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基因发育。2008年2月15日；22(4): 476–488.
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预防性维修识别码：项目经理2238669
PMID：18281461

通过调控线粒体中OPA1依赖的嵴形态发生来抑制细胞增殖和凋亡

卡斯滕·默克沃特,1 萨沙·达加桑利,1 Takashi Tatsuta公司,1 斯特凡·盖默,2 贝娅特丽克丝·勒沃,2 F.托马斯·温德利希,1 Jürgen-Christoph von Kleist-Retzow先生,三 阿里·韦斯曼,1,4 贝内迪克特·韦斯特曼,2和兰格尔1,5
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摘要

禁止蛋白包含一个进化上保守且普遍表达的膜蛋白家族，其功能描述很差。PHB1和PHB2亚基的大集合位于线粒体的内膜，但这两种蛋白质在其他细胞隔室中也有不同的作用。在这里，我们使用小鼠的条件基因靶向菲律宾比索定义禁令的细胞活动。我们的实验限制了禁令对线粒体的作用，并将线粒体融合机制的重要组成部分动力样GTPase OPA1的加工确定为禁令控制的中央细胞过程。删除菲律宾比索导致OPA1长亚型的选择性丢失。这导致嵴形态发生异常，细胞增殖和抗凋亡能力受损。在PHB2缺陷细胞中长型OPA1亚型的表达抑制了这些缺陷，将受损的OPA1加工鉴定为在不存在抑制剂的情况下的原发性细胞缺陷。因此，我们的结果为线粒体嵴的形成指定了一个重要的功能，并提示细胞增殖与线粒体形态发生的耦合。

[关键词：抑制素、OPA1、线粒体融合、线粒体嵴、细胞凋亡]

线粒体是多功能网状细胞器，与细胞生理密切相关(Chan 2006年a;McBride等人，2006年). 线粒体的动态形态改变使其活动适应细胞在时间和空间上的需求(冈本和肖2005;Chan 2006年b;Hoppins等人，2007年). 至少有四种动力相关的GTPase介导线粒体膜的分裂和融合，并决定线粒体网的形状：外层的丝裂原融合蛋白（MFN1和MFN2）和内层膜的OPA1控制线粒体膜融合，而DRP1触发分裂事件。MFN2和OPA1突变导致神经退行性变(Alexander等人，2000年;Deletere等人，2000年;Züchner等人，2004)说明线粒体动力学对神经元功能的重要性。

抑制素包括一个进化上保守的膜蛋白家族，其功能尚不清楚(Nijtmans等人，2002年;Mishra等人，2005年). 两个同源亚单位PHB1（BAP32，通常简称为禁止）和PHB2（BAP37，REA）的多个拷贝在线粒体内膜中形成大的复合物(Ikonen等人，1995年;Coates等人，1997年;伯杰和亚菲1998). 酵母抑制素复合物的环状结构(Back等人，2002年;Tatsuta等人，2005年)与SPFH家族脂筏相关蛋白的序列相似性表明抑制物具有支架功能，可以定义膜微结构域(Tavernarakis等人，1999年;Langhorst等人，2005年;莫罗和帕顿2005;Browman等人，2007年). 这种活性可以解释禁令与酵母中一组不同基因的合成致命相互作用(伯杰和亚菲1998;Birner等人，2003年;诺尔登等人，2005年;Osman等人，2007年)以及哺乳动物中被指定为禁药的多种细胞作用。

抑制基因在多细胞生物中的失活，如小鼠和秀丽隐杆线虫揭示了生物体发育过程中的基本功能(Sanz等人，2003年;Park等人，2005年). 然而，这些功能丧失表型的分子基础尚不清楚。最重要的是，虽然线粒体定位被广泛接受，但在某些哺乳动物细胞系的细胞核和质膜中也发现了PHB1和PHB2(Fusaro等人，2003年;Kurtev等人，2004年;Kasashima等人，2006年). 抑制因子亚单位被认为通过与视网膜母细胞瘤肿瘤抑制蛋白和p53相互作用来调节细胞周期和凋亡过程(Nuell等人，1991年;Wang等人，2002年;Kasashima等人，2006年)，通过与组蛋白去乙酰化酶相互作用抑制雌激素受体的转录活性(Montano等人，1999年;Kurtev等人，2004年)，通过与c-Raf的相互作用调节上皮细胞的粘附和迁移(Rajalingam等人，2005年)，或作为细胞表面受体发挥作用(Terashima等人，1994年;Mengwasser等人，2004年;Sharma和Quadri 2004). 然而，值得注意的是，尽管已经证明这两种蛋白质可以相互定量组装，但这些研究中的许多没有考虑抑制物的线粒体定位，只涉及PHB1或PHB2的功能(Coates等人，2001年).

