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自然细胞生物学。作者手稿；PMC 2008年10月1日提供。
以最终编辑形式发布为：
自然细胞生物学。2007年10月；9(10): 1142–1151.
2007年9月23日在线发布。 数字对象标识：10.1038/ncb1634
预防性维修识别码：PMC2254521型
NIHMSID公司：NIHMS40063标准
PMID：17891140

Bif-1通过UVRAG与Beclin 1相互作用并调节自噬和肿瘤发生

高桥吉诺里,1 多梅尼科·科波拉,1 松下诺丽莎,1 埃尔尼·D·库灵,1 孙美儿,1 佐藤裕雅,1 华裔科学家梁澄玉,2 Jae U.Jung先生,2 程金秋（Jin Q.Cheng）,1 詹姆斯·穆雷,1 W.Jack抵押人,1和王洪刚1
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

自噬是一个进化上保守的“自噬”过程。虽然在酵母中已鉴定出自噬所必需的基因（称为Atg），但这些Atg蛋白如何控制哺乳动物细胞中自噬体形成的分子机制仍有待阐明。在此，我们证明Bif-1（也称为内皮素B1）通过UVRAG与Beclin 1相互作用，并充当III类PI3-激酶（PI3KC3）的阳性介质。为了应对营养缺乏，Bif-1定位于自噬体，在那里它与Atg5以及LC3共定位。此外，Bif-1的丢失抑制了自噬体的形成。虽然Bif-1的SH3结构域足以与UVRAG结合，但Bif-1激活PI3KC3并诱导自噬体形成需要BAR和SH3结构区。我们还发现，Bif-1消融可以延长营养缺乏条件下的细胞存活时间。此外，Bif-1基因敲除显著促进小鼠自发肿瘤的发展。这些发现表明，Bif-1作为自噬和肿瘤抑制的潜在激活剂加入UVRAG-Beclin-1复合物。

自噬是细胞质蛋白质或细胞器大量降解的一个紧密协调的细胞内过程，似乎对许多生理过程至关重要，例如细胞内环境稳定、发育、分化、组织重塑、细胞生存和死亡、先天免疫和各种生物体的发病机制1-4当一部分细胞溶质成分被隔离在称为隔离膜的杯状膜结构中时，自噬降解过程开始1,2,5,6分离膜被拉长并最终被密封，形成称为自噬体的双膜囊泡，然后与溶酶体融合，导致封闭的成分降解。18个自噬相关（Atg）基因在酿酒酵母可分为四个功能群：（1）调节自噬诱导的Atg1蛋白激酶复合物，（2）控制囊泡成核的III类PI3-激酶（PI3KC3）脂质激酶复合物；（3）用于囊泡扩张和完成的Atg12-Atg5和Atg8-磷脂酰乙醇胺结合途径，以及（4）Atg蛋白检索系统2,7Beclin 1是酵母Atg6的哺乳动物同源物，是PI3KC3复合体的关键成分，在自噬体形成中起着重要作用8-11虽然PI3KC3产生的磷脂酰肌醇3-磷酸（PtdIns-3-P）被认为可以控制自噬体形成过程中的膜动力学三，这一过程的分子机制尚不清楚。

亲内素是包含N端N-BAR（Bin-Anphiphysin-Rvs）结构域和C端SH3（Src-同源3）结构域的细胞溶质蛋白。已证明N-BAR域与膜结合并驱动膜弯曲12-14.内切酶可分为两类，内切酶A家族和内切酶B家族15.内啡肽A家族特征鲜明；这类蛋白质在裂变阶段参与内体的形成15相比之下，内切酶B蛋白家族的生理功能还不完全清楚。Bif-1，也称为SH3GLB1或内皮素B1，最初是作为Bax结合蛋白发现的16,17尽管Bif-1具有脂质体微管活性在体外，似乎该蛋白不定位于转铁蛋白阳性的内体18最近的研究表明，Bif-1与细胞内细胞器的膜有关，如高尔基体18,19和线粒体20,21，并与囊泡形成和膜动力学有关。在这里，我们表明Bif-1通过UVRAG与Beclin 1形成复合物，并调节自噬体的形成。

结果

Bif-1缺失抑制半胱天冬酶非依赖性细胞死亡

我们以前曾报道过Bif-1定位于线粒体，并在内在死亡刺激诱导的细胞凋亡过程中调节Bax和Bak的激活21为了检测血清剥夺期间小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中Bif-1的定位，我们添加了胰蛋白酶抑制剂z-VAD-fmk，以防止凋亡诱导的细胞分离。令人惊讶的是，我们发现z-VAD-fmk不能阻止，而是增强了血清剥夺诱导的野生型MEF细胞死亡，这表明当细胞凋亡被阻断时，caspase非依赖性途径调节细胞死亡（参见补充信息，图S1a). 事实上，已有研究表明，通过caspase抑制剂治疗抑制细胞凋亡（I型程序性细胞死亡（PCD））会触发L929成纤维细胞的II型PCD，也称为自噬细胞死亡22用足叶乙甙治疗时，在缺乏促凋亡Bax和Bak蛋白的MEF细胞中也观察到类似的细胞死亡23有趣的是，添加z-VAD-fmk对双歧杆菌-1-/-MEF（参见补充信息，图S1a)这表明Bif-1可能与II型PCD有关。

