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生物化学杂志。2008年5月9日；283(19): 13302–13309.
数字对象标识：10.1074/jbc。M800342200型
预防性维修识别码：下午2442318
PMID：18305110

核和细胞质TAR DNA结合蛋白（TDP-43）的干扰导致疾病样的再分配、隔离和聚集形成*S⃞

马修·温顿,‡ 莱昂内尔·伊加兹,‡ 玛格丽特·M·王,‡ Linda K.Kwong（琳达·光）,‡ 约翰·特洛伊亚诺夫斯基,‡§和弗吉尼亚·M·Y·李‡§,1
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摘要

TAR DNA-结合蛋白43（TDP-43）是额颞叶变性伴泛蛋白阳性内含物（FTLD-U）肌萎缩侧索硬化症（ALS）。虽然正常的TDP-43是一个核蛋白质，病理性TDP-43作为不溶物重新分布和隔离在神经元细胞核、胞体周和神经突中聚集。这里我们重述一下通过改变内源性TDP-43在培养细胞中的病理表型核贩运和用缺陷核表达突变体定位（TDP-43-ΔNLS）或核出口信号（TDP-43-ΔNES）。限制内源性细胞质TDP-43进入核或阻止其退出核导致TDP-43骨料形成。TDP-43-ΔNLS积聚为不溶性细胞质聚集和隔离内源性TDP-43，从而耗尽正常核TDP-43，而TDP-43-ΔNES形成不溶性核聚集体内源性TDP-43。TDP-43的突变形式也复制生物化学FTLD-U/ALS中病理性TDP-43的分布。因此，FTLD-U/ALS发病机制可能在机械上与核的有害扰动有关TDP-43的运输和溶解性。

TAR DNA结合蛋白43（TDP-43），由TARDBP公司基因开启1号染色体是一种高度保守、普遍表达的核蛋白与抑制基因转录、抑制外显子剪接有关，与剪接因子和核体的相互作用(1,2). 最近，我们发现TDP-43作为疾病蛋白在中枢形成不溶性聚集物额颞叶变性患者的神经系统（FTLD）2和肌萎缩侧索硬化症（ALS）。由于FTLD患者经常出现运动障碍与ALS一致的神经元疾病，因为ALS患者也可能发展认知障碍和FTLD，两者中都存在TDP-43神经病理学疾病提供了连接FTLD和ALS的分子链同一神经退行性疾病的临床病理谱(即TDP-43蛋白病）(三-6).

FTLD包括一组临床、遗传学和神经病理学异质性神经退行性疾病占老年前期痴呆(7-9).虽然神经退行性τ蛋白病约占家族性和散发的FTLD病例中，TDP-43是在泛素阳性、τ-和α-向日葵素阴性内含物占FTLD病例的大多数（指定为FTLD-U）(4,10). TDP-43夹杂物为也存在于散发和家族性ALS患者的脊髓和大脑中除了SOD-1突变引起的家族性ALS外(三-6).

FTLD-U和ALS的TDP-43神经病理学以细胞质、，神经元和胶质细胞中的神经炎和核内含物(4,11-13).我们之前表明，在疾病神经元伴随着正常TDP-43的急剧清除染色，表明TDP-43从整个细胞核重新分布到靠近原子核的焦点(4,13-15).此外，发现正常TDP-43浓缩为核内包裹体主要是家族性FTLD伴粒蛋白(GRN公司)突变和罕见与含缬氨酸蛋白突变相关的疾病(4,14). 这里我们为TDP-43建模培养细胞中的细胞质、神经炎和细胞核内含物，以及证明内源性TDP-43在细胞核和细胞质导致聚集体的形成。此外缺陷核定位突变型TDP-43的表达（ΔNLS）或核出口信号（ΔNES）干扰内源性TDP-43贩运并概括了独特的TDP-43病理学特征FTLD-U和ALS疾病谱。我们的数据表明TDP-43发生了改变贩运是FTLD-U和ALS的致病机制。

