有丝分裂磷酸化定量图谱

摘要

真核细胞分裂周期的执行导致细胞物质的协调复制和分离成两个新形成的子细胞。该过程经过精确调节，以确保每一步在下一步开始之前如实完成(1). 任何时候的错误都可能对细胞造成灾难性影响，在人类中会导致多种疾病状态，包括癌症(2). 阐明细胞周期的事件和调节机制具有广泛的兴趣，并已被深入研究。

精液实验确定了M期促进因子（MPF），因其能够诱导有丝分裂而得名(三,4). MPF被证明是一种细胞周期依赖性激酶（CDK）复合物，Cdc2–CyclinB(5). 在有丝分裂期间，细胞会发生剧烈变化：转录和翻译停止，染色体浓缩，核膜破裂，核仁溶解，有丝分裂纺锤体形成。CDK和其他有丝分裂激酶的磷酸化作用有助于调节这些过程(6).

在识别细胞周期激酶底物和理解其磷酸化的后果方面，人们付出了巨大的努力。然而，由于传统的磷酸化检测方法难以在蛋白质组范围内应用，如使用放射性磷酸盐、磷酸特异性抗体和凝胶迁移率变化，进展速度受到了限制(7). 质谱作为一种生物分析工具的出现，以及富集和检测磷酸肽技术的改进，使得从单个样品中鉴定数千个磷酸化位点成为可能(8–10). 随着定量方法的最新发展，监测体内数千种蛋白质的磷酸化变化(10,11).

在这项研究中，我们使用了我们实验室和其他地方最近开发的几项改进，以及代谢标记，来调查在细胞周期相反阶段停滞的HeLa细胞的未分解裂解物中蛋白质磷酸化的相对水平。我们在3682种不同蛋白质上鉴定了14000个以上的独特磷酸化位点。重要的是，我们测量了包含大多数位点的肽的相对丰度。数据显示，在有丝分裂期间，主要在细胞周期蛋白依赖性激酶靶基序[pS/pT]-P内有大量磷酸化波，表明大多数位点可能是CDK的直接靶点。在调控的磷酸化位点中，有许多典型的细胞周期调控事件和许多已知细胞周期调控因子上的未报告位点。功能分析表明，参与关键细胞周期过程的蛋白质具有强烈的偏见，这表明许多未知靶点本身可能是细胞周期的调节器。

结果

我们在含有¹³C类₆¹⁵N个₂-赖氨酸和¹³C类₆¹⁵N个₄-精氨酸（“重”）。细胞与任一G混合₁或在常规培养基（“光”）中生长并在8M尿素中溶解的M期阻滞细胞(图1). 混合的全细胞提取物直接用胰蛋白酶进行蛋白质水解。所得肽通过固相萃取脱盐，然后通过强阳离子交换（SCX）色谱分离。收集12个组分，平均分离，并通过铁固定化金属离子亲和色谱富集磷酸肽(12,13)（IMAC）或使用TiO₂树脂(14,15). IMAC和TiO₂将来自相同SCX组分的洗脱液混合。每个实验中的12个样品进行了两次分析，共48次90分钟的LC-MS/MS运行。数据采集是使用在双检测模式下运行的混合Orbitrap质谱仪进行的。通过高分辨率测量扫描在Orbitrap中检测到完整的肽离子，并从每次测量扫描中选择10个最丰富的离子在线性离子阱中进行MS/MS碎片化和分析，结果产生>325000 MS/MS光谱。我们使用了SEQUEST算法(16)具有级联的目标诱饵数据库(17)将人类蛋白质的光谱与肽序列相匹配。以诱饵匹配为指导，使用通用参数（质量偏差、XCorr、dCn′）筛选匹配项(17). 使用Ascore算法评估了基于磷酸化特异性片段离子观察的正确磷酸化位点分配的概率(9)每个磷酸肽上的每个位点[支持信息（SI）表S1].