为了检测Bif-1是否参与自噬依赖性细胞死亡，自发永生双歧杆菌-1+/+和-/-MEF21在不含氨基酸和生长因子的Earl’s Balanced Salt Solution（EBSS）培养基中培养。如所示图1a,双歧杆菌-1-/-EBSS培养后，细胞表现出对台盼蓝染色的抵抗力，这表明Bif-1的丢失可以保护细胞在营养缺乏期间免于死亡。克隆存活率证实了这一点（参见补充信息，图S1b)，MTT（参见补充信息，图S1c)和LDH释放（数据未显示）分析。使用稳定转染了抗Bif-1 shRNA的HeLa细胞也获得了类似的结果（参见补充信息，图S1d). 抑制细胞死亡双歧杆菌-1-/-细胞因Bif-1表达的恢复而减少(图1b). 为了进一步确定这种细胞死亡是否依赖caspase，我们用z-VAD-fmk处理细胞。添加z-VAD-fmk对野生型细胞的死亡没有影响(图1c)表明MEF在营养饥饿后可以独立于caspase活性进行细胞死亡。相反，caspase抑制剂显著抑制Bif-1型-/-MEF公司(图1c)表明观察到的细胞死亡双歧杆菌-1-缺陷细胞具有凋亡依赖性。Bax和Bak双敲除MEF进一步证实了MEF在饥饿条件下进行caspase非依赖性细胞死亡的能力(图1d)对多种死亡刺激诱导的细胞凋亡具有抵抗力24.

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Bif-1缺失可抑制营养剥夺诱导的半胱氨酸蛋白酶非依赖性细胞死亡。在指定的时间点，通过台盼蓝排除试验测定死亡细胞的百分比（平均值±标准差。；n个= 3). (一)双歧杆菌-1+/+（WT）和-/-（KO）MEF在EBSS中培养0、3、6或12小时(b条)双歧杆菌-1用Bif-1表达质粒或对照空载体稳定转染的KO MEF在EBSS中孵育0或12小时双歧杆菌-1通过免疫印迹分析（inset）检测KO细胞。(c（c）)Bif-1型WT和KO MEF在EBSS中在50μM z-VAD-fmk或对照DMSO存在下培养0、3、6或12小时(d日)Bax公司+/+贝克+/+（重量）和Bax公司-/-贝克-/-（DKO）MEF在EBSS中在50μM z-VAD-fmk或对照DMSO存在下培养0、6或12小时。

半胱天冬酶非依赖性细胞死亡需要自噬

为了确定营养饥饿诱导的细胞死亡是否需要自噬，我们通过沉默Atg基因或用PI3KC3抑制剂处理细胞来抑制自噬。我们发现，敲除Beclin 1可以抑制饥饿诱导的细胞死亡(图2a、b). 值得注意的是，在EBSS中培养12小时后，与野生型细胞相比，Bax和Bak双敲除MEF中Beclin 1 shRNA减少的细胞死亡要大得多(图2b)这表明，在饥饿条件下，当细胞凋亡被阻断时，自噬是主要的细胞死亡机制。类似地，通过3-甲基腺嘌呤（3-MA）或沃特曼（WM）治疗对自噬的药物抑制显著降低了野生型MEF中EBSS诱导的细胞死亡(图2c). 相反，抑制自噬对双歧杆菌-1-/-MEF细胞(图2a、c). 与以往研究一致25，通过抑制自噬促进caspase-3的激活(图2d并查看补充信息，图S2a)尽管观察到细胞死亡减少，但表明自噬的启动抑制了细胞凋亡，同时激活了caspase非依赖性的细胞死亡途径。为了证实这一发现，我们接下来检测了特征明确、自噬缺陷的Atg5敲除MEF中的细胞死亡和caspase-3激活26一贯地，尽管caspase-3活性增强，但自噬损伤通过Atg5的丢失抑制了EBSS诱导的细胞死亡(图2e、f).

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抑制自噬可增强caspase-3的激活，但抑制caspase-非依赖性细胞死亡。(a、 b条)双歧杆菌-1WT和KO MEF或Bax公司/贝克WT和DKO MEF感染shBECN1或控制shSCR慢病毒。感染后24小时，用新鲜培养基替换培养基，让细胞再恢复48小时。然后将细胞在EBSS中培养0、6或12小时，并用台盼蓝排斥试验测定死亡细胞的百分比（平均值±s.d。；n个= 3). 通过免疫印迹分析（插图）确认Beclin 1表达下调。(c、 d日)双歧杆菌-1用10 mM 3-甲基腺嘌呤（3-MA）、0.2μM沃特曼（WM）或对照DMSO预处理WT和KO MEF 30 min，然后在EBSS中培养指定时间。用台盼蓝排除法测定死亡细胞百分比（平均值±标准差。；n个= 3). 免疫印迹分析检测LC3修饰和caspase-3激活。(e（电子）)附件5+/+和-/-MEFs在50μM z-VAD-fmk或对照DMSO存在下在EBSS中培养0、6或12h。死亡细胞百分比通过台盼蓝排斥试验测定（平均值±标准差。；n个= 3). (（f）)总细胞裂解物（TCL）由附件5+/+和在EBSS中培养指定时间并进行免疫印迹分析的-/-MEFs。免疫印迹的完整扫描显示一,b条,d日和（f）显示在补充信息，图S5.

