自噬效应器Beclin 1：一种新的BH3-only蛋白

摘要

介绍

自噬是长寿命蛋白质、细胞质细胞器和细胞内病原体降解的主要细胞途径。该途径涉及将这些细胞成分隔离在称为自噬体的双膜或多膜细胞质小泡中，然后输送到溶酶体，在那里它们被降解和再循环(Klionsky和Emr，2000年;Levine和Klionsky，2004年). 自噬通过使细胞在营养剥夺和其他形式的细胞应激期间维持大分子合成和能量稳态，促进细胞存活；它还具有分化和发育、抗衰老、先天和适应性免疫以及抑制肿瘤的功能(莱文和克林斯基，2004年;Shintani和Klonsky，2004年;莱文和克罗默，2008年;水岛等., 2008). 自噬的破坏与多种疾病有关，包括癌症、神经退行性疾病、骨骼和心脏肌病、癌症、炎症性肠病和传染病(莱文和克罗默，2008年).

自噬途径在所有真核生物中都是保守的，在过去的十年中，许多自噬效应器（称为Atg蛋白）以及主要的蛋白调节器已经被鉴定出来(莱文和克林斯基，2004年;谢和克林斯基，2007年). 诱导自噬的调节因子包括肿瘤抑制因子，如PTEN、TSC1和TSC2复合物以及DAPk；应激激活的信号分子，如c-Jun N末端激酶1（JNK1），对低能（如AMP激酶）或内质网（ER）应激作出反应的分子（如PERK、eIF2α激酶和IRE1），以及与先天免疫信号有关的分子，如toll样受体和免疫相关GTPases(升级等., 2009). 抑制自噬的蛋白质包括致癌基因，如I类对磷脂酰肌醇三-俄亥俄州k个酶（PI3K）、Akt、Ras、TOR和Bcl-2(Pattingre和Levine，2006年;迈乌里等., 2008). 抑癌基因，第53页，已被报道在自噬中发挥双重作用(莱文和艾布拉姆斯，2008年;塔斯迪米尔等2008年b月)一些研究表明自噬的转录依赖性和转录依赖性正调控(冯等., 2005;克里顿等2006年)以及其他研究表明细胞质中野生型和突变型p53对自噬有负调节作用(莫西里等., 2008;塔斯迪米尔等.，2008年a,2008年c).

自噬效应器的分子结构和作用机制尚未完全阐明，但大多数功能是通过参与负责囊泡诱导、成核、伸长、对接以及与溶酶体融合和降解的多蛋白复合物来实现的(莱文和克林斯基，2004年;莱文和克罗默，2008年;水岛等., 2008). 一些自噬调节因子通过诱导复合物关键成分的磷酸化诱导自噬，如Atg1和Atg13。选择自噬靶点的过程尚不清楚，不同靶点可能不同。自噬诱导触发对磷脂酰肌醇对磷脂酰我诺司醇三-通过囊泡成核或III类PI3K复合物磷酸化（PI3P），并诱导Atg9和相关线粒体脂质向生长囊泡募集(他等., 2008). PI3P是一种信号，可以招募囊泡伸长所需的蛋白质(Obara和Ohsumi，2008年)涉及两条泛素样结合途径。一条途径导致Atg12与Atg5结合，形成Atg12–Atg5–Atg16复合物，然后协助第二条途径，导致磷脂酰乙醇胺与Atg8/LC3结合，并将这种脂化形式的Atg8/LC3并入生长的吞噬体。完整的自噬体与溶酶体的对接和融合由蛋白质（如LAMP2和Rab7）指导，这些蛋白质也参与其他囊泡通过。最终，自噬体及其内容物被溶酶体水解酶降解。降解的内容物被细胞回收，以维持大分子合成和能量稳态，这对于营养剥夺和其他形式的细胞应激期间的生存至关重要。

基本自噬效应器，Beclin 1

Beclin 1，最初作为Bcl-2相互作用蛋白分离(梁等., 1998)，与酵母Atg6/Vps30有30%的序列同源性，后者参与酵母自噬所必需的蛋白质复合体(卡梅塔卡等., 1998). Beclin 1和酵母Vps34同源物III类PI3K是第一个被鉴定的哺乳动物自噬效应器(木原等., 2001)和酵母Vps15同源物p150(帕纳雷图等., 1997)在哺乳动物中形成一种负责自噬囊泡成核的复合物(艾塔等1999年;梁等., 1999;木原等., 2001). Beclin 1/class III PI3K复合物介导囊泡成核的确切机制尚不清楚。

Beclin 1酵母同源基因Atg6/Vps30也在空泡蛋白分选相关蛋白的基因筛查中独立发现(水手等., 1997)表明Beclin 1也可能在其他III类PI3K依赖性膜贩运事件中发挥作用。最近在哺乳动物细胞中发现了两种不同的复合物，它们分别含有III类PI3 K、p150和Beclin 1，其方式与酵母类似(伊塔库拉等., 2008). 一种复合物被认为与酵母复合物I等效，是自噬所必需的，它包括人类自噬需要的酵母Atg14同源物。另一种复合物，被认为相当于在液泡蛋白分选途径中发挥作用的酵母复合物II，包括紫外线照射第页电阻-一有关联的克烯（UVRAG），被认为是酵母的人类同源物Vps38。尽管水岛和同事(伊塔库拉等., 2008)发现含UVRAG的Beclin 1/class III PI3K复合物不需要用于自噬体的形成，这些发现与早先的报告相矛盾，即自噬需要UVRAG(梁等., 2007). 此外，Bif-1与UVRAG结合并调节膜曲率(高桥等., 2007)和Ambra1，在含有UVRAG的复合物中与Beclin 1结合(菲米亚等., 2007)，均能上调Beclin 1/Ⅲ类PI3K复合物的自噬功能。因此，需要进行更多的研究来阐明不同的人类Atg14和UVRAG复合物在自噬和其他膜贩运过程中的作用。