在这里，我们使用小鼠的条件基因靶向菲律宾比索并定义了线粒体内OPA1处理的禁令复合物的基本作用，该过程会导致细胞增殖受损、对凋亡的抵抗和线粒体嵴形态发生。

结果

小鼠的条件基因靶向菲律宾比索

为了研究PHB2在体内的功能，我们使用条件基因靶向Cre-液氧磷-介导重组。老鼠菲律宾比索该基因位于第6号染色体上，由九个外显子组成(图1A). 我们构建了一种基因替换载体，该载体引入了包含新霉素耐药基因的基因盒(尼奥)和侧翼液氧磷外显子3和a上游的位点液氧磷外显子4下游进入内源性博士2基因(图1A). 删除液氧磷-由Cre重组酶引起的侧翼外显子3和4引起移码突变，导致PHB2的氨基酸73处翻译停止。注射携带靶向等位基因的胚胎干细胞（ES）后（补充图S1），通过Southern印迹分析证实了种系传播(图1B). 杂合的菲律宾比索+/−动物是在菲律宾比索佛罗里达州/+带有Cre公司-可在所有组织中普遍表达Cre重组酶的转基因小鼠株(Schwenk等人，1995年). 交叉路口菲律宾比索+/−小鼠均未显示存活菲律宾比索−/−在胚胎第8.5天之前，后代也没有鉴定出纯合子突变胚胎（补充表S1）。类似地菲律宾比索佛罗里达州/+具有在大脑中特异性表达Cre重组酶的Cre系的小鼠没有产生可存活的后代（补充表S1）。这些发现与之前使用传统淘汰策略的观察结果一致(Park等人，2005年)并提示PHB2在早期胚胎发育中的重要作用。

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小鼠条件灭活菲律宾比索体内和体外。(A类)野生型的示意图菲律宾比索位点（WT）、靶向载体（TV）、靶菲律宾比索fl（新）/+同源重组（FN）后的位点，条件菲律宾比索飞行/飞行Flpe介导重组后的基因座（F）和Cre介导重组时的敲除基因座（Δ）。阳性和阴性选择标记（NeoR（右）和TK），外显子（黑条），FRT公司和液氧磷标记了位点（分别为黑色椭圆和黑色三角形）、外部探针（黑箱，A和B）、PCR引物的位置（黑色箭头，P1–P3）和相关的HindIII限制位点（H）。(B类)携带靶标的生殖系传播后代的Southern blot分析菲律宾比索外语（neo）/+轨迹。从ES细胞和尾部活检中分离的基因组DNA用HindIII消化、杂交，并通过放射自显影术进行分析。(C类)MEF分离DNA的PCR分析。显示了野生型（WT）、floxed（flox）和敲除（Δ）基因座的扩增DNA片段。(天)总蛋白裂解物的免疫印迹分析。当需要时，用Cre重组酶转导的MEF用PHB1和PHB2特异性抗体进行免疫印迹分析。交叉反应带被用作加载控制。(E类)RT-PCR分析菲律宾比索和菲律宾比索成绩单菲律宾比索-缺陷和控制MEF。β转录本-肌动蛋白作为对照。

定义删除的功能后果菲律宾比索，小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）是从纯合的菲律宾比索飞行/飞行胚胎，并用纯化的Cre重组酶转导，导致高效删除菲律宾比索在体外(图1C). Western blot分析证实PHB2在菲律宾比索−/−单元格(图1D). 值得注意的是，PHB2的消耗伴随着其组装伙伴PHB1的损失(图1D). RT-PCR实验表明菲律宾比索收益，无论是否存在菲律宾比索在单元格中(图1E). 因此，与其他生物类似(伯杰和亚菲1998;Sanz等人，2003年)，小鼠PHB1和PHB2在功能上相互依赖，将组装的禁止复合物定义为功能活性单位。

PHB2确保细胞增殖并防止细胞凋亡

影响菲律宾比索通过测定三H-胸苷掺入菲律宾比索佛罗里达州/+和菲律宾比索飞行/飞行用Cre重组酶转导的成纤维细胞。而Cre转导不影响杂合子DNA标记菲律宾比索佛罗里达州/+细胞，合并三在缺乏PHB2的细胞中，H-胸苷严重受损(图2A). 一直以来，细胞生长在菲律宾比索飞行/飞行Cre转导后的细胞(博士2−/−) (图2B).