实验程序

构件-编码人TDP-43的cDNA（登录号NM007375）在质粒pENTR-221中的表达是从Invitrogen获得的。添加通过PCR获得TDP-43 5′末端的Myc表位标签，使用引物5′-AAGCTTTGATGGAAAAAAAACTCTCCGGAGAGGATCTCTGTATATATTCGGGTAAACC-3′和5′-TCTAGAGCTACTATTCCCCAGCCAGAAGACTTAGA-3′。PCR产物为克隆到pGEM-T载体中（美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加）。以下顺序分析后，将PCR产物亚克隆到pcDNA 3.1质粒中（Invitrogen）使用限制性位点HindIII和XbaI，创建pcDNA3.1/Myc-TDP-43。编码小鼠最长亚型的N末端FLAG标记cDNATDP-43（pEFFLAG-TDP-43-L；注册号AY 145556）作者：C.K.Shen博士（中国科学院，台湾台北）。定点突变（见下文）使用质粒pcDNA 3.1/Myc-TDP-43（用于人类TDP-43）和pEFFLAG-TDP-43-L（用于鼠标TDP-43的）作为模板。N端子绿色荧光蛋白标记的TDP-43（GFP-TDP-43-WT）通过亚克隆产生到增强型GFP（EGFP）-C1载体中（Clontech，Mountain View，CA）。

TDP-43的定点突变-站点定向诱变（QuikChange试剂盒；Stratagene，La Jolla，CA）用于创建集合当前研究的错义突变（ΔNLS1，K82A/R83A/K84A；ΔNLS2、K95A/K97A/R98A；ΔNLS1/2、K82A/R83A/K84A/K95A/K97A/R98A；ΔNES1，I239A/L243A；ΔNES2，L248A/I249A/I250A）。的序列突变的寡核苷酸如下：ΔNLS1，5′-CAACTATCAAAAAGATAACGCAGCAATGGAGACAGC-3′；ΔNLS2，5′-GCTTCATCAGCAGTGGCAGCGTCCAGAAAAACATCC-3′；ΔNES1，5′-GCAGATGATCAGGCTGCAGTCTTGTGGAGAGGAC-3′；ΔNES2，5′-CTTTGTGGAGAGGACGCGGCTAAAGGAATCAGC-3′。所有构造都是进行序列分析，每个突变的位置如图3B类。

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TDP-43的表达-ΔNLS突变体导致隔离内源性核TDP-43。 A类，TDP-43免疫组织化学FTLD-U脑海马切片。核TDP-43清单(箭头)在含有胞质TDP-43内含物的神经元中与正常神经元（asterics）比较。B类，示意图N-末端Myc-tagged TDP-43蛋白突显二分体的位置NLS和NES。两组基本aa(红色)在NLS中突变为产生三个缺陷突变体（ΔNLS1、ΔNLS2和ΔNLS1/2）和两组疏水aa(蓝色)在NES中突变产生ΔNES1和ΔNES2。C-K公司，双重标签TDP-43的(红色)、Myc(绿色)，并使用DAPI进行复染(蓝色)用于原子核。C-E公司，72小时后QBI-293细胞Myc-TDP-43-WT转染(重量)和合并图像(E类)显示TDP-43和Myc在转染细胞核中的共定位细胞。F-H（飞行高度），QBI-293细胞转染后24小时Myc-TDP-43-ΔNLS1（ΔNLS2）。这个合并的图像(H（H）)显示TDP-43和Myc在转染细胞的细胞质中共定位。I-K公司ΔNLS1转染后72 h，QBI-293细胞。这个合并的图像(K（K）)显示TDP-43和Myc在转染细胞的细胞质。注意内源性细胞核的清除与未转染细胞相比，表达NLS1的细胞中的TDP-43。比例尺，25微米。*，未转染细胞。

抗体-本研究中使用的商业抗体如下如下：兔抗TDP-43多克隆抗体提高到氨基酸（aa）1-260（蛋白科技集团，伊利诺伊州芝加哥），人特异性鼠单克隆将抗体（mAb）提升至相同的TDP-43序列（2E2-D3）（Abnova，台北，台湾），抗MAP2单克隆抗体（AP14）(14)、抗Myc单克隆抗体（9E10；Santa Cruz Biotechnology，Inc.，加利福尼亚州圣克鲁斯）以及反FLAG和抗α-微管蛋白单克隆抗体（Sigma）。抗异质核核糖核蛋白A1单抗（4B10）和抗异质核核糖核蛋白C1/C2单抗（4 F4）是G.Dreyfuss博士慷慨的礼物((15). 两个多克隆抗体由免疫兔子产生（Covance研究产品宾夕法尼亚州丹佛市）。第一种是N末端特异性抗体的升高与人类TDP-43 N末端附近的合成肽相对应氨基酸残基6-24。另一个是C端特定的TDP-43针对极端C末端合成肽的抗体，对应人类氨基酸残基394-414TDP-43。三