Beclin 1在哺乳动物细胞中的自噬非依赖性功能仍缺乏确凿证据，两项研究表明，Vps34/III类PI3K依赖性贩运事件，例如，在没有功能性Beclin 1的细胞中，从转高尔基网络到溶酶体的过程中，促胃动素D的蛋白水解过程或表皮生长因子受体的后细胞分选是完整的(古箭等2005年b;曾等., 2006). 然而，在植物方面，Ohsumi和他的同事(藤城等., 2007)假设自噬无关的功能ATG6/VPS30型，作为ATG6/VPS30型突变体，不同于其他拟南芥ATG基因突变体在花粉萌发过程中存在缺陷。此外贝克林1无效小鼠比其他自噬基因缺陷小鼠更严重（例如，附件5^−/−,附件7^−/−老鼠；莱文和克罗默，2008年)，表明贝克林1-除自噬外的调节过程可能对哺乳动物早期发育至关重要。Net，考虑到哺乳动物细胞中存在不同的Beclin 1/III类PI3K复合物，Beclin 1同源基因在低等真核生物中的多效性效应，以及自动液位计6或贝克林1与其他突变体自动液位计在植物和小鼠的基因中，除了自噬外，哺乳动物Beclin 1还可能在其他膜运输过程中发挥作用。

尽管Beclin 1可能具有这些与自噬无关的功能，但Beclin 1最好的特征功能是其在自噬中的作用。Atg6/Beclin 1的自噬功能在真核生物进化过程中高度保守，并被认为在调节其许多生物学效应中具有重要作用。基因敲除或敲除研究贝克林1，或其在低等真核生物中的同源基因揭示了几种重要的表型，其中许多可能与自噬有关，如ATG6/贝克林1其他基因的空突变是否复制了现象自动液位计基因。像所有酵母一样自动液位计基因，自动液位计6在饥饿和酵母产孢期间对生存至关重要(莱文和克林斯基，2004年). 像其他植物一样自动液位计基因，拟南芥或本氏烟草素1对于预防先天性免疫反应期间的过早黄化和限制程序性细胞死亡至关重要(线路接口单元等., 2005;Patel和Dinesh-Kumar，2008年). 像其他人一样秀丽隐杆线虫ATG基因，贝克-1对dauer的发展至关重要(梅伦德斯等., 2003); 饥饿时的生存(哈尔斯等., 2007); 热量限制、胰岛素信号通路突变或p53突变导致寿命延长(梅伦德斯等., 2003;哈尔斯等., 2007;Jia和Levine，2007年;汉森等., 2008;塔维纳拉基斯等., 2008;第T次等., 2008); 和胚胎发育(塔卡茨·维莱等., 2005).

对靶向突变小鼠的研究揭示了贝克林1.双等位基因缺失的小鼠贝克林1早期胚胎致死(曲等., 2003;岳等., 2003)和单等位基因缺失的小鼠贝克林1自发性肿瘤发生率增加(曲等., 2003;岳等., 2003)显示乳腺上皮细胞和生发中心B淋巴细胞异常增殖(曲等., 2003)和增加了神经退化的易感性(皮克福德等., 2008)和结蛋白相关心肌病(塔努斯等., 2008). 在人类中贝克林1常见于散发性乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌(艾塔等., 1999)Beclin 1在中枢神经系统的表达减少与阿尔茨海默病的易感性有关(皮克福德等., 2008). 因此，综合来看，有证据表明Beclin 1在肿瘤抑制、发育、衰老预防、先天免疫、神经保护和心脏保护中发挥着重要作用。

抗凋亡Bcl-2蛋白的抗自噬功能

如前所述，Beclin 1最初是作为Bcl-2相互作用蛋白分离的(梁等., 1998)以及Bcl-2家族的几个抗凋亡成员，如Bcl-2和Bcl-X_L（左）以及由致癌γ疱疹病毒编码的病毒Bcl-2同源物，如卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）vBcl-2和γHV68 M11，与Beclin 1结合，是其自噬功能的负调控因子(梁等., 1998;帕廷雷等., 2005;迈乌里等., 2007;辛哈等., 2008;库伊等.，2008年a). 例如，通常表达低水平Beclin 1的人MCF7乳腺癌细胞不会显示饥饿诱导的自噬上调，除非Beclin l在体外表达。Beclin 1介导的对MCF7细胞饥饿诱导的自噬的拯救被人Bcl-2和Bcl-X的外源性表达所抑制_L（左）(梁等., 1998;帕廷格等2005年)，以及病毒Bcl-2同源物，KSHV Bcl-2(梁等., 1998;帕廷格等., 2005)和γHV68 M11(辛哈等., 2008;库伊等.，2008年a). 这些结果现已在众多研究中扩展到许多细胞系，因此，细胞和病毒Bcl-2同源物的过度表达似乎是多种环境下自噬的有效抑制剂(辛哈等., 2008;库伊等.，2008年a). 此外，内源性Bcl-2也可能调节自噬，因为自噬活性的Hela细胞在Bcl-2 siRNA敲除后，饥饿诱导的自噬水平增加了两倍(梁等., 1998;帕廷格等., 2005). 最后，强制表达Bcl-2也可以抑制自噬体内因为在心肌特异性启动子控制下表达Bcl-2的转基因小鼠表现出心肌细胞饥饿诱导的自噬水平降低(梁等., 1998;帕廷格等., 2005).