Bif-1参与自噬

为了研究营养缺乏期间发生的细胞内事件，我们接下来通过电子显微镜对细胞进行了分析。EBSS中的孵化在野生型细胞的细胞质中诱导了大量自噬空泡(图3a). 然而，在缺乏Bif-1的细胞中，自噬体的数量显著减少(图3a)表明Bif-1参与自噬空泡的形成或处理。此外，缺乏Bif-1导致GFP-LC3融合蛋白点状病灶形成受到抑制(图3b)，这是一个特征鲜明的标记，用于可视化自噬体，并代表LC3的膜结合形式在自噬液泡上的积聚27通过沃特曼治疗抑制自噬减少了GFP-LC3阳性病灶的数量（参见补充信息，图S2b). 与对照细胞相比，稳定转染Bif-1 shRNA（shBif-1）的HeLa细胞也获得了类似的结果(图3e). shBif-1抗性Bif-1的表达，但不是Bif-1ΔBAR突变，恢复了Bif-1敲除细胞中GFP-LC3点状灶的形成(图3f)提示BAR结构域是Bif-1诱导自噬体形成所必需的。在自噬过程中，LC3从细胞溶质形式LC3-I转变为膜结合形式LC3-II27如果Bif-1参与自噬空泡的形成，我们推断LC3修饰应该被Bif-1的缺失所抑制。正如预期的那样，LC3-I到LC3-II的处理在双歧杆菌-1-/-营养饥饿后的MEF(图3c). 重要的是，这种延迟的LC3修饰双歧杆菌-1-/-通过恢复Bif-1的表达来恢复细胞(图3d). 值得注意的是，正常培养物中LC3-II的基础水平在双歧杆菌-1-/-MEF与野生型细胞的比较(图3c). 有趣的是，α-微管蛋白表达的减少在双歧杆菌-1-/-EBSS培养期间的细胞(图3c)这表明Bif-1的丢失也抑制了细胞蛋白的自噬降解。

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Bif-1缺失抑制自噬。(一)双歧杆菌-1WT和KO MEF在完全培养基（CM）或EBSS中培养3h，并通过透射电镜进行分析。箭头表示自噬体。计算每个横截面细胞的自噬体数量（平均值±s.d。；n个= 42). (b条)双歧杆菌-1用GFP-LC3转染WT和KO MEF，在EBSS或CM中培养3h，然后用荧光显微镜进行分析。比例尺指示10μm。计数每个GFP阳性细胞的GFP-LC3点的数量（平均值±标准差。；n个= 35). (c（c）)Bif-1 WT（W）和KO（K）MEF在EBSS中培养指定时间，并用抗LC3、α-微管蛋白和β-肌动蛋白抗体进行免疫印迹分析。(d日)双歧杆菌-1将稳定转染Bif-1表达质粒或对照空载体的KO MEF在EBSS中培养0、3或6 h，并进行免疫印迹分析。LC3的免疫印迹结果c（c）和d日被量化为LC3-II占总LC3（LC3-I+LC3-II）的百分比，并以条形图表示。(e（电子）)稳定表达shBif-1的克隆或转染GFP-LC3的对照HeLa细胞在CM或EBSS中培养2h，并通过荧光显微镜进行分析。定量每个GFP阳性细胞的GFP-LC3点数（平均值±标准差。；n个= 66). (（f）)将GFP-LC3与shBif-1耐药的Bif-1-HcRed、Bif-1ΔBAR-HcRed或空的Hc Red载体联合转染Bif-1敲低的HeLa细胞20 h。然后将细胞在EBSS或CM中培养2 h，并用荧光显微镜测定每个Hc red阳性细胞的GFP-LC3-点数（平均值±s.d。；n个= 35). 统计显著性一,b条,e（电子）和（f）通过Student t检验确定。免疫印迹的完整扫描显示c（c）,d日和e（电子）显示在补充信息，图S5.

Bif-1定位于自噬体膜

为了研究Bif-1在自噬调节中的作用，我们进行了免疫荧光分析，以确定Bif-1-HcRed与GFP-Atg5或GFP-LC3联合在细胞内的分布。与以前的报告一致27,28在营养缺乏后，GFP-Atg5和GFP-LC3在细胞质中均形成点状小点(图4a). 在营养丰富的条件下，Bif-1定位于胞浆，特别是在核周区域(图4a). 然而，在养分提取后，Bif-1与Atg5和LC3一起积聚在点状结构中(图4a并查看补充信息，图S3)表明Bif-1易位到自噬体膜。事实上，Bif-1的自噬体定位已被免疫金电子显微镜证实(图4b). Atg5在自噬体形成的整个伸长过程中都定位在隔离膜上，一旦自噬小体形成完成，Atg5就会从自噬膜上分离出来28值得注意的是，几乎所有GFP-Atg5点都是Bif-1-HcRed阳性(图4a)表明Bif-1参与自噬体形成的早期阶段。

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Bif-1定位于自噬体。(一)用Bif-1-HcRed和GFP-Atg5或GFP-LC3转染COS7细胞。转染后20小时，将细胞在EBSS或CM中培养2小时，并进行共聚焦显微镜分析。放大后的图像显示为插图。代表性的Bif-1-Atg5或Bif-1-LC-3双阳性病灶用箭头表示。插图中的比例尺为1μm。(b条)转染Bif-1-GFP的COS7细胞在EBSS中培养2h，用抗GFP抗体的免疫金电镜检测Bif-1-GFP的定位。箭头表示在自噬体膜上检测到的具有代表性的金颗粒。

Bif-1通过UVRAG与Beclin 1相互作用

由于Bif-1与Atg5和LC3共定位，我们接下来进行联合免疫沉淀分析，以确定Bif-1在自噬过程中是否与Atg蛋白相互作用。如所示图5a发现内源性Bif-1与内源性Beclin 1共沉淀，但LC3不共沉淀。表位标记的Bif-1和Beclin 1的异位表达证实了这种相互作用（参见补充信息，图S4a). 有趣的是，Bif-1-Beclin 1相互作用因营养缺乏而增强(图5a数据未显示），表明Bif-1参与Beclin 1调节的自噬途径。