细胞培养和转染-QBI-293细胞在添加10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle's培养基，1%青霉素/链霉素，1%我-谷氨酸。tsBN2细胞，a玛丽·达索博士（贝塞斯达国立卫生研究院，MD），保持在33°C（允许温度）或39.5°C添加Dulbecco改良Eagle培养基的（非允许温度）含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素和1%我-如上所述的谷氨酸(16). 原代培养物从胚胎第17天C57/Bl6小鼠制备小鼠海马神经元，作为前面描述过(17).简单地说，分离的细胞以50000-100000的密度进行电镀细胞/厘米2在聚乙烯中-我-赖氨酸玻璃底培养皿（MatTak，Ashland，MA），并在补充有B-27（Invitrogen）和0.5米百万升-谷氨酸。QBI-293细胞使用Amaxa Nucleofector（Amaxa Inc.，Gaithersburg，MD）系统转染和Lipofectamine 2000（Invitrogen），根据制造商的说明。使用Lipofectamine 2000转染初级神经元5-7天（Invitrogen）在体外根据制造商的说明。在一些实验中，用50μ米钩端霉素B(18)（西格玛）16小时。

免疫荧光研究-细胞固定在4%用0.02或0.2%渗透的磷酸盐缓冲盐水中的多聚甲醛Triton X-100（Sigma）在磷酸盐缓冲盐水中浸泡10分钟，用5%封闭奶粉在磷酸盐缓冲盐水中放置2小时，并孵育过夜在4°C下使用一级抗体。初级抗体用与Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 594缀合的第二抗体（Vector Laboratories，Burlingame，CA），使用DAPI检测细胞核。收件人证明存在TDP-43聚集体，用0.2%提取细胞固定之前，Triton X-100清除TDP-43的洗涤剂-可溶性池。使用尼康TE-2000-E（日本东京尼康）对所有细胞进行分析这些图像是使用CoolSnap-HQ相机拍摄的（Photometrics，亚利桑那州Tuscon）。所有显微照片均显示单个细胞代表整个细胞人口。FTLD-U患者组织切片的免疫组织化学研究如前所述进行兔抗TDP-43抗体(4).

溶解度和生化分析-要检查TDP-43的溶解度分布，进行连续提取。细胞用磷酸盐缓冲盐水洗涤两次，在冷RIPA缓冲液中溶解，和声波。细胞裂解物通过10万倍离心进行清除克在4°C下保持30分钟，以生成RIPA可溶样品。收件人为了防止残留，将产生的颗粒清洗两次(即重新隔离和重新离心）。只有第一次的上清液离心分析。然后用尿素缓冲液（7米尿素，2米硫脲，4%CHAPS，30米米Tris，pH 8.5），超声处理，并在100000×克在22°C下保持30分钟。所有患者都添加了蛋白酶抑制剂使用前的缓冲器（1 m米PMSF和蛋白酶混合物抑制剂）。蛋白质浓度由双钦酸测定方法（Pierce），用10%SDS-PAGE将蛋白质分解并转移到硝化纤维膜。转移后，硝化纤维素膜封闭在5%奶粉中，在4时在一级抗体中培养过夜摄氏度。用辣根检测一级抗体过氧化物结合二级抗体（Jackson ImmunoResearch，WestGrove，PA）和印迹是用Renaissance Enhanced Luminol开发的试剂（PerkinElmer Life Sciences）。数字图像是使用富士胶片智能暗箱II（富士系统，斯坦福德，康涅狄格州）。

免疫沉淀-转染细胞和非转染细胞在尿素缓冲液中如上所述进行溶解，然后在50中稀释10倍米米Tris，pH 8.0，含1%Triton X-100。裂解物为预吸收蛋白质A/G-琼脂糖（圣克鲁斯生物技术）和与蛋白质结合的多克隆TDP-43抗体免疫沉淀A/G-琼脂糖。免疫沉淀蛋白用SDS样品缓冲液洗脱（10米米Tris，pH 6.8，1 m米EDTA，40米米二硫苏糖醇、1%十二烷基硫酸钠和10%蔗糖），用10%十二烷基硫酸铵-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，以及如前所述通过免疫印迹分析(4).