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图1。

定量细胞周期磷蛋白组分析的样品制备和数据分析。异步HeLa细胞在含有¹³C类₆¹⁵N个₂-赖氨酸和¹³C类₆¹⁵N个₄-精氨酸，裂解，并与双胸苷或诺卡唑的裂解产物按细胞数1:1混合，将细胞在标准培养基中培养并用胰蛋白酶在溶液中消化。对每个实验中的肽进行强阳离子交换色谱，并在每次运行中收集12个部分的洗脱液。用IMAC和TiO分离并富集每个组分的磷酸肽₂。浓缩的洗脱液按级分重组，并在混合线性离子阱-轨道阱质谱仪上一式两份进行分析。在进一步自动化分析之前，使用SEQUEST搜索MS/MS光谱并过滤至1%的假发现率，以确定磷酸化位点定位并进行量化。过滤后的数据集包含68379个磷酸肽，错误发现率为0.3%。这些肽含有14265个独特的磷酸化位点。

最终的数据集包含68379个磷酸肽，从3682个不同的蛋白质中估计错误发现率为0.3%（200次总反向点击）。这包括33501个磷酸肽（2731个蛋白质），这些磷酸肽来自于双胸苷阻滞剂（G₁)细胞和诺克唑阻滞（M）细胞中的34878个磷酸肽（3181个蛋白质）。这些数据对应于至少14265个不同的磷酸化事件(表S1). 在确定的位点中有许多典型的细胞周期磷酸化。其中包括Lmna的S-22和S-392(18)在核膜破裂所需的M相中，G中Cdc2的抑制位点T-14和Y-15₁(1)，有丝分裂中的Cdc2激活位点T-167(1)，Cdc2活化磷酸酶Cdc25c上的活化位点(1)和Cdc2抑制激酶Pkmyt1上的抑制位点(1)有丝分裂。

通过添加IMAC和TiO₂在SCX色谱后的磷酸肽富集步骤中，我们将之前工作中从诺卡唑处理的HeLa细胞裂解物中鉴定的位点数量增加了近一个数量级(9) (图S1). 我们观察到该研究中发现的75%的位点，还有将近13000个。Olsen的磷蛋白组学分析等。(10)在表皮生长因子处理的HeLa细胞中鉴定出6600个位点。我们的数据包括3545个常见位点，其中53%在之前的研究中(图S1). PhosphoSite数据库(19) (网址：www.phosphosite.org)是一个磷酸化位点的精心收集，从文献中有13000多个人类位点。我们的数据包含这些网站中的4051个（31%）。在我们的数据集中以高置信度定位的站点中（12297；P（P）<0.05），据我们所知，文献中尚未报道6764个。

为了进一步对我们数据集的广度进行基准测试，我们使用纯化的成分将我们的结果与三种定向分析的结果进行了比较(图S1和表S2). 从HeLa细胞中纯化紫杉醇稳定的有丝分裂纺锤体的研究(20)从72个纺锤体蛋白中鉴定出312个位点。在不富集纺锤体蛋白的情况下，仅考虑在M期细胞中发现的局部位点，我们从93个已知纺锤体蛋白质中鉴定出577个位点，包括165个（53%）先前报道的位点。我们还在Nup107–160复合物的9个蛋白质上鉴定了32个位点，包括亲和纯化后鉴定的12个位点中的6个(21)和后期促进复合物蛋白质的47个位点，包括从纯化APC鉴定的43个位点中的27个(22). 我们为凝集素复合体、复制前复合体和定位于核膜的蛋白质编制了额外的位点列表(表S2).

虽然双胸苷和诺卡唑阻滞不能完全模拟生理细胞周期状态，但已证明它们忠实地再现了许多细胞周期调控事件，并为细胞周期生物学提供了宝贵的见解。选择异步细胞作为普通参考样品，以检测有丝分裂磷酸化的巨大变化，并提供两种阻滞状态之间的比较方法。使用软件程序Vista自动计算捕获细胞和非同步细胞中同化轻肽对和重肽对的相对丰度(23) (图S2). 我们测量了52934个磷酸肽的丰度比，包括来自3049种不同蛋白质的11243个非冗余肽(表S3). 每个样本的重复分析使我们能够评估在两项试验中检测到的肽丰度比的再现性(图S3). 对于S/N≥3的测量，91%（G₁)所有丰度比中89%（M）在重复测量平均值的20%以内。

轻-重比>1表示滞留细胞的丰度增加。日志₂这个比率的转换提供了一个相对丰度的方便测量(图2). 基于非磷酸化肽比率的分布，我们认为相对丰度变化≥2.5倍的磷酸化肽是受调控的，而变化<1.5倍的磷酸肽是不受调控的。以G为单位₁-细胞停滞，数百个磷酸肽大量变化(图2A类和表S3). 相反，有丝分裂细胞中数千个磷酸肽上调(图2 B类和C类).