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Bif-1通过UVRAG与Beclin 1相互作用(一)双歧杆菌-1WT和KO MEF在EBSS中培养0或6小时，并用抗Bif-1单克隆抗体进行免疫沉淀。用所示抗体通过免疫印迹法分析产生的免疫复合物和TCL。(b条)293T细胞与所示质粒共转染24小时，并用抗Flag单克隆抗体进行免疫沉淀。使用抗Myc或抗Flag多克隆抗体进行免疫印迹，分析产生的免疫复合物和TCL。(c（c）)293T细胞与所示质粒共转染22 h，在EBSS中饥饿2 h，并用抗Flag单克隆抗体进行免疫沉淀。用抗Myc或抗Flag多克隆抗体通过免疫印迹分析所得到的免疫复合物和TCL。(d日)用siGFP或siUVRAG转染293T细胞24小时，在EBSS中饥饿2小时，并用抗Bif-1单克隆抗体进行免疫沉淀。使用抗Bif-1和Beclin 1多克隆抗体通过免疫印迹分析产生的免疫复合物和TCL。通过免疫沉淀和抗UVRAG多克隆抗体（Abgent）的免疫印迹分析证实siUVRAG降低了UVRAG-蛋白表达。免疫印迹的完整扫描显示在补充信息，图S5.

最近，有研究表明，UVRAG直接与Beclin 1-PI3KC3脂激酶复合物相互作用，激活自噬29UVRAG包含一个氨基末端富含脯氨酸（PR）序列，其后是一个潜在的钙依赖性磷脂结合C2结构域和一个中心线圈结构域（CCD）。UVRAG通过其CCD直接结合Beclin 129虽然PR和C2结构域不是UVRAG与Beclin 1相互作用所必需的，但去除N末端结构域会降低UVRAG的自噬体形成活性，这表明PR或C2结构域也有助于高效自噬小体的形成29有趣的是，Bif-1含有一个C末端SH3结构域，与Beclin 1形成复合物，并参与自噬体的形成。因此，我们推测UVRAG可能是Bif-1-Beclin 1相互作用的桥接分子。共免疫沉淀实验表明，与Beclin 1相比，Bif-1确实对UVRAG具有相对较高的结合亲和力(图5b). Bif-1的SH3结构域对于其与UVRAG的相互作用是必需的且足够的(图5c). UVRAG的Beclin 1结合域CCD的过度表达破坏了Bif-1与Beclin l的结合（参见补充信息，图S4b). 此外，在293T细胞中，siRNA对UVRAG的敲除完全阻断了营养素戒断后生理蛋白水平上的Bif-1-Beclin 1相互作用(图5d). 这些结果清楚地表明，Bif-1通过UVRAG与Beclin 1相互作用。

因为Bif-1的SH3结构域足以使Bif-1与UVRAG结合(图5c)Bif-1的BAR结构域是其拯救Bif-1敲除细胞中自噬体形成的能力所必需的(图3f)接下来，我们研究了Bif-1的SH3结构域是否对自噬具有显性负效应。如所示图6aBif-1 SH3结构域的过度表达以剂量依赖性的方式抑制了营养剥夺后HeLa细胞中GFP-LC3点状病灶的形成。与此形成鲜明对比的是，内皮素A1的SH3结构域的过度表达对自噬体的形成没有影响(图6b)这与内皮素A1不能与UVRAG相互作用一致(图6c).

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Bif-1的SH3结构域的过度表达而非内皮素A1的过度表达抑制了自噬体的形成。(一)用0.2μg GFP-LC3和0、0.2或0.6μg Bif-1（SH3）-Myc表达质粒转染HeLa细胞24 h。用pcDNA3载体将质粒DNA总量调整为每次转染0.8μg。然后将细胞在EBSS或CM中培养3 h，并使用荧光显微镜测定每个GFP阳性细胞的GFP-LC3点数（平均值±s.d。；n个= 40). (b条)将GFP-LC3与Bif-1（SH3）-HcRed、Endophilin A1（SH3。；n个= 46). 统计显著性一和b条通过Student t检验确定（*p<0.0001）。(c（c）)将所示质粒转染293T细胞24小时，并用抗Flag单克隆抗体进行免疫沉淀。用抗Myc和抗Flag多克隆抗体通过免疫印迹分析得到的免疫复合物和TCL。免疫印迹的完整扫描显示c（c）显示在补充信息，图S5.

Bif-1调节PI3KC3活性

鉴于Bif-1是Beclin 1复合物的一种成分，我们接下来想研究Bif-1在自噬过程中是否影响PI3KC3的脂激酶活性。体外激酶分析表明，PI3KC3对营养剥夺的反应在双歧杆菌-1-/-MEF与野生型细胞的比较(图7a). p40（phox）PX-EGFP融合蛋白的病灶形成分析证实了这一点29，与PI3KC3产生的PtdIns-3-P特异结合(图7b). 此外，HeLa细胞中Bif-1的敲除也显著降低了PI3KC3的酶活性(图7c). 营养剥夺后，野生型Bif-1的过度表达而非SH3缺失突变体增强了293T细胞中PI3KC3的激活(图7d). 综上所述，这些观察结果表明，在饥饿条件下，Bif-1通过UVRAG与Beclin 1形成复合物，以促进PI3KC3脂激酶的激活和自噬体的形成(图7e).