结果

TDP-43在神经元和非神经元细胞中普遍表达在多种物种的大脑中(例如大鼠、小鼠和人类）(图1A类). 尽管TDP-43主要定位于非神经元细胞的细胞核（QBI-293）和初级海马神经元(图。1B类)，细胞质中存在低水平的TDP-43。用0.02%Triton X-100预处理细胞，使血浆渗透膜而不是核膜(19)，已启用检测细胞质TDP-43(图。1C类).

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TDP-43表达的细胞生物学。 A类，免疫印迹分析未分化（NT2-）和维甲酸诱导分化神经元（NT2N）人畸胎瘤细胞；未分化（PC12）和神经生长因子处理的分化神经（dPC12）大鼠嗜铬细胞瘤细胞；小鼠神经母细胞瘤（Neuro2a）细胞；人胚胎肾（QBI-293）细胞；和Sarkosyl提取的裂解物来自人类大脑(顶部)和分离自皮层(Ctx公司)和海马(臀部)(底部).甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH公司)被用作装载控制(底部). 无甘油醛-3-磷酸脱氢酶由于之前使用不太严格的缓冲区进行提取。B类，免疫荧光QBI-293细胞内源性TDP-43的检测(红色)、DAPI(蓝色)、和合并的图像(顶部)和初级小鼠海马神经元(底部). 此外，MAP2(绿色在中合并的图像)用于标记神经元胞体周和树突。比例尺，20微米。C类，细胞质检测（用0.02%Triton X-100渗透；顶部)或总计（渗透0.2%Triton®声波风廓线仪X-100；底部)TDP-43型(绿色),β-微管蛋白(红色)，并将图像合并到QBI-293细胞中。

为了确定TDP-43是否从细胞质转移到细胞核，我们使用了BHK21衍生细胞系（tsBN2），该细胞系具有温度敏感性点突变RCC1（染色体凝集调节因子1）基因(16,20,21). 在允许的情况下温度（33°C），tsBN2细胞功能正常，但在非容许温度（39.5°C），RCC1迅速失去它的核Ran-GTP重新分布到细胞质，因此，核蛋白进口受阻。在33°C时，内源性定位于细胞核的TDP-43(图2，A类和B类). 然而，在非许可温度为39.5°C时，胞质中检测到内源性TDP-43核TDP-43的清除和标点符号的形成细胞质聚集体(图2，C类和D类). 这是tsBN2细胞特有的，因为没有在QBI-293细胞中观察到TDP-43的核定位改变培养温度为33或39.5°C（数据未显示）。因此，抑制TDP-43转位到细胞核导致TDP-43作为细胞质聚集体。

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TDP-43在温度敏感的细胞质中的表达和积累BN2细胞。 A类和B类，内源性TDP-43(红色)曾经在33°C（允许温度）下，在tsBN2细胞的细胞核中检测到。这个合并图像(B类)TDP-43的(红色)和原子核染色DAPI(蓝色)确认TDP-43位于细胞核中。C类和D类，在非许可温度（39.5°C）下，TDP-43(红色)被检测为点状细胞质聚集体(箭头)清除核TDP-43(*)并且做到了不与DAPI协同定位(蓝色)在tsBN2细胞中。D、 合并的图像。比例尺，20微米。

FTLD-U死后大脑和脊髓切片的先前研究ALS病例显示，核TDP-43在具有TDP-43细胞质聚集体(4,14,15)(图3A类). 检查如果这些聚集物的形成导致核TDP-43的隔离在细胞质中，我们建立了一个细胞模型来研究细胞核TDP-43连接到细胞质。我们确定了一个特定的二方NLS顺序(即两簇碱基残基被拉伸分开9-12个残基），位于人类和小鼠的aa残基82-98TDP-43，预计用于核靶向(图3B类). 收件人证明TDP-43进入核，产生三个缺陷的ΔNLS突变体：1）ΔNLS1，碱性aa-Lys-Arg-Lys（残基82-84）突变为Ala-Ala-Ala；2） ΔNLS2，碱性aa-Lys（残基95）和Lys-Arg（残基97和98）突变为Ala；3)ΔNLS1/2，ΔNLSI和ΔNLS2均突变为Ala(图3B类). WT-TDP-43型TDP-43突变体被N末端Myc-tagged（指定为Myc-TDP-43-WT和Myc-TDP-43-NLS），以便于识别转基因独立于内源性蛋白质。