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图2。

磷酸肽丰度分布。(A类和B类)日志₂-G中所有定量磷酸肽的转化轻：重（滞留：异步）比率₁(A类)和M(B类)细胞停滞期。垃圾箱宽0.5个单位；例如，“0”箱从−0.25延伸至+0.25。(插图)显示了每个实验中未磷酸化肽的分布。(C类)变化≥2.5倍的肽被认为是受调控的，而变化≤1.5倍的肽则不受调控。(D类和E类)日志₂对于G，显示了具有不同磷酸化基序的肽的磷酸肽丰度分布₁相位传感器(D类)有丝分裂细胞(E类). 磷酸化位点分为三个基序中的一个，[pS/pT]-P、[pS/pT]-X-X-[D/E]或[K/R]-X-X-[pS/pT]。缺少这些基序的位点被归类为“其他”。只有包含单一基序类的肽被纳入分析。

为了控制可能导致磷酸化丰度水平明显变化的蛋白质丰度水平的变化，我们在磷酸肽富集前分析了大量来自M相SCX组分的非磷酸化肽(图2B类). 使用每种蛋白质的非磷酸化肽的中位数丰度比（参见SI材料和方法)，我们对M期样品中的2884个蛋白质进行了定量测量(表1和表S4). 大多数蛋白质比率没有变化；2327个蛋白质（81%）变化<1.5倍，只有182个蛋白质（6.3%）变化≥2.5倍。我们用调节性磷酸肽鉴定了1944个M期蛋白，并测量了其中842个（43%）的蛋白质丰度。96个蛋白质（11%）变化≥2.5倍。我们的结论是，绝大多数磷酸化变化不能用蛋白质水平的变化来解释。一个令人惊讶的发现是，许多丰度变化最大的蛋白质，如极光激酶B、Polo激酶1和细胞周期蛋白B1，都被APC降解(24–26) (表1和表S4)，表明其他可能也是底物。

细胞周期素依赖性激酶需要在氨基酸上的脯氨酸直接羧基末端到磷酸受体残基(27). 日志的分布₂含有脯氨酸导向（[pS/pT]-P）、嗜酸（[pS/pT]-X-X-[D/E]）和嗜碱（[K/R]-X-X-[pS/pT]）三种广泛基序分类磷酸化位点的肽的丰度比表明，大多数变化的磷酸肽都含有[pS/t]-P位点(图2). 然而，尽管数量有限，但仍有大量有丝分裂调控的嗜酸和嗜碱位点含有磷酸肽，其中相当一部分缺乏经典基序。对G的相同分析₁磷酸化位点显示了所有基序的几乎均匀分布。对上调有丝分裂位点的Motif发现分析产生了许多pS-P基序(图3)和两个与Aurora激酶A磷酸化的基序类似的基序，[K/R]-[K/R]-X-pS[在+1处对L有偏见，共识=[K/N/R]-R-X-[pS/pT]-Φ(28)]和Polo-like激酶1，[D/E]-X-pS-X-[D/E]-[D/E[L在+1处有偏倚，共识=[D/E]-X-[pS/pT]-Φ-X-[D/E](29)] (图3). 基于这些一致的序列，我们从我们的数据中汇编了Aurora激酶a和Polo激酶1的调节候选底物列表(表S5). 其中包括已知底物Tacc3(30)和Dlg7（Hurp）(31). 此外，我们确定了两个基序，即pS-[A/G]-X-[K/R]和P-X-pS-X-[K/R]，它们占缺乏经典基序的受调控磷酸肽的很大一部分。含有这些基序的磷酸调节肽的蛋白质包括核糖核酸酶Dicer1和Wnk1激酶(表S5).

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图3。

基底基序发现。我们使用Motif-X从有丝分裂调控肽中提取磷酸-氨基酸基序(9). 仅Ascore≥13且丰度比中值（L:H）≥4的地点(n个=2949）。(A类)其中超过一半（1670个）的位点位于pS-P基序中。(B类和C类)我们确定了两个与有丝分裂激酶相似的基序(B类)极光激酶A和(C类)Polo-like激酶1，其一致性底物序列分别为[K/N/R]-R-X-[pS/pT]-Φ和[D/E]-X-[pS/pT]-Φ-X-[D/E]，其中Φ表示任何疏水残基。请注意这两种情况下亮氨酸在+1位置的偏差。(D类和E类)我们还发现了两个显著的基序，其中包括+3的基本残基，但缺少+1脯氨酸。