Bcl-2的抗自噬功能似乎在内质网发挥。尽管最初的报告表明内源性Beclin 1完全定位于转高尔基网络(木原等., 2001)随后的研究表明，内源性Beclin 1与外源性表达的Beclin 2相似，也定位于线粒体和内质网(梁等., 1998;帕廷格等., 2005). 只有ER靶向的Bcl-2，而不是线粒体靶向的Bcl-2，可以抑制饥饿诱导的自噬，这表明只有Bcl-2和Beclin 1在ER处的相互作用负调控自噬体的形成。至少在某些细胞类型中，如HT-29人结肠癌细胞，Bcl-2的强制表达降低了与Bcl-2共沉淀的III类PI3K/Vps34的量，并降低了Beclin-1相关的III类PI3K活性(梁等., 1998;帕廷格等., 2005). 目前尚不清楚ER-localized Bcl-2–Beclin 1复合物如何调节Beclin 1/class III PI3K复合物的形成和/或活性。

内源性Bcl-2抗凋亡同源物与Beclin 1的结合可能调节基础自噬水平和细胞存活。在多种不同的细胞系中，包括缺乏功能性caspase 3的MCF7细胞，野生型Beclin 1的强制表达不会增加自噬的基础水平或诱导细胞死亡(梁等., 1998;帕廷格等., 2005). 然而，Beclin 1的Bcl-2-结合缺陷突变体的强制表达导致自噬水平增加，以及细胞死亡，该细胞死亡被下游自噬基因的siRNA阻断，第5天，但不是通过胱天蛋白酶抑制剂。因此，Bcl-2同源物似乎起着变阻器的作用，维持促进细胞存活的自噬稳态水平，同时防止促进细胞死亡的过度自噬水平。目前尚不清楚Bcl-2同源物的这种抗自噬功能是否有助于其在生理环境中的抗死亡作用。尽管自噬作为细胞死亡途径的作用仍有争议(Kroemer和Levine，2008年)尽管如此，我们仍很容易推测Bcl-2同源物可能是多种死亡途径的抑制剂，包括凋亡和自噬。

Beclin 1包含一个BH3结构域，该结构域对于与Bcl-2同源物结合是充分和必要的

Beclin 1被预测在进化保守的蛋白质三分之二的C末端至少包含三个结构域。第一个是卷曲-卷曲结构域，它与肌球蛋白等蛋白质的卷曲-卷曲结构域的序列同源性约为25%，并且包含一个保守度很低的亮氨酸拉链。该结构域参与与UVRAG（另一种参与囊泡运输的卷曲螺旋结构域蛋白）的异源二聚反应(梁等., 2006). 亮氨酸拉链的前10个残基也构成了对Beclin 1的细胞质定位及其自噬和肿瘤抑制功能至关重要的核输出信号(梁等., 2001). 这个进化保守区域中剩余结构域的结构和分子功能尚未确定，但这些结构域是与Vps34/III类PI3K、Beclin 1依赖的PI3K活性、自噬相互作用所必需的(古箭等2005年b)和外周膜联合(梁等., 1998). 尽管Beclin 1这个进化上保守的区域对自噬过程至关重要，但它介导自噬的分子机制尚不清楚。

Beclin 1的N末端三分之一是序列中变化最大的，进化上距离较远的同源基因的等效区域共享不到15%的序列同源性。Beclin 1的这个可变N末端区域可以用于调节蛋白质相互作用和/或进化上保守的C末端区域的自噬功能。截短实验表明，人Beclin 1的残基88–140足以与抗凋亡Bcl-2同源物结合(梁等., 1998;帕廷格等., 2005). 在该区域内，最近的结构、诱变和生化分析表明，残基108–127构成BH3结构域，类似于促凋亡蛋白与抗凋亡Bcl-2同源物结合所需的结构域(图1;冯等., 2007;马乌里等., 2007;伊达尔-奥伯施泰因等., 2007). 与Beclin 1的N末端区域的可变序列一致，Beclin l调控的分子机制在不同的真核生物之间也可能不同；例如，酵母缺乏Bcl-2同源物，表明Bcl-2与Atg6/Beclin 1的N末端区域结合不保守。

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图1

Beclin 1和不同促凋亡蛋白BH3结构域的比较。(一)序列对齐。保守残基的背景按残基类型着色：疏水性黄色、小绿色、碱性蓝色和酸性红色。(b)结构叠加。BH3结构域由不同的色带表示；Beclin 1（深绿色，）；坏（紫罗兰色）和白（蓝绿色）。BH3结构域中保守的残基与抗凋亡Bcl-2同源物结合，如原子细节所示。所有分子图都是用PYMOL程序准备的(http://www.pymol.org).

通常，BH3结构域被定义为四转两位α-螺旋，具有序列基序：Hy-X-X-X-Hy-K/R-X-Sm-D/E-X-Hy，其中Hy是疏水残基，Sm代表小残基，通常是甘氨酸(图1a). 然而，由于没有不变残基，甚至残基的模式保守性很差，仅通过序列比对往往很难识别这个域。因此，可能需要对序列、结构和与Bcl-2同源物结合的常见分子机制进行综合分析，以确定这些结构域。与BH3结构域中保守的残基相对应的人类Beclin 1残基为L112、L116、K117、G120、D121和F123(图1a). 从与Bcl-X结合的人类Beclin 1残基108–127对应的肽的晶体结构中获得的结构证据_L（左）(伊达尔-奥伯施泰因等., 2007)或来自不同标记的Bcl-XL-Beclin 1（104–131）融合蛋白的标准异核多维核磁共振波谱。冯等. (2007)结果表明，与促凋亡蛋白的BH3结构域一样，当与Bcl-2同源物结合时，这些Beclin 1残基折叠成四圈α螺旋(图1b).

