析。

C.使用来自设置1或设置1Δ细胞。左侧面板显示PCR产物，右侧面板显示实验多次重复的定量。信号YEF3年将这些区域归一化为端粒探针（TEL）和输入的区域。

D.使用来自表达野生型Set3或突变型Set3（W140A）的细胞的染色质进行Hos2-TAP的ChIP，如C部分所示。

E.染色质来源集合3,设置3Δ，或设置3Δ质粒携带细胞设置3-HA或集合3-HA（W140A）与抗H3、抗乙酰H4或抗乙酰H3沉淀。沉淀DNA的PCR分析在YEF3年.

Set3 PHD手指中关键色氨酸残基（W140A）的突变在体外消除了Set3与甲基化H3K4的关联(Shi等人，2007年). 为了测试Set3 PHD指的作用，从设置1或设置1Δ菌株，然后与表达表位标记野生型（Set3-HA）或突变型Set3（Set3-HA（W140A））的细胞提取物培养。沉淀物用抗HA抗体进行免疫印迹分析。同样，只有含有Set1细胞的染色质才能与Set3C结合，这种相互作用完全依赖于具有功能性的Set3 PHD指(图4B).

为了定位Set3C与核小体沿基因的相互作用，进行了Hos2-TAP的ChIP。在低分辨率实验中，Hos2曾被报道与转录区交联(Wang等人，2002年). 我们还观察到Hos2定位于转录区，但特别偏向于YEF3年和其他基因(图4C和数据未显示）。重要的是，删除Set1(图4C)或PHD手指突变体Set3（W140A）(图4D)导致Hos2交联损失，强烈主张Set3C招募需要Set3 PHD指和甲基化H3K4之间的相互作用。

接下来，在表达PHD指突变体Set3（W140A）的细胞中检测组蛋白乙酰化水平。如所示图4E，Set3（W140A）突变导致组蛋白乙酰化在5′转录区增加，这与在设置3Δ应变。突变的Set3蛋白的表达水平与野生型相当(图4B)，所以乙酰化增加并不是由于蛋白质稳定性的缺陷。基于这些体外和体内结果，我们得出结论，Set3 PHD指状物将H3K4甲基化与基因5′端的Set3C的组蛋白脱乙酰化联系起来。

通过H3K4二甲基化招募Set3C

我们的结果表明，H3K4me2通过Set3C导致5′转录区组蛋白乙酰化减少。然而，据报道，GST-Set3 PHD手指融合在体外与H3K4me3特异结合，但与K4me2无特异结合(Shi等人，2007年). 为了在更生理学的背景下分析结合偏好，TAP-purified Set3C(图5A)用与Shi等人（Or Gozani慷慨提供）使用的相同H3尾肽偶联的珠培养。Set3C未与非甲基化肽结合。重要的是，相对于三甲基化或单甲基化K4，天然Set3C优先结合H3K4me2肽(图5B). 使用表达标记的Hos2的全细胞提取物也获得了类似的结果(图5C). 在含有PHD手指突变体Set3（W140A）的提取物中未观察到这种结合，这表明Set3 PHD手指介导Set3C和H3K4me2之间的相互作用(图5D).

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图5

H3K4二甲基化新兵Set3C

A.通过银染色观察TAP纯化的Set3复合物（40μl）。

B.用30μl纯化的Set3复合物和1μg固定在小球上的所示组蛋白肽进行肽结合分析。沉淀蛋白用识别TAP标签的抗体进行免疫印迹分析。

用含有Hos2-TAP和野生型Set3或PHD指突变体Set3（W140A）的全细胞提取物进行组蛋白肽结合测定。沉淀的Hos2蛋白通过免疫印迹分析进行分析。

E.使用来自设置1Δ包含空矢量的单元格，野生型设置1，或设置1（ΔRRM）。对沉淀的DNA进行PCR分析是的3误差条显示标准偏差。

F.来自未标记菌株的染色质，HOS2型-TAP，或HOS2型-TAP接头(rad6Δ)用IgG琼脂糖沉淀细胞。沉淀物的PCR分析YEF3年进行DNA检测，并将信号标准化为端粒对照区。误差条显示标准偏差。

为了测试H3K4me2是否在体内介导Set3C募集，HOS2型交联度在设置1ΔRRM和rad6Δ突变菌株。Set1ΔRRM突变体中Hos2未受影响，表明招募Set3C不需要H3K4me3(图5E). 然而，Hos2 ChIP信号在rad6Δ缺乏H3K4me2和H3K4me3的菌株(图5F). 因此，如5′脱乙酰化(图2)H3K4me2而非H3K4me3是体内Set3C招募的相关标记。

酵母菌株和质粒

使用的酵母菌株列于补充表S1.生成pRS415-设置3-3XHA设置3使用产生末端NotI/BamHI位点的引物通过PCR扩增启动子和ORF区。将该PCR片段连接到pRS415的相应位点-金华D1-3XHA系列(Kim和Buratowski，2007年)制备框架内融合表达三重HA表位标记蛋白。这个设置3利用pRS415的PCR诱变技术构建了W140A突变体-设置3-3XHA使用的寡核苷酸序列如下所示补充表S2如前所述，对6-氮杂嘧啶（6-AU；75或150μg/ml）或麦考酚酸（MPA；15或30μg/ml(Kim和Buratowski，2007年).