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Bif-1的缺失抑制了营养饥饿期间PI3KC3的激活。(一)双歧杆菌-1用Flag-PI3KC3转染WT和KO-MEFs，然后在CM或EBSS中孵育2小时在体外PI3KC3激酶测定。通过免疫印迹分析确认Flag-PI3KC3的表达（左图）。显示了代表性的自动射线照片（中间面板）。结果通过台风扫描仪的磷化成像进行量化，并显示为折叠激活（右侧面板）。数据以五个独立实验的平均值±标准差表示。(b条)双歧杆菌-1用p40（phox）PX-EGFP转染WT和KO MEF，在CM或EBSS中培养2h，并用荧光显微镜进行分析。计算每个细胞p40（phox）PX-EGFP阳性小泡的数量（平均值±标准差。；n个= 35). 统计显著性一和b条通过Student t检验确定。(c（c）)将稳定的shBif-1克隆或对照HeLa细胞单独转染Flag-PI3KC3或与Flag-Taged Beclin 1和UVRAG联合转染48 h，并用在体外PI3KC3脂激酶测定。结果被量化并显示为相对活性（平均值±标准差。；n个= 3). (d日)293T细胞与Flag-PI3KC3和野生型Bif-1、Bif-1ΔSH3或对照空载体共转染24 h，并用在体外PI3KC3激酶测定（平均值±标准差。；n个= 3). (e（电子）)Bif-1-UVRAG-Beclin-1-PI3KC3蛋白复合物的示意图。

Bif-1基因敲除促进小鼠自发肿瘤发生

与Beclin 1缺陷小鼠不同，后者是胚胎致死小鼠10,30,双歧杆菌-1-/-小鼠发育正常，与野生型同窝小鼠无明显区别。这种表型也与Atg5或Atg7基因敲除小鼠不同，这些小鼠出生后无法克服严重饥饿期，并在新生儿早期死亡26,31Bif-1基因敲除小鼠和Atg基因敲除鼠之间表型差异的一个可能解释是，在特定组织中存在未知因子，这些因子在胚胎和新生儿发育期间在功能上弥补了Bif-1的缺乏。解剖和组织学分析表明，大多数检查的器官双歧杆菌-1-/-除了脾脏的大小明显大于年龄匹配的野生型小鼠外，小鼠似乎都正常(图8a). 然而，双歧杆菌-1-/-小鼠的肿瘤发生率显著高于对照组；29只Bif-1基因敲除小鼠中有26只（89.7%）在平均12个月大时发生自发性肿瘤，而21只野生型小鼠中只有3只（14.3%）发生自发性瘤(P（P）<0.001，Fisher精确检验；图8b). 最常见的肿瘤双歧杆菌-1-/-小鼠为淋巴瘤（29只中的24只双歧杆菌-1-/-小鼠与21只中的3只双歧杆菌-1+/+老鼠）。Bif-1型-/-与野生型小鼠（21只小鼠中的1只）相比，小鼠也出现了高频率的实体瘤（29只小鼠中有10只）。这些结果表明Bif-1是一种潜在的肿瘤抑制因子。

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Bif-1基因敲除增强小鼠自发肿瘤发生。(一)双歧杆菌-1-/-小鼠表现出中度脾肿大。切除脾脏的重量双歧杆菌-1+/+ (n个=27）和-/-(n个=34）只小鼠（6至18个月大）被测量。通过Wilcoxon秩检验确定统计显著性。(b条)肿瘤组织苏木精和伊红染色。21只Bif-1野生型小鼠中有3只（14.3%）和29只（89.7%）尸检小鼠中有26只（89.5%）出现肿瘤。比例尺指示50μm。

讨论

在本研究中，我们已经证明Bif-1通过UVRAG与Beclin 1形成复合物，以增强PI3KC3脂质激酶活性，并在营养饥饿期间诱导自噬体的形成。值得注意的是，EBSS诱导的PI3KC3活化仅被Bif-1的缺失部分抑制(图7)而Bif-1缺陷细胞的自噬体形成被严重阻断(图3). 这些结果表明，Bif-1除了增强PI3KC3激活以调节自噬外，还有其他作用方式。同样，Beclin 1对自噬体的形成是不可或缺的8，Beclin 1的缺失仅部分抑制PI3KC3活性32此外，Bif-1敲除细胞中Beclin 1的沉默对自噬依赖性细胞死亡没有显著影响(图2a)这表明Bif-1和Beclin 1参与了相同的信号通路，以应对营养剥夺。自噬过程包括多个步骤，包括小泡及其内容物的起始、货物包装、小泡成核、小泡扩张和完成、回收、对接和融合以及溶酶体降解2,4,5,33在这些步骤中，囊泡成核是自噬中最不被理解的方面之一，因为膜弯曲和变形的驱动力是完全未知的2已有研究表明，Beclin 1参与自噬体膜的成核2Bif-1与脂质结合并导致膜弯曲18因此，在自噬过程中，Bif-1可能通过隔离膜或吞噬细胞上的UVRAG与Beclin 1相互作用，通过其N-BAR结构域诱导膜弯曲来调节囊泡成核(图7e). 最近，Hsu及其同事证明Bif-1在COPI介导的COPI逆行转运中的囊泡形成中起着关键作用反式-高尔基网络（TGN）到内质网19此外，Beclin 1的大部分已被证明定位在TGN中9因此，确定Bif-1介导的COPI囊泡的形成是否有助于自噬过程将是一件有趣的事情。

而自噬被认为在饥饿条件下通过循环营养物质在细胞生存中发挥重要作用三,7,34，越来越多的证据表明自噬也与程序性细胞死亡有关4,7我们观察到，抑制自噬促进营养剥夺诱导的caspase-3激活(图2)，这与自噬是一种与细胞存活相关的适应性反应的观点一致。有趣的是，通过抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶阻断细胞凋亡并不能提高细胞存活率，而在饥饿条件下，自噬失活可以抑制细胞死亡。这些结果表明，自噬可以协调程序性细胞死亡，并有利于caspase-independent机制战胜凋亡。与凋亡不同，凋亡由激活的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶执行，自噬细胞死亡通过细胞质蛋白和细胞器的降解以非半胱氨酸蛋白酶依赖的方式发生。不难想象，细胞质成分的自噬降解会促进细胞功能的崩溃，导致不可逆的细胞死亡，同时通过去除受损的细胞器，如线粒体和前凋亡蛋白，阻止caspase活化和凋亡4.