Myc-TDP-43-WT瞬时转染QBI-293细胞显示完全24和72小时与内源性TDP-43共定位(图3，C-E公司). 由相反，所有Myc-TDP-43-ΔNLS突变体的转染导致细胞质表达（图。三，F-H（飞行高度）和S2），确认基本特定二部分NLS序列中的残基会损害核靶向性TDP-43。三种Myc-TDP-43-ΔNLS的细胞质定位相似当观察到突变体以及未标记的TDP-43-ΔNLS突变体时在HeLa、中国仓鼠卵巢或Neuro 2a细胞中表达如图所示）。

虽然内源性TDP-43在QBI-293细胞的细胞核中可检测到用TDP-43-ΔNLS突变体转染24小时后（图。三，F-H（飞行高度）和S1，A-C公司和G-I型)之后，它几乎从细胞核中消失了72小时（图。三，I-K,和S1，D-F公司和J-L公司). 为了进一步调查，我们与Myc-TDP-43-WT或Myc-TDP-43-ΔNLS1。GFP-TDP-43-WT与Myc-TDP-43-WT公司(图4，A类-C类)当24小时与Myc-TDP-43-ΔNLS1共表达(图4，D-F公司).然而，转染72小时后，GFP-TDP-43-WT转移到细胞质和转染72小时后与Myc-TDP-43-ΔNLS1共定位，从而确认TDP-43-ΔNLS对WT贩运的异常影响细胞核和细胞质之间的内源性TDP-43(图4，G-L公司).

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人和小鼠TDP-43的细胞质表达-Δ荷兰统计局导致TDP-43的核清除。 A-C公司，QBI-293细胞72小时GFP-TDP-43-WT和Myc-TDP-43-VT的后转染。GFP和TDP-43(红色)仅在转染细胞的细胞核中检测到。D-L公司，QBI-293细胞24小时(D-F公司)或72小时(G-I型)用GFP-TDP-43-WT和ΔNLS1进行后转染。GFP-TDP-43-WT是仅局限于核(绿色)、和合并形象(如果)未显示Myc-TDP-43-WT的共定位(红色)和GFP(绿色)转染后24h细胞质内。用DAPI标记Nuclei(蓝色).G-L公司，72小时转染后，在细胞质中检测到GFP-TDP-43-WT并共定位带有ΔNLS1(I-L公司). 注意点状同位化(黄色的)ΔNLS1和GFP-TDP-43-WT在转染细胞。移动运营商，QBI-293细胞转染后72小时鼠标FLAG-TDP-43-mWT(毫瓦特)并用人性化的双重标签鼠抗TDP-43(绿色)和兔抗FLAG抗体(红色)带有合并图像(O（运行）)显示的表达式转染细胞细胞核内的内源性人类TDP-43和FLAG-TDP-43-mWT。注意细胞内内源性人类细胞核TDP-43水平下降与未转染细胞相比，表达FLAG-TDP-43-mWT(*).P-R公司小鼠转染后72 h，QBI-293细胞襟翼-TDP-43-ΔNLS1/2（ΔmNLS1/2型). 这个合并的图像(对)显示内源性人类TDP-43的存在(绿色)和FLAG-TDP-43-ΔNLS1/2(红色)在转染细胞的细胞质中细胞。注意，细胞内内源性人类细胞核TDP-43被清除表达FLAG-TDP-43-ΔNLS1/2(箭头)与相比未转染细胞(*).比例尺，20微米。

进一步证明内源性细胞核的细胞质隔离TDP-43通过TDP-43-ΔNLS突变体，我们表达了FLAG标记的小鼠TDP-43QBI-293细胞中出现ΔNLS1/2突变（FLAG-TDP-43-ΔmNLS1/2）并使用人特异性TDP-43抗体(图4，M-R公司). 因此，QBI-293细胞中TDP-43的核耗竭概述了携带TDP-43的细胞中该蛋白的核清除ALS和FTLD-U患者的细胞质内含物(图3A类). 这个核清除是针对TDP-43的，因为其分布没有变化其他核蛋白，如异质核核糖核蛋白A1观察到异质核核糖核蛋白C1/C2（图。S2）。