为了便于蛋白质水平的分析，我们开发了一种简单的测量方法，即调节磷酸化（RePh）评分。RePh评分是对同一磷酸化位点进行多次观察所得的中位数丰度比。对于每种蛋白质，我们记录了Max RePh（代表任何位点的最高值）和P-RePh分数（代表单个位点RePh得分的总和）(表S3). 为了评估RePh评分的效用，我们检查了分配给两组有丝分裂蛋白的评分，即文献中发现的153种已知的有丝分裂上调磷酸蛋白(表S6)和273个与基因本体论（GO）术语“有丝分裂细胞周期”相关的蛋白质[GO:0000278(32)]. 我们在113种有丝分裂磷蛋白的M期数据中发现了磷酸化位点，以及除7种外的所有磷蛋白中至少一种调节的磷酸肽；共发现111个GO相关基因，其中91个具有调节性磷酸肽(表S6). 已知的有丝分裂蛋白得分始终高于全组，已知的有核分裂磷酸蛋白得分甚至更高(图4A类). P-RePh分数的分布(图4 B类和C类)显示了G的显著不同的蛋白质磷酸化景观₁和M期细胞。只有42 G₁与来自M期细胞的947个蛋白质相比，这些蛋白质的P-RePh得分>10。

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图4。

蛋白质调节磷酸化（P-RePh）评分。P-RePh评分是对分配给数据集中每个蛋白质的调节磷酸化位点的累积评估。(A类)绘制了所有G的M期P-RePh评分高于给定阈值的分数₁（黑色痕迹）和M期（红色痕迹）磷酸蛋白，以及GO:0000278（有丝分裂细胞周期）（绿色痕迹）注释蛋白和文献中确定的已知有丝分裂磷酸蛋白（蓝色痕迹）。(B类和C类)G中上调磷酸化的整个蛋白质组地形图₁(B类)和M相(C类)单元格。人类蛋白质组中的每个蛋白质都表示为连续138×138平面上的一个点。P-RePh分数显示在z（z）轴。绘图比例相同，最大P-RePh为500。有丝分裂图中的剪切峰对应于Ki-67（P-RePh=1103）。

使用DAVID对高得分蛋白质进行GO分析(33)确定统计上代表人数过多的术语关联(表S7). 我们发现了众所周知的有丝分裂生物学过程，如有丝分裂姐妹染色单体分离和染色体凝聚，以及广义的M期和有丝分裂。细胞成分GO分析还揭示了预期的有丝分裂类别，如动粒、纺锤体和核膜。尽管G中很少有蛋白质上调₁我们发现GO术语与DNA损伤反应有关。这并不奇怪，因为双胸苷阻滞轻度激活DNA损伤反应（S.Elledge，数据未显示）。许多监管最严格的G₁磷酸化位点，如Smc1和Utp14a中的磷酸化位点发生在DNA损伤激酶ATM和ATR靶向的[pS/pT]-Q基序中。

我们还对可能优先受磷酸化调控的候选蛋白质类和复合物进行了额外的定向分析。这些集合包括已知细胞周期蛋白上许多以前未描述的调控位点，包括APC、复制前复合物和凝集素复合物的元素；激酶；和核膜蛋白(表S8).

讨论

由于其与人类病理学的密切联系，细胞周期生物学是一个研究密集的领域，参与者不断增加，调控网络日益复杂。磷酸化在细胞周期中的重要性，特别是在细胞通过有丝分裂过程中的重要性早就被认识到。鉴定有丝分裂磷酸化蛋白质的尝试取得了适度的成功。针对有丝分裂提取物的单克隆抗体显示16条磷酸化蛋白带仅存在于有丝分裂细胞提取物中(34); 稍后的磷酸化筛选在体外-翻译的非洲爪蟾有丝分裂卵提取物中的cDNA鉴定出20种蛋白质(35); 而传统的单基因分析已经鉴定出超过150个磷酸蛋白（参见表S6供参考）。在本研究中，使用质谱法，我们鉴定了1000多个有丝分裂磷酸蛋白，其磷酸化水平在细胞周期中变化；测量M期和G期磷酸化肽的相对丰度₁被捕细胞；在大多数情况下，确定了磷酸化的精确位点。这项工作为寻找磷酸化依赖性细胞周期调节的参与者提供了一个相当大的疑点列表，并代表着在磷酸化如何调节细胞-视觉周期的机制理解方面取得了重大进展。