最近研究的证据表明，自噬与肿瘤发生有关三,4,35研究表明，在大鼠化学致癌过程中，自噬率降低36-38此外，Akt和Bcl-2等癌基因抑制自噬，而DAPK、p53和PTEN等肿瘤抑制因子则刺激自噬39-42在人类乳腺癌和卵巢癌中经常检测到Beclin 1单倍体缺失8,43与野生型小鼠相比，贝克林1+/-小鼠的肿瘤发生率较高，包括淋巴瘤、肝癌和肺癌10,30与Beclin 1类似，UVRAG促进裸鼠自噬并抑制肿瘤发生29也有研究表明，UVRAG在人类结肠癌细胞中发生了高频率的单等位基因突变44一贯地，抑制HeLa细胞中Bif-1的表达可促进裸鼠肿瘤生长21Bif-1基因敲除显著促进小鼠自发性肿瘤的发生(图8). 此外双歧杆菌-1套细胞淋巴瘤的基因位点已被鉴定45据报道，胃癌中Bif-1的表达降低46虽然需要进一步研究来阐明Bif-1在Beclin 1介导的自噬启动中的确切机制，这项研究确定了Bif-1是一种自噬激活剂和肿瘤抑制因子，并提供了新的证据来支持诱导自噬可能有助于癌症预防和治疗的概念。

方法

RNA干扰

GFP-siRNA（siGFP）和UVRAG-siRNA（siUVRAG）的序列如前所述21,29所有siRNA均购自Dharmacon（Lafayette，CO），并以每1×10 10μg siRNA转染细胞6使用核感染系统的细胞（Amaxa，Gaithersburg，MD）。加扰控制shRNA（shSCR）和Beclin1 shRNA（shBECN1）的序列分别为5′-CAACAGAGAGAGCACCA-3′和5′-GCGGAGTATAGTGAGTTTAA-3′。所有慢病毒shRNA构建物均购自Open Biosystems（Huntsville，AL），并与包装质粒共同转染至293FT细胞。根据制造商的方案（加利福尼亚州卡尔斯巴德Invitrogen），使用产生的含有shRNA表达慢病毒的上清液转导MEF。

自噬分析

细胞培养在0.1%明胶涂层的培养皿或盖玻片上，用PBS洗涤两次，用EBSS洗涤一次，然后在EBSS中培养指定时间。为了进行电子显微镜分析，细胞在pH7.2的0.1M磷酸盐缓冲液中用2.5%戊二醛固定16小时，在4°C下用1%四氧化锇在pH7.2的0.1M磷酸缓冲液中后固定1小时，4°C，包埋，切片，厚度80 nm，用6%醋酸铀酰和雷诺兹柠檬酸铅染色，并用飞利浦CM10透射电子显微镜进行分析。为了分析GFP-LC3点状病灶，使用FuGENE HD（Roche，Indianapolis，IN）将细胞转染GFP-LC2 20 h。在EBSS中培养后，将细胞固定在3.7%的甲醛中，并使用自动化蔡司Axio-Imager Z.1显微镜计算每个GFP阳性细胞中GFP点（直径≥300 nm）的数量。为了分析LC3-I对LC3-II的修饰，在含有蛋白酶抑制剂的放射免疫沉淀分析缓冲液（150 mM NaCl，10 mM Tris-HCl，pH 7.4，0.1%SDS，1%Triton X-100，1%脱氧胆酸盐，5 mM EDTA，pH 8.0）中制备总细胞裂解物，并使用抗大鼠LC3多克隆抗体进行SDS-PAGE/免疫印迹分析27.

免疫共沉淀和共聚焦显微镜

在含有蛋白酶抑制剂的2%CHAPS裂解缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 7.5，137 mM NaCl，2mM EDTA，10%甘油，2%CHAPS）中制备总细胞裂解物，并用抗Bif-1（Imgenex，加利福尼亚州圣地亚哥）、抗Flag（Sigma，圣路易斯，MO）或抗Myc-tag单克隆抗体进行免疫沉淀。用裂解缓冲液洗涤产生的免疫复合物三次，并用抗Beclin 1（加利福尼亚州圣地亚哥Abgent）、抗Bif-1（德克萨斯州圣安东尼奥GeneTex）、抗LC3、抗Myc（Sigma）或抗Flag（Sigma-）多克隆抗体进行Western blot分析。为了确定Bif-1在自噬过程中的定位，COS7细胞生长在涂胶的盖玻片上，并转染Bif-1-HcRed和GFP-Atg5或GFP-LC3。转染后20小时，用PBS清洗细胞两次，用EBSS清洗一次，在EBSS中培养2小时，固定在3.7%甲醛/PBS中，并用含有DAPI的培养基（加利福尼亚州伯灵盖姆向量实验室）固定。荧光图像通过Leica DMI6000激光扫描共聚焦显微镜进行分析。

免疫电子显微镜

用Bif-1-GFP转染COS7细胞20 h，在EBSS中培养2 h。细胞在pH7.2的0.1 M磷酸盐缓冲液（PB）中的4%多聚甲醛中固定90 min，在pH7.1的0.1 M PB中的0.1%硼氢化钠中培养30 min，并用0.05%Triton X-100在PBS中渗透30 min。在封闭缓冲液（5%牛血清蛋白组分V、0.1%冷水鱼明胶、5%正常山羊血清、PBS、pH7.4）中培养30分钟后，用抗GFP兔多克隆抗体（Invitrogen）对细胞染色1小时，然后用山羊抗兔IgG fab二级抗体（Electron Microscopy Science，Hatfield，PA）染色。将细胞在4°C的2.5%戊二醛中固定过夜，然后在0.5%四氧化锇中固定30分钟。使用银增强试剂盒将金颗粒放大25分钟（电子显微镜科学）。然后将细胞脱水，用塑料渗透，包埋在塑料中，以80 nm的厚度切片，用6%醋酸铀酰和雷诺兹柠檬酸铅染色，并用Philips CM10透射电子显微镜进行分析。