内源性TDP-43的再分配和固存在转染Myc-TDP-43-WT或Myc-TDP-43-ΔNLS1。虽然Myc-TDP-43-WT定位于细胞核(图5，A-C公司),Myc-TDP-43-ΔNLS1转染导致细胞质和轴突Myc-TDP-43的积累(图5，D-F公司). 这与清除内源性核TDP-43(图5，G-I型)和TDP-43的神经炎聚集物(图5J型)这表明FTLD-U疾病神经元中TDP-43病理的显著逼真性例（图。​（图3A类三A类和​和5K（K）)5K（K）)(22).

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TDP-43的表达-ΔNLS突变体导致聚集神经元胞体和轴突的形成。小鼠海马神经元转染WT(A-C公司)或ΔNLS1(D-F公司)TDP-43型构造。注意TDP-43和Myc在细胞核中的共定位(A-C公司)和索玛(D-F公司)神经元的数量。G-I型，更高表达ΔNLS1的神经元放大。这个合并图像(J型)显示TDP-43和Myc在转染神经元。注意内源性核TDP-43的清除一、。J型，轴突的高倍图像如果标记为星罗棋布的箱TDP-43在表达ΔNLS1(箭头)类似于在FTLD-U大脑(K（K）).K（K）神经炎病理的免疫染色(箭头)来自FTLD-U大脑的额叶皮层。比例酒吧，20微米。

接下来，我们询问Myc-TDP-43-ΔNLS突变体的表达和内源性TDP-43的固存导致不溶物的形成由这两种蛋白质组成的聚集体。免疫印迹分析对转染Myc-TDP-43-WT或Myc-TDP-43-ΔNLS突变体的细胞在转染后24和72小时收获，并用RIPA和尿素缓冲液。内源性和Myc-TDP-43-WT均被恢复仅在RIPA部分(图。6A类). 由于Myc-TDP-43的迁移速度慢于内源性TDP-43分别在免疫印迹中检测。虽然相对较低在24和72小时检测核Myc-TDP-43-WT水平转染后，三种Myc-TDP-43-ΔNLS的细胞质表达突变体在24小时时很健壮，导致部分积累尿素组分中的突变蛋白(图。6A类). 此外，较深的免疫印迹显示一种高潮的存在M（M）第页涂片和C末端碎片在类似泛素化TDP-43高的尿素组分中M（M）第页涂片和C末端片段FTLD-U和ALS病例(4,14,15). N端截断这些细胞中的TDP-43是通过使用对TDP-43的N端和C端（图S3）。转染后72小时，内源性尿素馏分中也检测到TDP-43以及Myc-TDP-43-ΔNLS突变体，与内源性不溶性部分中的核TDP-43(图6B类). 再一次，很高M（M）第页72小时后也检测到涂片和C末端片段转染后。

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Myc-TDP-43的表达-ΔNLS突变体导致泛素化和不溶性内源性TDP-43的螯合。QBI-293型细胞24小时(A类)，或72小时(B类)空转染后向量(CTRL键)，Myc-TDP-43-WT(重量)，Myc-TDP-43-ΔNLS1(ΔNLS1（荷兰标准1）)，Myc-TDP-43-ΔNLS2（ΔNLS2型)，或Myc-TDP-43-ΔNLS1/2（ΔNLS1/2型)按顺序提取RIPA公司(对)和尿素缓冲液(U型). 进行免疫印迹带有TDP-43抗体。Myc-TDP-43型(Myc公司)迁移速度慢于内源性TDP-43(Endo公司). 免疫印迹过度暴露表明存在高M（M）第页涂抹(**)和C末端碎片(*)尿素馏分中Myc-TDP-43-NLS突变体在转染细胞中的表达。α-微管蛋白被用作装载控制。C类，免疫印迹(IB公司)免疫沉淀的(IP（IP）)与空载体共转染的QBI-293细胞裂解物，Myc-TDP-43-WT或Myc-TDP-43-ΔNLS1/2和HA-标记泛素(HA-Ub型)当面(+拉丁美洲和加勒比海)或缺乏LAC。请注意存在LAC依赖的泛素化TDP-43阳性高-M（M）第页拖尾和TDP-43 C-末端片段。