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菲律宾比索是细胞增殖和抗凋亡所必需的。(A类)成立三Cre转导后MEF中的H-胸苷。数据表示三个独立实验的平均值±标准偏差。(***)P（P）< 0.001. (B类)PHB2-缺陷和控制MEF的生长曲线。电池（5×104)被镀在60-mm的盘子上，并在需要时转换成Cre。每个时间点计算三份细胞样本。(**)P（P）< 0.01; (***)P（P）< 0.001. (C类)TUNEL染色菲律宾比索飞行/飞行如有需要，用Cre-relubise治疗MEF。对DNA酶I处理的MEF进行平行分析以进行对照。棒材，10μm。(天)Cre诱导的博士2在里面菲律宾比索-MEF不足。菲律宾比索飞行/飞行MEF被稳定转染了CAGs–NeoR–STOP–IRES–EGFP构建物，其中含有菲律宾比索cDNA(菲律宾比索飞行/飞行■Phb2). Cre介导的重组导致内源性flox的失活菲律宾比索等位基因，同时，在去除漂浮的转录STOP盒时，允许表达菲律宾比索CAGs启动子控制下的转基因。以IRES-EGFP表达为报告基因。(E类)半胱氨酸天冬氨酸酶激活博士2飞行/飞行和菲律宾比索飞行/飞行■Phb2细胞在足叶乙甙存在下。当指示并用增加的足叶乙甙浓度（0、0.5、1、5、10、15μM）处理5 h时，用Cre-relubuse转导细胞株。使用针对caspase-3、PARP和PHB2的抗体，通过SDS-PAGE和免疫印迹分析细胞裂解产物。β-肌动蛋白作为负荷对照。(F类)半胱氨酸天冬氨酸酶激活菲律宾比索飞行/飞行和菲律宾比索飞行/飞行■Phb2细胞受到各种内源性和外源性凋亡刺激。Cre转导后，用葡萄孢霉素（STS，1μM）、放线菌素D（ActD，1μg/mL）或TNF-α（10 ng/mL）处理细胞5 h。细胞裂解物按E类. (G公司)细胞色素c（c）在有放线菌素D的情况下，从抑制素缺乏的线粒体中释放。在有或无放线菌肽D（1μg/mL）的情况下培养5小时，并用免疫荧光分析用Cre重组酶转导的细胞。核DNA用DAPI染色。棒材，10μm。(H（H）)细胞色素定量c（c）从缺乏禁令的线粒体释放。数据表示三个独立实验的平均值±标准偏差。对每种类型的大约300个细胞进行了分析。(***)P（P）< 0.001.

PHB2缺陷细胞的TUNEL染色、活化caspase-3细胞裂解物的免疫印迹和细胞色素c（c）免疫荧光没有提供任何自发凋亡的证据(图2C–H). Bax和Bcl2以及抗凋亡蛋白Hax1在野生型和PHB2缺乏细胞中以类似水平积累（补充图S2）。然而，菲律宾比索−/−细胞对各种内源性和外源性凋亡刺激的敏感性增加(图2E-H; 补充图S2）。活化的caspase-3和裂解的PARP在PHB2缺乏的MEF中积累，但在接受各种凋亡内在途径刺激的野生型MEF中没有积累，包括足叶乙甙、staurosporine和放线菌素D(图2E、F). 值得注意的是，PHB2的缺失也影响了TNFα诱导的细胞凋亡的外源性途径(图2F). 与这些发现一致，细胞色素c（c）从PHB2缺乏的线粒体中释放，但没有菲律宾比索飞行/飞行用有限浓度放线菌素D刺激后的细胞(图2G、H).