TAP净化

菌株在YPD培养基中生长，在600 nm处的光密度为0.7。在含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液（10 mM Tris-HCl（pH 7.9）、350 mM NaCl、10%甘油、2 mM二硫苏糖醇、0.1%NP-40、2mM EDTA）中通过玻璃珠破碎制备提取物。净化过程如所述(Gould等人，2004年). 用含有20mM EGTA的缓冲液从钙调素柱洗脱纯化的蛋白质，并通过SDS-PAGE进行分析。在图5A40μl纯化的Set3C用于银染。

肽相互作用分析

对于图5D，肽结合分析按所述进行(Shi等人，2007年)用1μg生物素化组蛋白肽和30μl纯化的Set3复合物在结合缓冲液（50 mM Tris-HCl（pH 7.5），0.1%NP-40）和300 mM NaCl（4°C）中培养过夜。对于图5C和D在含有500mM NaCl和蛋白酶抑制剂的结合缓冲液中，通过玻璃珠溶解制备全细胞提取物。将提取物稀释至300mM NaCl，并在4°C下将500μg提取物与1μg生物素化组蛋白肽孵育过夜。添加60μl链霉亲和素偶联Dynabeads（Invitrogen）以沉淀络合物。在4°C下孵育1小时后，用1.5 ml结合缓冲液清洗珠子四次，然后用SDS-PAGE和免疫印迹分析进行解析。

染色质结合分析

如前所述进行染色质下拉分析(Kim和Buratowski，2007年). 对于图4A、Hos2-TAP或Set3-TAP来自设置1或设置1Δ背景用IgG琼脂糖沉淀。将珠结合蛋白用裂解缓冲液（10mM Tris-Cl（pH 8.0）、150mM NaCl、0.1%Nonidet P-40和蛋白酶抑制剂）洗涤四次，并通过SDS-PAGE进行解析，然后用抗TAP或抗H3抗体进行免疫印迹分析。对于图4B用Hhf2-TAP的IgG Sepharose沉淀法从全细胞提取物中分离出染色质片段。珠状结合核小体与含有标记Set3-HA蛋白的细胞的全细胞提取物孵育。在4°C下培养过夜后，用裂解缓冲液洗涤复合物四次，并用SDS-PAGE进行分离，然后进行免疫印迹分析。

染色质免疫沉淀

如前所述进行染色质免疫沉淀(Kim和Buratowski，2007年). 0.5μl抗H3、抗乙酰基H4、抗H3K4me3、抗H4K4me2或抗H3K 36me3；1.0μl抗乙酰基H3；或2.0μl抗H3K4me1抗体与蛋白A琼脂糖微球结合，用于沉淀染色质。对于除抗H3K4me1和抗H3外的所有抗体，在含有1 M NaCl的FA裂解缓冲液中结合过夜。使用相同的缓冲液清洗沉淀，一次使用含有1.5 M NaCl的FA裂解缓冲液，一次用含有10 mM Tris-HCl（pH8.0）、0.25 M LiCl、1 mM EDTA、0.5%NP-40、0.5%脱氧胆酸钠的缓冲液，另一次用TE（10 mM Tris-HCl。对于抗H3K4me1和抗H3抗体，在含有275 mM NaCl的FA裂解缓冲液中结合过夜，用相同的缓冲液清洗沉淀物，并用含有500 mM NaCl的FA-裂解缓冲液清洗一次。PCR条件为94°C下60秒，然后是94°C、55°C下30秒、72°C下45秒的23～25个30秒的循环，最后是72°C时2分钟。本研究中使用的寡核苷酸序列列于补充表S2组蛋白修饰信号归一化为总H3。

我们感谢Or Gozani（斯坦福大学）提供组蛋白肽，Scott Briggs（普渡大学）提供质粒，LeAnn Howe（不列颠哥伦比亚大学）和Michael Keogh（AECOM）提供菌株，Nevan Krogan（加州大学旧金山分校）、Ollie Rando（美国马萨诸塞州伍斯特大学），以及Buratowski实验室的所有成员提供有益的建议和讨论。T.K.是白血病和淋巴瘤协会的特别研究员。这项研究得到了美国国立卫生研究院授予S.B.的GM46498资助。