PI3KC3活性分析

用标记的PI3KC3或p40（phox）PX-EGFP转染细胞24小时，并在EBSS或正常培养基（CM）中再培养2小时在体外PI3KC3激酶分析，用抗Flag亲和珠（Sigma）免疫沉淀Flag-PI3KC3，用1%NP-40在PBS中洗涤两次，用洗涤缓冲液洗涤两次（100 mM Tris-HCl，pH 7.5，500 mM LiCl），用TNE缓冲液洗涤二次（10 mM Tris-HCl，PH7.5，100 mM NaCl，1 mM EDTA）并在室温下在60μl反应缓冲液（10 mM MnCl）中预培养10分钟2TNE）中含有2μg超声磷脂酰肌醇。通过添加5μl的ATP混合物（1μl的10 mM未标记ATP，1μlγ-32P-ATP，3μl H2O） 在室温下培养15分钟。通过添加100μl用CHCl萃取的1 N HCl终止反应三：MeOH（1:1），用MeOH:1 N HCl（1:1三：甲醇（1:1）。所得测定产物在干燥的二氧化硅、铝薄液相色谱板上用流动缓冲液（CHCl）分离三：甲醇：4 M NH4俄亥俄州（9:7:2），使用9400台风可变模式成像仪（新泽西州皮斯卡塔韦市Amersham Biosciences）进行可视化。对于p40（phox）PX-EGFP分析，将细胞胰蛋白酶化，细胞纺丝到载玻片上，固定在3.7%甲醛/PBS中，并用含有DAPI的培养基固定（Vector Laboratories）。每个细胞中p40（phox）PX-EGFP阳性小泡的数量使用自动化蔡司Axio-Imager Z.1显微镜测定。

组织学检查

如前所述，Bif-1基因敲除小鼠是通过靶向同源重组产生的21用于检测自发肿瘤发生的所有小鼠均为129SvJ×C57BL/6杂交。为了进行组织学检查，将从6至18个月大的小鼠身上摘取的组织固定在10%甲醛中，进行包埋、切片、苏木精和伊红染色，并由两名独立的高级病理学家（DC、HC）进行检查。

补充材料

图S1

注：补充信息可在Nature Cell Biology网站上获得。

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图S2

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图S3

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图S4

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文本

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致谢

我们感谢E.Haller在电子显微镜分析方面的协助；G.Gao提供统计帮助；C.Meyerkord和R.Youle批判性阅读手稿；D.C.S.Huang、B.Levine、N.Mizushima、G.Nolan、G.Reuther和T.Yoshimori代表试剂。这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）和美国癌症学会（ACS）向H.-G.W.提供的资助，以及上原纪念基金会和日本科学促进会（JSPS）向Y.T.提供的研究金。