促凋亡Bcl-2蛋白分为两类：（1）含有BH4、BH3和BH1三个BH结构域的多域促凋亡蛋白；和（2）仅含BH3结构域的BH3-促凋亡蛋白。在这两组中，BH3结构域是与抗凋亡Bcl-2蛋白相互作用所必需的。抗凋亡病毒和细胞Bcl-2同源物具有非常不同的序列，但具有相似的三维结构，由中心疏水α-螺旋组成，由六个两亲螺旋包围，划分为四个BH域：BH4、BH3、BH1和BH2(穆奇莫尔等1996年;卢等., 2005). 抗凋亡细胞Bcl-2同源物分子表面的疏水沟槽(塞特勒等., 1997;Petros公司等., 2000;线路接口单元等2003年)以及病毒Bcl-2同源物，如KSHV Bcl-2(黄等., 2002)和γHV68 M11(卢等., 2005)，负责结合促凋亡蛋白的BH3结构域(图2a) (塞特勒等., 1997;Petros公司等., 2000;黄等2002年,2003;线路接口单元等2003年;卢等., 2005). 然而，EBV BHRF1结构相似的表面凹槽被遮挡，不能结合BH3域(黄等., 2003). 最近的结构数据表明，Beclin 1的BH3结构域也结合在Bcl-X的BH3结合槽中_L（左）(图2b;冯等., 2007;伊达尔-奥伯施泰因等., 2007)和γHV68 M11(图2c) (辛哈等., 2008;库伊等.，2008年a).

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图2

BH3结构域与Bcl-2同源物的结合。M11和Bcl-X的分子表面_L（左）由原子型氧红、氮蓝、硫绿和碳灰着色。BH3结构域显示在深绿色带中，保守残基与抗凋亡Bcl-2同源物结合，如原子细节所示(一)错误绑定到Bcl-X_L（左）. (b)Beclin 1绑定到Bcl-X_L（左）. (c（c）)Beclin 1绑定到M11。

BH3结构域中保守的残基参与与抗凋亡Bcl-2同源物的结合界面(图1b和图2). 在BH3结构域中保守的三个疏水性残基被排列在抗凋亡Bcl-2同源物的BH3结合槽中的疏水性残基所填充。其余两个保守残基的主链原子，通常是甘氨酸-天冬氨酸对，与抗凋亡Bcl-2同源物BH1结构域中高度保守的甘氨酸-精氨酸对主链原子反平行排列。此外，保守的BH3结构域天冬氨酸离子对与BH1结构域精氨酸在抗凋亡Bcl-2同源物中保守。这些相互作用保留在与Bcl-X结合的Beclin 1 BH3结构域的结构中_L（左）(图2b;冯等., 2007;伊达尔-奥伯施泰因等., 2007)或γHV68 M11(图2c;辛哈等., 2008;库伊等.，2008年a).

几项研究已经确定了Beclin 1的BH3结构域中与Bcl-2同源物结合所需的残基，以及与Beclin 2同源物结合时所需的Bcl-2同系物的BH3结合槽中的残基。对BH3结构域中保守的Beclin 1残基的突变分析表明，Beclin 1BH3结构区是与Bcl-2结合所必需的。选择性替换关键Beclin 1残基，如L112A、L116A、L16E、L116Q、G120E、D121A和F123A，可以减少或消除Beclin 2与Bcl-2或Bcl-X之间的相互作用_L（左），通过定性结合分析进行测试，如分析尺寸排除色谱法、亲和力下拉和共免疫沉淀分析(冯等., 2007;迈乌里等., 2007;伊达尔-奥伯施泰因等2007年). 类似地，Beclin 1残基L112、L116和F123的丙氨酸替代减少或阻止与γHV68 M11的共免疫沉淀(辛哈等., 2008). 定量结合分析，如等温量热法或荧光各向异性测量，进一步证实Beclin 1 BH3结构域残基突变体，如L116A和F123A，对Bcl-X具有无法测量的亲和力_L（左）或Bcl-2(冯等., 2007;伊达尔-奥伯施泰因等., 2007).

正如预测的那样，Bcl-2同源物BH3-结合沟内的残基突变也会阻断与Beclin 1的相互作用。例如，Bcl-2同源物BH1结构域中保守甘氨酸的突变，Bcl-2G145A的突变(帕廷格等., 2005)和G138A用于Bcl-X_L（左）(冯等., 2007;伊达尔-奥伯施泰因等., 2007)，在共免疫沉淀分析中取消与野生型Beclin 1的结合。同样，保守γHV68 M11残基G86A+R87A的双重突变(辛哈等., 2008;库伊等.，2008年a)在BH1结构域中，或残基Y60A+L74A(辛哈等., 2008)在疏水槽中加衬里，防止γHV68 M11与野生型Beclin 1结合。因此，结合结构、生物化学和诱变分析表明，Beclin 1含有BH3结构域，该结构域足以与Bcl-2同源物结合。此外，Beclin 1的BH3结构域和各种促凋亡蛋白通过非常相似的机制与Bcl-2同源物结合。

虽然BH3结构域残基的相互作用在每个相互作用的BH3结构区-Bcl-2同源对中似乎是保守的，但这些残基对结合总亲和力的贡献在每对相互作用之间存在显著差异。例如，保守的Beclin 1 BH3结构域残基G120和D121对与γHV68 M11结合不是必需的(辛哈等2008年). 核磁共振研究表明，γHV68 M11的残基受Beclin 1的BH3结构域与促凋亡蛋白Bad或Bax的BH3区域结合的影响(辛哈等. 2008)组成BH3结构域的氨基酸以及相互作用的Bcl-2同源物BH3结构区结合沟中的残基的变异，可能导致每对相互作用具有广泛的结合亲和力，增强了这些相互作用的特异性。