我们建立了稳定的菲律宾比索飞行/飞行将PHB2从带有侧翼的秒针座下游窝藏的细胞系液氧磷站点(图2D). 这些细胞的Cre转导可以诱导转基因的表达，从而导致基因组的缺失菲律宾比索.PHB2在菲律宾比索−/−细胞恢复细胞增殖(图2A)，细胞生长(图2B)以及细胞的抗凋亡性(图2E-H)，证明这两种表型都可以完全归因于PHB2的丢失。因此，我们得出结论，小鼠的缺失菲律宾比索损伤细胞增殖而不诱导凋亡，但使MEF对凋亡刺激高度敏感。

细胞增殖依赖于线粒体靶向PHB2

考虑到不同细胞隔室中的禁药具有多效性功能，我们研究了细胞缺陷是否博士2−/−细胞是由线粒体内PHB2的丢失引起的。我们首先替换了PHB2 N端线粒体靶向序列中保守的精氨酸残基(图3A;Kasashima等人，2006年)并分析了PHB2变体在体内外的线粒体靶向性。35S标记的野生型PHB2被导入从小鼠肝脏分离的线粒体，并以蛋白酶保护的形式积累(图3B). PHB2的输入取决于穿过内膜的膜电位，并且不伴随蛋白水解裂解(图3B). 用丙氨酸替换11、17或24位带正电荷的单个氨基酸不会影响PHB2在体外的输入；然而，在11和17位的两个精氨酸残基（PHB2）发生突变后，其功能严重受损AARR公司) (图3C). 类似地，一个在48和54位含有精氨酸残基两个额外突变的四重突变体的导入在体外被阻断（PHB2美国汽车协会) (图3C). 当在MEF中瞬时表达为EGFP融合蛋白时，PHB2的线粒体靶向性AARR公司仍被观察到，很可能是突变变体过度表达的结果(图3D). 同样，PHB2RRAA公司-EGFP在MEF中瞬时表达时靶向线粒体(图3D). 相比之下，PHB2美国汽车协会-EGFP在胞浆中积累，表明线粒体分选在体内受到抑制(图3D).

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细胞增殖依赖于PHB2的线粒体靶向性。(A类)小鼠PHB2的N-末端氨基酸。禁令中高度保守的残基以黑色显示，同源氨基酸以灰色显示。图中显示了PHB2的11、17、48和54位被丙氨酸取代的精氨酸残基。PHB2ΔN44的N端用箭头表示。(B类)PHB2的膜电位依赖性导入线粒体35S-蛋氨酸并在25°C下导入分离的小鼠肝线粒体30分钟。在导入之前（-ΔΨ）或完成之后（+Δψ），通过添加缬霉素来消散跨内膜的膜电位。非进口前蛋白通过胰蛋白酶处理（50μg/mL）降解。样品通过SDS-PAGE和放射自显影进行分析。输入对应于10%。(C类)将PHB2突变体导入分离的线粒体。使用35按照B类导入反应通过磷光成像分析进行量化。(天)体内PHB2变体的线粒体靶向性。用EGFP标记的鼠PHB2和mito-DsRed转染MEFs，并通过荧光显微镜进行分析。图示了PHB2杂交蛋白在所示位置携带突变。棒材，10μm。(E类)表达PHB2变异体的稳定细胞系增殖的监测三H-胸苷掺入。表达PHB2突变体的稳定细胞系（如天)和IRES-EGFP的建立如图2D数据表示三个独立实验的平均值±标准偏差。(F类)表达PHB2或其突变变体的MEF细胞系的免疫印迹分析。细胞提取物通过SDS-PAGE和PHB1和PHB2特异性抗体的免疫印迹分析。F的α-亚单位1复合物V（Suα）的颗粒用作负载控制。(G公司)RT-PCR分析菲律宾比索和菲律宾比索各种MEF细胞系中的转录物。菲律宾比索来自基因组位点的转录物(博士2)和转基因(菲律宾比索*)使用等位基因特异性引物对进行扩增。的成绩单Gapdh公司作为对照。

为了检测PHB2变异体的活性，我们建立了稳定的菲律宾比索飞行/飞行表达PHB2的细胞系AARR公司，PHB2RRAA公司和PHB2美国汽车协会Cre介导重组后的转基因（参见图2D). PHB2转基因表达可恢复PHB2缺陷MEF的细胞增殖AARR公司或PHB2RRAA公司(图3E)其累积水平与PHB2相似菲律宾比索飞行/飞行单元格(图3F; 数据未显示）。相反，细胞溶质变异体PHB2的表达美国汽车协会不支持细胞增殖(图3E). 尽管表达了(图3G)，既不是线粒体PHB1也不是细胞溶质PHB2美国汽车协会在这些细胞中稳定积累，表明这两种蛋白质降解(图3F). 另一方面，假定的核定位信号和核受体盒基序的突变不会干扰细胞增殖（补充图S3）。这些结果揭示了线粒体靶向性与维持细胞增殖之间的显著相关性，表明了线粒体内PHB2的关键作用。