最引人注目的发现是(我)在有丝分裂细胞和(ii（ii）)其中有多少是多重磷酸化的。1000多个蛋白质被磷酸化四倍以上；280个蛋白在≥10个位点磷酸化；得分最高的蛋白Ki-67在>100个有丝分裂上调位点磷酸化。多重磷酸化可作用于信号整合，产生信号阈值，或产生动态行为，如超敏反应(36). 磷酸化可能有复杂的作用，但不容易通过单个位点分析进行分析。多磷酸盐的添加会引起物理化学变化，从而影响蛋白质的构象、相互作用、亚细胞定位和稳定性。在NFAT1的情况下，13个位点的去磷酸化促进了影响其定位的构象变化(37). 在我们的数据集中，多重磷酸化蛋白可能会经历类似的调控。

遗传和生物化学实验已经鉴定了许多有丝分裂激酶(6). 我们检测到50多种激酶具有有丝分裂上调的磷酸化位点(表S7)，包括Cdc2调节器Pkmyt1的富含甘氨酸回路中的一个位置。该位点与Cdc2苏氨酸-14同源，后者是一个被Pkmyt1和Wee1磷酸化的抑制位点(1). 它也可能抑制Pkmyt1激酶活性。我们还鉴定了18种有核分裂下调位点的激酶(表S8). 引人注目的是，我们在三种Map激酶的激活环中发现了磷酸肽，它们分别是Mapk1（Erk2）、Mapk3（Erk1）、Mapk 14（p38 Mapkα）和上游激酶Map2k2（Mek2）的20倍、35倍、11倍和5倍下调。这与之前的报告一致(38).

识别激酶-底物对仍然是理解细胞信号网络的主要障碍。我们的数据为发现底物基序提供了机会，这些基序为激酶的身份提供了线索。除了含脯氨酸的CDK样位点外，我们还发现了与有丝分裂激酶AurkA和Plk1相似的基序，以及每个基序的众多候选底物(表S5). 我们还鉴定了两个基序，它们在+3位置有一个基本残基，但缺少+1脯氨酸。其中之一需要一个小的氨基酸，在+1位的丙氨酸或甘氨酸。这些可能是非传统的CDK位点，需要少量残基来克服对脯氨酸的需求。或者，它们可能被未知的有丝分裂激酶磷酸化。具有这些基序的肽可用于生化分析，以纯化和鉴定激酶。蛋白质与蛋白质的相互作用也可以告知激酶与底物的关系。通过将有丝分裂P-RePh评分映射到人类蛋白质相互作用网络，我们鉴定了大量有丝分裂磷酸化蛋白，这些蛋白直接与主要有丝分裂激酶Plk1、Cdc2、Aurka和Aurkb相互作用(图5和图S4). 对于Plk1和AurkA，许多相互作用的蛋白质（Aspm1、Cdc25c和Tpt1代表Plkl；Pml和Tpx2代表AurkA）也出现在调控候选底物列表中(图5,图S4、和表S5).

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图5。

有丝分裂磷酸化和人类蛋白质相互作用网络。图中显示的是第一个相邻的人类蛋白质相互关系网络(41)Polo-like激酶1。在我们的有丝分裂数据集中发现黄色结节被磷酸化。每个节点的大小与其有丝分裂P-RePh评分相对应，较大的节点在有丝分裂中磷酸化程度更高。带有厚重黑色边框的节点也包含受监管的候选Plk1站点。Cdc2、AurkA和AurkB的其他网络如所示图S4.

有丝分裂磷酸蛋白数据的功能分析确定了细胞周期生物学中常见的核心过程和结构，包括定位于纺锤体和核膜的蛋白质，以及在染色体凝聚和染色单体分离中的功能。许多蛋白质在磷酸化过程中经历细胞周期调节的变化尚不清楚。

在这项研究中，我们的磷酸肽富集策略减少了许多最丰富的细胞蛋白的干扰。1883个未被非磷酸化肽识别的磷酸蛋白的检测证明了这一点。超过三分之二已知有丝分裂磷酸蛋白的鉴定进一步强调了我们分析的深度。我们确定了数千个细胞周期调控事件，大大拓宽了本已拥挤的领域。尽管这些数据暗示了具有挑衅性的新功能联系和调控机制，但只有更直接的实验才能揭示这些关系的真实性质和重要性。我们希望，这项工作将有助于制定有关细胞周期事件调控的具体假设，并为未来的生物研究提供一个启动平台。

实验程序

补充材料

致谢。

脚注

工具书类