Bcl-2介导抑制Beclin 1依赖性自噬的机制

Beclin 1的BH3结构域以及Beclin 2和Bcl-2同源物的BH3区域之间的相互作用对于Bcl-2蛋白的抗自噬活性至关重要。两大证据表明，Bcl-2蛋白通过结合Beclin 1的BH3结构域抑制自噬。首先，Beclin 1或Bcl-2同源物中阻止Beclin 1-Bcl-2同系物相互作用的残基突变也毫无例外地阻止了Bcl-2抑制自噬的能力。Bcl-2、Bcl-X_L（左）当野生型Beclin 1表达时，病毒Bcl-2抑制自噬，但当Bcl-2结合缺陷的Beclin l 1突变体表达时，则不抑制自吞噬。(梁等., 1998;帕廷雷等., 2005). 相反，不能与Beclin 1结合的Bcl-2同源突变体，如Bcl-2 G145A(帕廷格等., 2005)，Bcl-X_L（左）G138A型(迈乌里等., 2007)和γHV68 M11 G86A+R87A或Y60A+L74A(辛哈等., 2008;库伊等.，2008年a)，在自噬抑制方面有缺陷。第二，研究使用肽模拟抑制剂ABT-737，一种设计用于结合Bcl-2或Bcl-X的BH3结合沟的小分子_L（左）(奥尔特斯多夫等., 2005)，表明ABT-737竞争性地抑制对应于Beclin 1 BH3结构域的肽与Bcl-X的结合_L（左），并消除Bcl-X对自噬的抑制_L（左）(迈乌里等., 2007)，提供了进一步的证据，证明Bcl-2介导的自噬下调依赖于通过Bcl-X的结合_L（左）BH3捆绑槽。

尽管上述研究最终证明Beclin 1 BH3结构域与Bcl-2同源物的结合对于Bcl-2介导的自噬下调至关重要，但我们尚不清楚这种相互作用是如何导致自噬抑制的。在哺乳动物中，Beclin 1，III类PI3K和p150(木原等., 2001;古箭等2005年b月)，以及Atg14(伊塔库拉等., 2008)或UVRAG(梁等., 2007)，Bif-1/亲内素1(高桥等., 2007)和Ambra1(菲米亚等., 2007)已被证明是多蛋白、膜相关、自噬体成核复合体的基本成分。Beclin 1与Bcl-2的结合可能抑制Beclin l与III类PI3K的相互作用，尽管III类PI3G似乎并不与Beclin 1BH3结构域直接相互作用(帕廷雷等., 2005;库伊等2008年b月). 此外，Beclin 1和Bif-1都可以形成同聚体(高桥等., 2007;库伊等2008年b月)Bcl-2同源物的结合也可能阻止Beclin 1的高阶齐聚(梁等., 2008). 因此，Bcl-2同源物与Beclin 1的结合可能会立体阻碍其与自噬成核复合体的其他基本成分的相互作用，从而抑制Beclin 2的自噬诱导功能(图3). 然而，Beclin 1在自噬中发挥作用的分子机制以及Beclin 1-Bcl-2相互作用破坏Beclin 2自噬功能的确切机制仍有待了解。

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图3

Beclin 1 BH3结构域在自噬调节中作用的示意图。囊泡成核复合物由Vps34（也称为III类PI3K）和活化剂组成，如Beclin 1、Atg14或UVRAG、Ambra1和Bif-1。Bcl-2同源物与Beclin 1的BH3结构域的结合阻止了自噬复合物的组装（左）。Beclin 1–Bcl-2同源物相互作用的破坏，通过其他BH3域蛋白（右上）竞争性置换Beclin 1BH3域或由于JNK1介导的Bcl-2磷酸化（右下）导致自噬复合物的组装。然后，该复合物的脂激酶活性催化PI转化为PI3P（以紫色圆圈显示），导致自噬。

Bcl-2介导的Beclin 1依赖性自噬抑制的调节

已确定调节Bcl-2/Bcl-X的两种主要机制_L（左）结合Beclin 1和Bcl-2/Bcl-X_L（左）Beclin 1依赖性自噬的抑制(图3)，包括JNK1介导的Bcl-2磷酸化和Bcl-2/Bcl-X的竞争性破坏_L（左）通过其他BH3域与Beclin 1结合。早些时候，我们发现Bcl-2–Beclin 1相互作用受营养状态调节，在营养丰富的条件下（当自噬被抑制时）相互作用水平最高，而在饥饿条件下（自噬受到最大刺激时）交互作用水平最低；梁等., 1998;帕廷格等., 2005). 最近，我们发现，饥饿诱导的JNK1活化导致Bcl-2 BH4和BH3结构域之间非结构环中残基T69、S70和S87的多位点磷酸化，导致Bcl_2和Beclin 1的离解(世界环境学会等.，2008年a). Bcl-2在缺乏JNK1的细胞中不被磷酸化，或在JNH1被抑制的细胞中。在这些细胞中，饥饿诱导的Bcl-2和Beclin 1解离以及饥饿诱导的自噬被消除。类似地，在表达不能磷酸化而非野生型Bcl-2的T69A+S70A+S87A Bcl-2突变体的细胞中，没有饥饿诱导的Bcl-2和Beclin 1解离，也没有饥饿诱导自噬。相反，组成性激活JNK1的表达导致Bcl-2磷酸化，在正常生长条件下缺乏Bcl-2和Beclin 1结合，并增加自噬的基础水平。此外，多位点T69E+S70E+S87E Bcl-2类磷酸化突变体不与Beclin 1结合，也不抑制自噬(世界环境学会等.，2008年a). 因此，JNK1对Bcl-2非结构环的多位点磷酸化负责在饥饿期间破坏Bcl-2–Beclin 1结合，并随后激活自噬。有趣的是，病毒Bcl-2缺乏这种具有类似磷酸化位点的非结构环，并构成性地抑制Beclin 1的自噬功能(世界环境学会等.，2008年a)这表明它们已进化出逃避Bcl-2–Beclin 1相互作用的正常生理调节的机制。