PHB2是维持管状线粒体和正常嵴形态所必需的

为了检测PHB2缺陷线粒体的形态，我们在菲律宾比索+/+,菲律宾比索佛罗里达州/+,菲律宾比索飞行/飞行、和中的菲律宾比索飞行/飞行细胞系补充菲律宾比索.烧蚀菲律宾比索Cre转导对线粒体形态有严重影响，导致90%以上的线粒体断裂菲律宾比索−/−单元格(图4A、B). 在菲律宾比索+/+或菲律宾比索佛罗里达州/+细胞，排除Cre重组酶对线粒体形态的有害影响(图4A、B). C介导的菲律宾比索在里面菲律宾比索−/−细胞恢复线粒体的管状形态(图4A、B).

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嵴形态发生缺陷菲律宾比索−/−细胞。(A类)禁令缺乏型MEF中线粒体的碎片化。用mito-DsRed转染细胞株，在需要时用Cre重组酶处理，72小时后用荧光显微镜进行分析。棒材，10μm。(B类)对照组线粒体形态定量(博士2飞行/飞行■Phb2)以及抑制蛋白缺乏型MEFs。对含有管状（白色条）或碎片状（黑色条）线粒体的细胞进行分类。每个实验对200多个细胞进行评分。(C类)线粒体超微结构缺陷菲律宾比索−/−细胞。以下细胞系线粒体的典型透射电镜照片如下：菲律宾比索飞行/飞行（面板一),菲律宾比索佛罗里达州/++Cre（面板b条),菲律宾比索飞行/飞行■Phb2+Cre（面板c（c）)、和菲律宾比索飞行/飞行+Cre（面板d–g). 条形，500 nm。(天)中嵴形态的量化菲律宾比索飞行/飞行,菲律宾比索飞行/飞行■Phb2、和菲律宾比索飞行/飞行当需要时，用Cre-relubise转导MEF。约50%的嵴形态紊乱的细胞含有囊泡嵴结构。每个实验对大约100个细胞切片进行评分。(E类)连续透射电镜切片的三维重建菲律宾比索飞行/飞行单元格（面板一)用Cre-relubise转导（面板b条). 棒，500纳米。

Cre转导的线粒体超微结构菲律宾比索佛罗里达州/+,博士2飞行/飞行、和菲律宾比索飞行/飞行■Phb2用电子显微镜检查MEF(图4C、D). 以下人员的在场液氧磷-侧翼的菲律宾比索或删除菲律宾比索杂合的菲律宾比索佛罗里达州/+细胞不影响线粒体的超微结构(图4C，面板a、b）。然而菲律宾比索−/−细胞有缺陷嵴(图4C[面板d–g]，d）。无论是板层嵴几乎完全消失，还是线粒体内出现气球状、囊泡状结构(图4C，面板d–g）。这种作用在PHB2表达后在很大程度上被逆转菲律宾比索−/−单元格(图4C[面板c]，D）。

为了获得线粒体三维组织的高分辨率图像，我们分析了线粒体的连续超薄切片菲律宾比索飞行/飞行和菲律宾比索−/−透射电子显微镜下的细胞(图4E). 从这些图像生成的三维模型显示菲律宾比索飞行/飞行单元格(图4E). 相反，在PHB2缺乏细胞的线粒体内，观察到形态不同的囊泡结构堆积(图4E). 我们得出结论，线粒体板层嵴的形成依赖于PHB2。