明确证明病理性TDP-43M（M）第页涂片无处不在，是蛋白酶体的底物降解，Myc-TDP-43-WT或Myc-TDP-43-ΔNLS1/2与HA-标记泛素，并与乳酸菌素（LAC）孵育或不与LAC孵育，a蛋白酶体抑制剂。用TDP-43免疫沉淀细胞裂解物抗体和抗HA抗体免疫印迹显示阶梯状和高M（M）第页泛素化TDP-43物种涂片LAC处理提高了其丰度(图6C类). 内源性当仅转染HA-标记的细胞时，TDP-43也泛素化泛素结构用LAC处理，表明正常的TDP-43是被蛋白酶体降解。最后，可视化不溶物的存在TDP-43-ΔNLS1表达细胞在细胞质中聚集用0.2%Triton X-100提取，双色免疫荧光显示点状细胞质聚集体（图S4）。因此，多重互补这些方法使我们能够证明细胞溶质TDP-43的增加通过在细胞质中直接表达或取消核输入核TDP-43在细胞质中的不溶性固存在FLTD-U和等。

由于TDP-43也在FTLD-U和ALS中积聚为核内包裹体，我们问，核TDP-43通过限制其出口而引起的扰动是否会导致不溶性TDP-43核包裹体的形成。QBI-293的处理含有钩端霉素B（LMB）的细胞，a链霉菌spp.代谢产物特别禁止依赖NES的核出口(18)，导致内源性核TDP-43的重排和诱导小分子的形成点状TDP-43核包裹体(图7，A-D公司). 这与LMB处理但未处理的尿素可溶解但RIPA-不可溶解的内源性TDP-43未经处理的细胞(图。7E类).

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TDP-43通过限制核出口。 A-D公司，内源性TDP-43的免疫荧光(红色)独自一人(A类和C类)或合并(B类和D类)带DAPI(蓝色)DMSO处理的QBI-293细胞车辆(CTRL键)(A类和B类)或LMB(+LMB公司)(C类和D类). 这个箭头识别标点符号核包裹体C.E公司，用二甲基亚砜处理QBI-293细胞车辆或LMB，并用RIPA顺序提取(对)和尿素缓冲器(U型). 用抗TDP-43抗体进行免疫印迹。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH公司)被用作装载控制。F-K公司，使用TDP43进行双重标记(红色)、Myc(绿色)抗体和DAPI(蓝色). QBI-293细胞24小时(F-H（飞行高度）)和72小时(I-K公司)转染后Myc-TDP-43-ΔNES2（ΔNES2公司)和合并图像(H（H）和K（K）)显示TDP-43的共定位(红色)和Myc公司(绿色)在转染细胞的细胞核中。注意是否存在转染细胞24h和72h细胞核内点状内含物。未转染细胞标记有星号。L（左）和M（M）,QBI-293细胞24小时(L（左）)或72小时(M（M）)转染后空向量(CTRL键)，Myc-TDP-43-WT(重量)，或Myc-TDP-43-ΔNES2（ΔNES2公司)并按顺序提取RIPA公司(对)和尿素缓冲液(U型). 进行免疫印迹带有TDP-43抗体。Myc-TDP-43型(Myc公司)迁移速度慢于内源性TDP-43(Endo公司)以及Myc-TDP-43-ΔNES2和内源性TDP-43在RIPA不溶物和尿素溶物中被回收分数。甘油醛-3-磷酸脱氢酶被用作负载物控件。比例尺，20微米。

为了进一步证明增加的核TDP-43导致形成不溶性核聚集体，我们使用生物信息学来鉴定人类TDP-43中aa 239-250处富含亮氨酸的NES(图3B类)然后确定从以下位置导出TDP-43时是否需要此预测的NES序列原子核。两个具有缺陷NES的N末端Myc-tagged TDP-43突变体产生了以下序列：1）ΔNES1、疏水性aa Leu（残基239）和Ile（残基243）突变为Ala；2） ΔNES2，疏水性aa Leu-Ile-Ile（残基248-250）突变为Ala-Ala-Ala(图3B类). 尽管表达的Myc-TDP-43-ΔNES定位于细胞核，细颗粒24岁时在一组转染细胞中检测到核内包涵体和72小时(图7，F-K公司). 免疫印迹分析证实存在由内源性TDP-43和由于Myc-TDP-43-ΔNES和内源性TDP-43在24小时和72小时从尿素组分中回收蛋白质转染后(图7，L（左）和M（M）). 因此，这些数据表明TDP-43核输出序列导致不溶核聚集体的形成同时含有突变和内源性TDP-43。