BH3结构域与Bcl-2同源物的竞争性结合代表了Bcl-2/Bcl-X的另一种机制_L（左）-可以调节Beclin-1依赖性自噬的介导抑制。Beclin 1与Bcl-2或Bcl-X结合的竞争位移实验证明了这一点_L（左）Bad，一种仅含BH3的促凋亡蛋白。如上所述，营养剥夺减少了与Bcl-2/Bcl-X共同免疫沉淀的Beclin 1的数量_L（左）导致饥饿诱导的自噬水平增加。这与与Bcl-2/Bcl-X共免疫沉淀的Bad数量增加有关_L（左）(迈乌里等., 2007). 在siRNA介导的坏的在人类HeLa细胞或坏的敲除小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），但经BH3结构域肽模拟物ABT-737处理后，这些细胞中饥饿诱导的自噬得以恢复。最后，强制表达Bad，但不是Bcl-2结合缺陷的Bad突变体，足以在正常条件下和caspase抑制时诱导自噬。

因此，与Beclin 1的BH3结构域相比，与Bcl-2同源物结合的亲和力更高，或存在的浓度更高的各种BH3结构区蛋白，可能会竞争性地取代与Bcl-2结合的Beclin 1BH3结构段，从而废除Bcl-2/Bcl-X_L（左）-介导抑制Beclin 1依赖性自噬。事实上，除了Bad之外，其他仅BH3的蛋白质，如Nix/Bnip3(Daido公司等., 2004;张等., 2007;哈马切·布拉迪等2007年;施韦尔斯等., 2007;张等., 2008)，自行车(拉希米等., 2008)、Noxa、Puma和BimEL(阿贝丁等., 2007)已经证明可以诱导自噬，并且可能以类似的方式作为Beclin 1–Bcl-2/Bcl-X的竞争性抑制剂发挥作用_L（左）互动。因此，BH3结构域不仅通过介导Beclin 1和抗凋亡Bcl-2同源物之间的相互作用直接作用于自噬调节，还可能在BH3结构区的促凋亡Bcl2蛋白的背景下，通过影响Beclin l与Bcl-2/Bcl-X的相互作用间接调节自噬_L（左）.

除了上述两种调节机制外，很可能还有其他机制，例如调节Beclin 1和Bcl-2的表达，改变蛋白质的亚细胞定位和/或Beclin l的翻译后修饰，还调节Beclin 1与Bcl-2同源物的相互作用以及Bcl-2同系物介导的Beclin 1-依赖性自噬的抑制。这些潜在的监管机制是未来研究的重要领域。

BH3结构域：整合自噬和凋亡调节的结构基序

BH3结构域蛋白与各种Bcl-2同源物具有不同的亲和力，并可能竞争性地影响其他BH3结构区蛋白与Bcl-2的结合。BH3结构域蛋白的竞争性结合可能会受到翻译后修饰以及每个BH3结构区蛋白浓度的时空变化的综合影响的进一步调节。因此，含有Beclin 1和促凋亡BH3结构域的蛋白质可能分别间接调节细胞凋亡和自噬。如前所述，促凋亡BH3-only蛋白通过竞争性破坏低亲和力Beclin 1-Bcl-2/Bcl-X诱导自噬_L（左）相互作用(迈乌里等., 2007). 一个重要的问题是，通过这种机制，细胞在受到凋亡刺激时是否总是激活自噬。一个必然的问题是，促凋亡BH3-only蛋白是否也可以通过激活适应性自噬反应来发挥促生存功能，和/或通过激活导致自噬的毒性水平来发挥非凋亡促死亡功能。

Bcl-2磷酸化及其对不同BH3结构域蛋白结合的差异效应为进一步精细调节这些细胞事件提供了机制。这种协同调节只在细胞对营养饥饿的反应中进行了研究(世界环境学会等2008年b月)尽管类似的平行机制可能很好地调节对其他应激诱导刺激的反应。营养剥夺导致JNK1介导的Bcl-2多位点磷酸化水平增加，磷酸化Bcl-2的水平取决于饥饿的持续时间。这可能导致与Bcl-2结合的不同BH3结构域蛋白的不同Bcl-2磷酸化水平依赖性分离(世界环境学会等2008年b月). 例如，世界环境学会等（2008年b）表明饥饿后早期，低水平的多位点Bcl-2磷酸化导致Bcl-2–Beclin 1复合物的离解增加，并增加Beclin 1-依赖性自噬，这可能是促进细胞存活的一种尝试。然而，在长时间饥饿后，当自噬不能维持细胞存活时，较高水平的多位点磷酸化Bcl-2导致其与BH3结构域中的促凋亡蛋白（如Bax）分离，同时伴有caspase 3激活和凋亡(世界环境学会等2008年b月). 因此，Bcl-2对Beclin 1的BH3结构域与促凋亡Bcl-2家族成员的差异亲和力可能为Bcl-2翻译后修饰提供了一种机制，以暂时协调Bcl-2的自噬和凋亡双重调节。

Beclin 1作为一种新的BH3-only蛋白

Bcl-X复合物的第一个结构_L（左）与Bcl-2同源物结合所需的最小Beclin 1区域结合，表明Bcl-2结合区域构成BH3结构域，与Bcl-X结合_L（左）以类似于促凋亡蛋白BH3结构域的方式(伊达尔-奥伯施泰因等., 2007). 基于这一结构证据，作者推测Beclin 1可能是一种促凋亡的BH3-唯一蛋白。此外，有人认为，Beclin 1在肿瘤抑制中的作用可能是由这种促凋亡作用而非其促自噬功能来解释的。然而，到目前为止，还没有生理学相关证据表明Beclin 1具有促凋亡功能，也没有证据表明这种拟议的功能有助于其肿瘤抑制作用。