PHB2控制内膜OPA1的裂解

在线粒体介导的凋亡过程中，动力蛋白样GTPase OPA1是维持内膜正常嵴和嵴重塑所必需的(Olichon等人，2003年;Griparic等人，2004年;Frezza等人，2006年). 因此，可以想象删除菲律宾比索影响OPA1功能。八个OPA1剪接变异体的表达和蛋白水解过程导致至少五种不同的OPA1亚型的形成，两种长型命名为L1和L2，它们可以通过蛋白水解转化为三种短型命名为S3–S5(Ishihara等人，2006年;Duvezin Caubet等人，2007年;Griparic等人，2007年;Olichon等人，2007年;Song等人，2007年). 免疫印迹法菲律宾比索−/−和菲律宾比索−/−∷菲律宾比索具有OPA1特异性抗体的细胞显示，在缺乏PHB2的情况下，OPA1亚型的积累模式发生了剧烈变化(图5A). 虽然长型L1、L2和短型S4缺失或几乎检测不到，但S3和更明显的S5在缺乏PHB2的细胞中积累(图5A). 这些改变在菲律宾比索−/−PHB2补充的电池(图5A).

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PHB2控制OPA1的分裂，但不影响呼吸活动。(A类)免疫印迹分析菲律宾比索飞行/飞行和菲律宾比索飞行/飞行■Phb2用Cre重组酶转导的细胞。通过SDS-PAGE和免疫印迹分析细胞裂解产物，使用OPA1特异性、PHB1特异性、pH B2特异性和β-肌动蛋白特异性抗体作为对照。(B类)禁令缺乏MEF中线粒体膜电位的维持。所示细胞系用荧光染料JC-1染色，并在590nm处用流式细胞仪进行分析。以CCCP和未染色细胞的膜电位耗散作为对照。(C类)渗透控制中的耗氧量(n个= 5; 白色条）和博士2−/−MEF公司(n个= 3; 黑条）菲律宾比索在底物驱动的呼吸条件下。数据表示平均值±标准偏差。(天)对照组呼吸链和TCA循环酶的相对活性(n个=5，白色条）和菲律宾比索−/−MEF公司(n个=4，黑条）菲律宾比索（CII）琥珀酸醌二氯苯酚靛酚还原酶；（CII+CIII）琥珀酸细胞色素c（c）还原酶；（CIII）癸基双喹啉细胞色素c（c）还原酶；（CIV）细胞色素c（c）氧化酶；（CS）柠檬酸合酶；（IDH）异柠檬酸脱氢酶。数据表示平均值±标准偏差。

线粒体功能障碍和跨内膜的膜电位耗散可导致OPA1处理和线粒体断裂(Duvezin-Caubet等人，2006年;Ishihara等人，2006年)在没有PHB2的情况下，可能导致S-OPA1积聚。因此，我们评估了菲律宾比索−/−JC-1染色细胞和荧光激活细胞分选(图5B). PHB2缺陷细胞的膜电位保持不变(图5B). 此外，在没有PHB2的情况下，细胞ATP水平、细胞耗氧量和内膜呼吸复合物的酶活性均不受影响(图5C、D; 补充图S5）。因此，PHB2缺陷细胞中OPA1的加速处理不是由膜电位或呼吸活动受损引起的。

以下方面的不足菲律宾比索−/−细胞是由L-OPA1的丢失引起的

PHB2缺陷细胞中L-OPA1的选择性丢失可能解释了异常线粒体的积累和细胞凋亡敏感性的增加菲律宾比索−/−细胞朝向凋亡刺激。为了检验这种可能性，我们暂时用博士2飞行/飞行由于加工位点两侧的氨基酸残基不能被裂解的OPA1的标记亚型1细胞被删除（L-OPA1Δ) (Ishihara等人，2006年). 同时，由短型OPA1（氨基酸230–997）组成的标记杂交蛋白融合到AIF的线粒体靶向序列（氨基酸1–95；S-OPA1），在菲律宾比索飞行/飞行单元格(图6A).菲律宾比索通过Cre转导删除，并通过免疫印迹分析监测OPA1变体的表达(图6B). 转染L-OPA1后，在细胞中检测到OPA1的长亚型ΔPHB2缺乏的对照细胞中没有(图6B). 线粒体靶向红色荧光蛋白与L-和S-OPA1共表达后菲律宾比索−/−用荧光显微镜观察线粒体的形态。虽然～90%的PHB2缺陷细胞含有支离破碎的线粒体，但L-OPA1的表达Δ约50%的细胞恢复了管状线粒体(图6C、D). 另一方面，S-OPA1的表达并没有显著影响线粒体的形态(图6C、D).