讨论

在这项研究中，使用了多种方法来证明TDP-43核贩运和定位导致不溶物的形成概括了病理性TDP-43内含物特征的聚集物人类FTLD-U/ALS病例。首先，内源性TDP-43的干扰分布导致细胞质中TDP-43聚集体的形成和细胞核。第二，TDP-43在细胞质或细胞核还导致细胞质中形成不溶性聚集体分别是细胞核。第三，不溶性TDP-43泛素化N端截断。最后，内源性TDP-43被隔离在细胞质和核聚集体。因此，这些数据和其他数据支持TDP-43贩运微妙平衡的扰动假设细胞核和细胞质之间可以导致TDP-43聚集体的形成概述了FTLD-U和ALS的TDP-43特征性病变的特征。

突变研究证实存在功能性NES和NLS由于TDP-43中突变NES和NLS的表达，TDP-43的序列限制其分别分布在细胞核和细胞质中。我们发现NLS序列中的两个基本基序是独立的需要将TDP-43导入核心，因为基本两个基序中的残基导致其在细胞质中积累。同样，NES序列中的两个疏水基序也是独立的TDP-43导出需要，因为修改任一基序都会阻止其退出细胞质。此外，TDP-43-ΔNES的表达导致由内源性和突变体组成的核内含物的形成蛋白质。

在生理条件下，TDP-43在细胞质，但NLS突变体的表达导致内源性细胞质聚集体中的TDP-43可能通过阻止新的合成的TDP-43被导入核和/或通过抑制现有细胞质TDP-43重新进入细胞核。

此外，胞质TDP-43聚集体的积累也概述了FTLD-U中病理性TDP-43的生化特征ALS，包括高M（M）第页泛素化TDP-43和C端TDP-43碎片。目前，尚不清楚这种解理是否发生在细胞核或细胞质中，但很容易推测TDP-43C-末端片段作为聚集和隔离TDP-43进入细胞核和/或细胞质内含物。此外，由于大多数TDP-43内含物是细胞质的，有可能增加从细胞核到细胞质的全长TDP-43可以通过其他导致细胞质TDP-43积聚的致病机制骨料。

由于TDP-43的细胞功能目前尚不清楚，更深入地了解TDP-43的细胞生物学以及致病条件，需要进一步了解这一点新发现的神经退行性蛋白病及其研究进展对这些疾病的有效治疗。为此，此处报告的数据重要的是，它们牵涉到异常的核贩运和TDP-43在FTLD-U和ALS机制中的溶解度改变。

补充材料

[补充数据]

致谢

我们感谢C.Li的技术援助。

笔记

*这项工作得到了National的全部或部分支持卫生拨款研究所AG17586和AG10124。成本本文出版费用的一部分由支付页数支付收费。因此，必须在此标记此物品“广告“根据《美国法典》第18卷第1734节只是为了表明这一事实。

本文的在线版本（可在http://www.jbc.org)包含补充图S1-S4。

脚注

2使用的缩写是：FTLD，额颞叶变性；含泛素阳性内含物的FTLD-U、FTLD；肌萎缩侧索硬化硬化；乳酸链球菌素；LMB，钩端霉素B；NES，核出口信号；NLS，核定位信号；绿色荧光蛋白；aa，氨基酸；单克隆抗体；DAPI，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚；放射免疫沉淀；皮套裤，3-[（3-胆酰胺丙基）二甲基氨]-1-丙磺酸；哈，血凝素。

三L.M.Igaz、L.K.Kwong、Y.Xu、A.C.Truax、K.Uryu、M.Neumann、C.M。克拉克、L.B.埃尔曼、B.L.米勒、M.格罗斯曼、L.F.麦克卢斯基、J.Q。特洛伊亚诺夫斯基和V.M.-Y.李提交出版。

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文章来自生物化学杂志由提供美国生物化学和分子生物学学会