毛伊里等. (2007)发现，尽管微量注射与Beclin 1的BH3结构域相对应的高浓度肽可诱导Bax依赖性凋亡，但强制过表达全长Beclin l未能触发线粒体膜通透性转换或凋亡。这表明Beclin 1的BH3结构域之外的某些区域可能发挥预防、抗凋亡功能，“中和”分离的BH3区域的潜在凋亡作用。此外，哺乳动物Beclin 1的表达减少或敲除已被证明在几种不同的环境中增加而不是减少了细胞凋亡，例如在缺乏营养的HeLa细胞中(博雅等., 2005); 血管生成抑制剂治疗内皮细胞(阮等., 2007;拉马克里希南等2007年); 软骨细胞缺氧(博亨斯基等., 2007); 苯扎氯铵或紫外线照射引起的结膜细胞死亡(博亨斯基等., 2007); 抗Fas抗体或阿霉素治疗后的HEPG2细胞(丹尼尔等., 2006); 用C（2）-神经酰胺处理的MEF(藤原等等，我., 2008); 维甲酸或维生素D3治疗人髓系白血病细胞(王，2008); 香烟烟雾提取物对人支气管上皮细胞的影响(基姆等., 2008); 培养的肝癌细胞(原田等., 2008); 辐照后的多种人肿瘤细胞系(Apel公司等., 2008); 顺铂损伤后的肾小管上皮细胞(杨等., 2008). 此外，据报道线虫的细胞凋亡增加，而线虫的秀丽线虫beclin 1正交曲线，贝克-1(Takacs Vellai公司等., 2005).

同样，没有证据表明Beclin 1通过发挥促凋亡作用而发挥肿瘤抑制作用。在肿瘤易发上皮细胞中贝克林1^+/−小鼠或从这些小鼠中获得的易患肿瘤的永生化上皮细胞中，没有证据表明凋亡减少，等位基因丢失贝克林1(Karantza-Wadsworth公司等., 2007;马修等., 2007;曲等., 2007). 然而，在贝克林1等位基因缺失，上皮细胞显示细胞生长控制缺陷(曲等2003年)更容易导致DNA损伤和染色体不稳定(Karantza-Wadsworth公司等., 2007;马修等., 2007)表明Beclin 1的凋亡非依赖性功能有助于其抑癌作用。因此，BH3结构域似乎不能使Beclin 1在生理上作为BH3唯一的促凋亡蛋白发挥作用，或者这种拟议的作用有助于其抑癌活性。

Beclin 1促凋亡功能的另一个理论论点，除了观察到它是一种BH3-唯一蛋白外，是基于观察到的不同BH3-唯一蛋白质的BH3结构域与Bcl-2抗凋亡同源物结合时的竞争性抑制。如前所述，仅BH3促凋亡蛋白对Beclin 1与Bcl-2同源物结合的竞争性抑制是这些蛋白间接上调自噬的机制(冯等., 2007;伊达尔-奥伯施泰因等., 2007). 同样，Beclin 1 BH3结构域可能通过竞争性抑制Bcl-2与促凋亡Bcl-2蛋白BH3结构区的结合来诱导凋亡。然而，这似乎不太可能，因为与Beclin 1 BH3结构域的亲和力相比，所有细胞Bcl-2同源物结合促凋亡蛋白特定亚群的BH3结构区的亲和力要高得多(辛哈等., 2008). 相反，Beclin 1的BH3结构域更有可能作为一个结构基序，实现凋亡和自噬的协调调节。因此，虽然Beclin 1在某些情况下可能作为促凋亡蛋白发挥作用的形式上的可能性仍然存在，但我们认为Beclin 2是一种新型的BH3纯蛋白，其中BH3结构域使抗凋亡Bcl-2同源物能够抑制自噬（通过直接结合）并使促凋亡BH3-only同源物刺激自噬（通过竞争性抑制与Bcl-2/Bcl-X的结合_L（左）).

Bcl-2抑制Beclin 1依赖性自噬：肿瘤发生的潜在机制？

Bcl-2是第一个通过阻止凋亡细胞死亡而不是通过增加细胞增殖而发挥癌蛋白功能的细胞蛋白(麦克唐奈等., 1989;沃克斯等., 1998). 鉴于Beclin 1和自噬途径作为肿瘤抑制剂的新证据(爱丁格尔和汤普森，2003年;Ogier-Denis和Codogno，2003年;Gozuacik和Kimchi，2004年;Shintani和Klonsky，2004年;古箭等2005年;金，2006;莱文，2006;Pattingre和Levine，2006年)一个尚未回答的关键问题是，Bcl-2的抗自噬活性是否也有助于其致癌活性。尽管在正常细胞中，Bcl-2–Beclin 1相互作用的破坏激活了自噬；Bcl-2过表达在人类癌症中常见，也可以抑制培养细胞和小鼠自噬的生理激活(梁等1998年;帕廷雷等., 2005). 此外，KSHV vBcl-2和其他致癌γ疱疹病毒编码的可能其他病毒Bcl-2不可逆地与Beclin 1结合，并作为自噬的组成性抑制剂发挥作用，因为它们缺乏BH4和BH3结构域之间的非结构环，而BH4结构域经历调节性磷酸化(世界环境学会等.，2008年a). 因此，细胞Bcl-2的过度表达和病毒Bcl-2通过阻断Beclin 1的功能来破坏自噬途径的肿瘤抑制活性是合理的。

值得注意的是，Beclin 1不仅是一种单倍体充分的肿瘤抑制因子，而且积极调节Beclin 1-class III PI3K复合物的其他蛋白质，包括UVRAG、Bif-1和Ambra1，也在阴性生长控制和/或肿瘤抑制中发挥作用(莱文和克罗默，2008年). 因此，Beclin 1–III类PI3K囊泡成核复合体可能是自噬控制和肿瘤抑制（包括抑制淋巴腺病）中的一个重要环节。B细胞淋巴瘤是最常见的自发性肿瘤，发生于单等位基因缺失的小鼠贝克林1(曲等., 2003;岳等., 2003)或双等位基因缺失双歧杆菌-1(高桥等., 2007). 因此，在患者和小鼠模型中有助于淋巴瘤形成的细胞Bcl-2和病毒Bcl-2可能通过自噬抑制发挥其致癌活性，至少部分是这样。破坏Bcl-2/Bcl-X的特定试剂_L（左）–Beclin 1 BH3域绑定，不中断Bcl-2/Bcl-X_L（左）-促凋亡BH3蛋白结合和/或Bcl-2/Bcl-X突变_L（左）选择性地破坏其与Beclin 1的相互作用，将需要解决这个假设。