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L-OPA1的表达Δ恢复线粒体形态菲律宾比索−/−细胞。(A类)使用OPA1变体的互补实验流程图。MEF在4小时内瞬时转染两次，转染质粒并进行Cre转染。再培养72小时后，通过免疫印迹和荧光显微镜对细胞进行分析。(B类)免疫印迹分析菲律宾比索飞行/飞行如图所示，用质粒转染MEF并用Cre-relubise转染MEFs。分别用OPA1和Flag特异性抗体检测内源性OPA1亚型和转染的Flag标记OPA1变体。箭头指示L-OPA1的存在Δ转染后在PHB2缺失的MEF中。β-肌动蛋白作为负荷对照。(C类)L-OPA1表达后抑制性缺陷MEF中管状线粒体的修复Δ.菲律宾比索飞行/飞行用丝裂原-DsRed和所示质粒转染补充PHB2的细胞，用Cre-rewise处理，72小时后用荧光显微镜进行分析。棒材，10μm。(天)用mito-DsRed和OPA1变异体转染的禁令缺陷型MEF中线粒体形态的量化。对含有管状（黑条）或碎片状（白条）线粒体的细胞进行分类。在三个独立的实验中，对200多个细胞进行了评分。(**)P（P）< 0.01. 误差线表示±标准偏差。(E类)椎体嵴形态的修复博士2−/−L-OPA1表达后的细胞Δ用所示质粒转染MEF，并通过透射电镜评估线粒体形态。条形，500 nm。(F类)椎体嵴形态缺陷的量化菲律宾比索−/−S-OPA1和L-OPA1表达后的细胞Δ每个实验对大约100个细胞切片进行评分。(***)P（P）< 0.001. 误差线表示标准偏差。

接下来，我们通过电子显微镜分析线粒体的超微结构菲律宾比索−/−表达PHB2、S-OPA1或L-OPA1的细胞ΔPHB2的表达恢复了>90%的正常嵴形态菲律宾比索−/−单元格(图6E、F). 引人注目的是，线粒体嵴也维持在～55%菲律宾比索−/−表达L-OPA1的细胞Δ(图6E、F). 相反，异常线粒体缺乏嵴，内含囊泡状内膜结构，形成于菲律宾比索−/−无论这些细胞中是否存在S-OPA1(图6E、F). 我们的结论是，OPA1亚型1的长变体足以在没有PHB2的情况下维持管状线粒体和正常嵴。需要注意的是，L-OPA1的表达Δ似乎替代了L1和L2亚型的缺失，表明功能冗余。总之，PHB2缺乏细胞线粒体的异常形态发生完全是由于缺乏长OPA1亚型所致。

在进一步的实验中，我们检测了L-OPA1的表达Δ还可以恢复菲律宾比索−/−细胞。L-OPA1瞬时表达后Δ或S-OPA1英寸菲律宾比索飞行/飞行单元格和删除博士2通过Cre转导，放线菌素D刺激细胞凋亡(图7A). 通过与线粒体靶向DsRed共转染鉴定表达OPA1变体的细胞，这使我们能够监测线粒体形态和细胞色素c（c）在相同的细胞中释放。S-OPA1的表达不能阻止线粒体断裂菲律宾比索删除（另请参见图6)也不会释放细胞色素c（c）在放线菌素D存在下从PHB2缺失的线粒体中提取(图7B–D). 相反，L-OPA1的表达Δ恢复管状线粒体并在很大程度上抑制细胞色素c（c）放线菌素D存在下的释放(图7B–D). 因此，PHB2稳定L-OPA1可以保护细胞免受凋亡。

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L-OPA1缺失博士2−/−易发生凋亡的细胞。(A类)使用OPA1变体的互补实验流程图。菲律宾比索−/−细胞在4小时内瞬时转染两次，转染质粒并进行Cre转染。在进一步培养72小时后，在放线菌素D（1μg/mL）的存在下培养细胞，并通过监测细胞色素来评估诱导凋亡c（c）释放和caspase激活。(B类)细胞凋亡抵抗的恢复菲律宾比索−/−L-OPA1表达后的细胞Δ.在Cre-transduction菲律宾比索飞行/飞行细胞和编码S-OPA1或L-OPA1质粒的转染Δ如图所示，细胞色素c（c）用细胞色素免疫荧光法监测释放c（c）-特异性抗体。核DNA用DAPI染色。显示了具有代表性的图像。棒材，10μm。(C类)细胞色素定量c（c）从补充了S-OPA1或L-OPA1的禁令缺失线粒体中释放Δ在三个独立的实验中，每个基因型大约有300个细胞被计数。(**)P（P）< 0.01. (天)补充S-OPA1或L-OPA1的禁令缺乏细胞线粒体形态的定量评估Δ并用放线菌素D刺激转染载体（白色条）、S-OPA1（灰色条）或L-OPA1的细胞中的管状线粒体Δ（黑条）被分类。在三个独立的实验中，每个基因型大约有300个细胞被评分。(**)P（P）< 0.01. (E类)L-OPA1的表达Δ促进菲律宾比索−/−细胞。S-OPA1和L-OPA1转染后监测抑制素缺乏MEF的生长Δ通过确定三H-胸苷进入DNA。数据表示四个独立实验的平均值±标准偏差。(*)P（P）< 0.05; (**)P（P）< 0.01.