脚注

竞争利益声明：作者声明，他们没有相互竞争的经济利益。

工具书类

1Yoshimori T.自噬：细胞内一种受调控的体降解过程。生物化学与生物物理研究委员会。2004;313:453–8.[公共医学][谷歌学者]
2莱文B，克林斯基DJ。自我暗示的发展：自噬的分子机制和生物功能。开发单元。2004;6:463–77.[公共医学][谷歌学者]
三。Shintani T，Klinsky DJ。健康与疾病中的自噬：一把双刃剑。科学。2004;306:990–5. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
4Gozuacik D，Kimchi A.自噬是一种细胞死亡和肿瘤抑制机制。致癌物。2004;23:2891–906.[公共医学][谷歌学者]
5Eskelinen EL.哺乳动物细胞自噬空泡的成熟。自噬。2005;1:1–10.[公共医学][谷歌学者]
6Mizushima N、Ohsumi Y、Yoshimori T.哺乳动物细胞中的自噬体形成。细胞结构功能。2002;27:421–9.[公共医学][谷歌学者]
7莱文B，袁J。牢房死亡中的自噬：一名无辜罪犯？临床投资杂志。2005;115:2679–88. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
8Liang XH等。beclin 1对自噬的诱导和对肿瘤发生的抑制。自然。1999;402:672–6.[公共医学][谷歌学者]
9Kihara A、Kabeya Y、Ohsumi Y、Yoshimori T.Beclin-磷脂酰肌醇3-激酶复合物在转高尔基网络中的作用。EMBO代表。2001;2:330–5. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
10Yue Z、Jin S、Yang C、Levine AJ、Heintz N.Beclin 1是早期胚胎发育所必需的自噬基因，是一种单倍体抑癌基因。美国国家科学院院刊。2003;100:15077–82. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
11Furuya N，Yu J，Byfield M，Pattinge S，Levine B。Beclin 1的进化保守结构域是Vps34结合、自噬和肿瘤抑制功能所必需的。自噬。2005;1:46–52.[公共医学][谷歌学者]
12Peter BJ等。作为膜曲率传感器的BAR域：两性激素BAR结构。科学。2004;303:495–9.[公共医学][谷歌学者]
13Masuda M，et al.内皮素BAR结构域通过两种新发现的基于结构的机制驱动膜弯曲。Embo J。2006年；25:2889–97. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
14Gallop JL等。内啡肽N-BAR域介导的膜弯曲机制。Embo J。2006年；25:2898–910. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
15Huttner WB，Schmidt A.脂质，膜出芽和分裂中的脂质修饰和脂蛋白相互作用——对亲脂酶A1和突触素在突触小泡内吞作用中的作用的见解。神经生物电流。2000;10:543–51.[公共医学][谷歌学者]
16Cuddeback SM等人。Bif-1的分子克隆和表征：一种与Bax相关的新型SH3结构域蛋白。生物化学杂志。2001;276:20559–20565.[公共医学][谷歌学者]
17Pierrat B等人，SH3GLB，一个新的亲脂酶相关蛋白家族，具有SH3结构域。基因组学。2001;71:222–34.[公共医学][谷歌学者]
18Farsad K等人。由直接内白素双层相互作用介导的高曲率膜的生成。细胞生物学杂志。2001;155:193–200. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
19Yang JS等。裂变机械的关键部件是可互换的。自然细胞生物学。2006年；8:1376–82.[公共医学][谷歌学者]
20Karbowski M，Jeong SY，Youle RJ。维持线粒体形态需要嗜内素B1。细胞生物学杂志。2004;166:1027–39. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
21Takahashi Y等。Bif-1缺失抑制Bax/Bak构象变化和线粒体凋亡。分子细胞生物学。2005;25:9369–82. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
22Yu L等。半胱氨酸蛋白酶-8对自噬细胞死亡的ATG7-beclin 1程序的调节。科学。2004;304:1500–2.[公共医学][谷歌学者]
23Shimizu S等。Bcl-2家族蛋白在依赖自噬基因的非凋亡程序性细胞死亡中的作用。自然细胞生物学。2004;6:1221–8.[公共医学][谷歌学者]
24Willis SN等。促凋亡Bak被Mcl-1和Bcl-xL隔离，而不是Bcl-2，直到被BH3-only蛋白取代。基因发育。2005;19:1294–305. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
25Boya P等。抑制宏观自噬触发细胞凋亡。分子细胞生物学。2005;25：1025–40。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
26Kuma A等人。自噬在新生儿早期饥饿期间的作用。自然。2004;432:1032–6.[公共医学][谷歌学者]
27Kabeya Y等。LC3是酵母Apg8p的哺乳动物同源物，加工后定位于自噬体膜。Embo J。2000;19:5720–8. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
28Mizushima N等。使用Apg5缺陷小鼠胚胎干细胞解剖自噬体形成。细胞生物学杂志。2001;152:657–68. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
29Liang C等。新型Beclin1结合蛋白UVRAG的自噬和抑瘤活性。自然细胞生物学。2006年；8:688–99.[公共医学][谷歌学者]
30Qu X等。通过杂合性破坏beclin 1自噬基因促进肿瘤发生。临床投资杂志。2003;112:1809–20. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
31Komatsu M等。Atg7缺陷小鼠饥饿诱导和结构性自噬的损伤。细胞生物学杂志。2005;169:425–34. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
32Kihara A，Noda T，Ishihara N，Ohsumi Y。酿酒酵母中两种不同的Vps34磷脂酰肌醇3-激酶复合物在自噬和羧肽酶Y分选中起作用。细胞生物学杂志。2001;152:519–30. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
33Ohsumi Y.自噬的分子解剖：两个泛素样系统。Nat Rev Mol细胞生物学。2001;2：211–6。[公共医学][谷歌学者]
34Lum JJ、DeBerardinis RJ、Thompson CB。后生动物的自噬：细胞在富饶之地的生存。Nat Rev Mol细胞生物学。2005;6:439–48.[公共医学][谷歌学者]
35Mathew R，White E.为什么生病的细胞会产生肿瘤：自噬的保护作用。自噬。2007;三:502–5. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
36Schwarze PE，Seglen PO公司。降低自噬活性，改善蛋白质平衡，提高从致癌大鼠分离的肝细胞的体外存活率。实验细胞研究。1985年；157:15–28.[公共医学][谷歌学者]
37Kisen GO等。原发性大鼠肝癌和腹水肝癌细胞自噬活性降低。致癌。1993;14:2501–5.[公共医学][谷歌学者]
38Toth S，Nagy K，Palfia Z，Rez G.大鼠胰腺中氮杂丝氨酸诱导肿瘤进展期间细胞自噬能力的变化。在所有癌前阶段上调表达，在恶性转化过程中随着环己酰亚胺分离敏感性的丧失而下调表达。细胞组织研究。2002;309:409–16.[公共医学][谷歌学者]
39Arico S等。肿瘤抑制剂PTEN通过抑制磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B途径，积极调节大分子自噬。生物化学杂志。2001;276:35243–6.[公共医学][谷歌学者]
40Pattinge S等。Bcl-2抗凋亡蛋白抑制Beclin 1依赖性自噬。单元格。2005;122:927–39.[公共医学][谷歌学者]
41Inbal B、Bialik S、Sabanay I、Shani G、Kimchi A.DAP激酶和DRP-1介导细胞程序性死亡过程中的膜泡和自噬小泡的形成。细胞生物学杂志。2002;157:455–68. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
42冯Z，张华，莱文AJ，金S。细胞内p53和mTOR通路的协同调节。美国国家科学院院刊。2005;102：8204–9。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
43Aita VM等。染色体17q21上候选抑癌基因beclin 1的克隆和基因组组织。基因组学。1999;59:59–65.[公共医学][谷歌学者]
44Ionov Y、Nowak N、Perucho M、Markowitz S、Cowell JK。操纵无义介导的衰变可识别具有微卫星不稳定性的结肠癌细胞中的基因突变。致癌物。2004;23:639–45.[公共医学][谷歌学者]
45Balakrishnan A等。定量微卫星分析以描绘外套细胞淋巴瘤中常见缺失区域1p22.3。基因染色体癌。2006年；45:883–92.[公共医学][谷歌学者]
46Lee JW等。胃癌中肿瘤抑制因子Bax相互作用因子-1（Bif-1）（Bax激活剂）的表达降低。病理学。2006年；38:312–5.[公共医学][谷歌学者]