一个相关的问题是，除了肿瘤抑制之外，细胞和病毒Bcl-2同源物是否还调节涉及Beclin 1和自噬的其他过程，如凋亡尸体清除、先天免疫、神经退行性疾病的预防以及心脏病的适应性和不适应性反应(莱文和克罗默，2008年). 至少，考虑到Beclin 1和自噬在细胞内病原体降解（排他性）以及先天性和适应性免疫激活中的核心作用(施密德等2006年;Levine和Deretic，2007年;Orvedahl和Levine，2008年)看来，以Beclin 1功能为靶点的病毒Bcl-2可能有助于γ疱疹病毒的发病。事实上，另一种疱疹病毒编码蛋白，即与Beclin 1的不同区域结合的I型单纯疱疹病毒ICP34.5对自噬的抑制，已被证明是单纯疱疹病毒诱导的致死性脑炎的关键(奥维达尔等., 2007). 一项高度优先的研究将是确定细胞和病毒Bcl-2同源物是否也通过与Beclin 1的BH3结构域结合并随后抑制自噬而导致人类疾病。

Bcl-2–Beclin 1相互作用：一种新的自噬诱导治疗靶点？

Beclin 1在自噬体形成中起核心作用，Bcl-2/Bcl-X_L（左）作为Beclin 1介导的自噬水平的重要调节器。因此，Bcl-2/Bcl-X_L（左）-Beclin 1复合物是自噬调节的重要治疗靶点。破坏复合物的化合物将导致自噬增加，并可能有助于预防和/或治疗某些疾病，如衰老、某些癌症、传染病和神经变性疾病。稳定该复合物的化合物在可能需要抑制自噬的情况下可能有用，例如在自噬被视为促生存机制的既定肿瘤中。

BH3肽模拟物最初是在靶向癌症治疗的背景下开发的，旨在通过干扰抗凋亡Bcl-2同源物和促凋亡BH3纯蛋白之间的相互作用来增加肿瘤细胞的凋亡。毫不奇怪，考虑到BH3结构域在Bcl-2调节凋亡和自噬中的中心作用，它们也构成了一类药物，可以通过破坏Bcl-2同源物和Beclin 1的BH3结构区之间的相互作用来诱导自噬。这种抑制剂的第一个例子是ABT-737(奥尔特斯多夫等2005年)特异性靶向与Bad BH3结构域高亲和力结合的抗凋亡Bcl-2同源物。测定合成肽与纯化重组Bcl-X结合的试验_L（左） 在体外表明ABT-737还竞争性地抑制Beclin 1 BH3肽与IC的结合₅₀在微摩尔范围内(迈乌里等., 2007). 与这一发现一致，在对ABT-737促凋亡作用有抵抗力的细胞中，用该抑制剂预处理可消除Beclin 1与Bcl-2或Bcl-X的免疫沉淀_L（左）并诱导高水平的自噬(迈乌里等., 2007). Bcl-2或Bcl-X不能抑制ABT-737诱导的自噬_L（左）过度表达，但转染不结合ABT-737的Mcl-1或通过siRNA-介导的Beclin 1基因敲除均被消除。这些结果清楚地表明，Beclin 1与Bcl-2或Bcl-X相互作用的竞争性破坏_L（左）小分子抑制剂足以诱导自噬(迈乌里等., 2007). 基于Bcl-2同源物/Beclin 1 BH3结构域复合物的结构分析，BH3肽模拟物的进一步改进可能会提高这类药物诱导自噬的特异性和/或效力。

目前，BH3肽模拟物的促自噬作用在肿瘤治疗药物研发中是否应该增强或减少，仍存在争议。自噬诱导可能促进肿瘤细胞的存活，从而抵消或限制这些化合物诱导凋亡的功效。然而，过度的自噬也可能通过自我吞噬促进细胞死亡，并有助于杀死肿瘤细胞。事实上，最近的证据表明，一种实验性BH3模拟物obatoclax以一种独立于Bax和Bak，但依赖于Atg5、Atg7和Beclin 1的方式杀死对糖皮质激素耐药的白血病细胞(博恩豪塞等., 2008). 因此，不同的BH3模拟物可能诱导自噬依赖性细胞存活或自噬依存性细胞死亡，这取决于自噬诱导的程度。确定BH3肽模拟物诱导自噬的最佳水平不仅对于治疗特定癌症，而且对于自噬刺激可能有益的其他疾病的潜在治疗也很重要。

结论

总之，我们在这里回顾的研究表明，重要的自噬效应器Beclin 1包含一个BH3结构域，该结构域具有与抗凋亡Bcl-2同源物结合的保守分子机制。然而，尽管有这种保守的机制，并且与含有经典BH3结构域的蛋白质不同，Beclin 1似乎在细胞凋亡中没有发挥重要作用。相反，对Beclin 1 BH3结构域的研究指出，BH3结构区的一种新功能使抗凋亡Bcl-2同源物能够抑制自噬，自噬是另一种参与组织稳态的基本细胞途径。因此，Beclin 1 BH3结构域促进了Bcl-2同源物对自噬（主要是细胞生存途径）和凋亡（细胞死亡途径）的协调调节。也许，通过与“抗凋亡”Bcl-2同源物结合的共同分子机制，简单的BH3结构域实际上具有复杂的细胞功能。

致谢

脚注

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