这些结果表明，OPA1裂解的控制是线粒体内禁令的核心功能。由于细胞增殖依赖于线粒体靶向的PHB2，可以想象，PHB2缺陷细胞的增殖缺陷也是线粒体内OPA1加工受损的直接结果。因此，我们执行了三H-胸苷DNA标记实验博士2−/−瞬时表达S-OPA1和L-OPA1的细胞Δ(图7E). 虽然S-OPA1的存在并没有改善菲律宾比索−/−我们观察到L-OPA1表达后细胞增殖部分恢复，但具有统计学意义Δ(图7E). 这些发现表明，缺乏L-OPA1和线粒体形态缺陷会恶化PHB2缺陷细胞的增殖。

讨论

我们使用条件基因靶向菲律宾比索在MEF中定义禁令的细胞活动。PHB2确保细胞增殖，起抗凋亡作用，并保持正常嵴形态。由于PHB1和PHB2在功能上相互依赖菲律宾比索−/−细胞可归因于组装的禁止复合物的丢失。补体分析将其功能局限于线粒体，并确定内膜中动力样GTPase OPA1的处理是受抑制物控制的中央细胞过程。

禁欲缺乏细胞中含有高度紊乱和肿胀嵴的破碎线粒体与OPA1下调后观察到的线粒体极为相似(Olichon等人，2003年;Griparic等人，2004年). 我们对抑制素缺乏线粒体的实验将这些表型归因于L-OPA1亚型的选择性丢失，因此与最近的研究结果一致，这些研究结果证明了L-OPA1和S-OPA1对线粒体融合的需求(Song等人，2007年). 此外，L-OPA1的缺失解释了博士2−/−细胞凋亡。促进细胞色素c（c）线粒体嵴在细胞凋亡的早期阶段从膜间释放出来，这一过程由OPA1控制(Frezza等人，2006年). 目前的模型表明，含有L-OPA1和S-OPA1的复合物控制线粒体嵴连接并阻止细胞色素的重新分布c（c）从晶体腔到周围膜间隙(Frezza等人，2006年). 因此，L-OPA1的损失菲律宾比索−/−细胞可能促进细胞色素c（c）从嵴内隔室释放。然而，替代模型也是可以想象的。最近对细胞凋亡过程中线粒体转化的层析分析表明，有效的细胞色素不需要嵴重塑c（c）释放(Sun等人，2007年). 在诱导细胞凋亡和细胞色素后不久，在HeLa细胞中观察到含有囊泡线粒体结构的带电线粒体c（c）释放(Sun等人，2007年). 这很让人想起菲律宾比索−/−细胞，这些细胞是充满活力的，没有凋亡，但更容易受到凋亡刺激。因此，似乎预先存在的线粒体超微结构改变菲律宾比索−/−刺激后，细胞会促进凋亡程序的进展，这是触发细胞色素的必要条件c（c）释放。一贯地，L-OPA1的表达替代了禁令的缺失，并保护了禁令缺陷细胞的凋亡，表明PHB2通过OPA1发挥其抗凋亡功能。然而，由于L-OPA1缺失而导致的嵴形态改变如何触发线粒体对外膜渗透性的敏感性增加，尚待确定。值得注意的是，我们没有观察到先前描述的S-OPA1的抗凋亡作用(Cipolat等人，2006年). 这种明显的差异可以解释为菲律宾比索−/−本研究中使用的细胞，而之前的实验中S-OPA1在野生型成纤维细胞中过度表达(Cipolat等人，2006年). 因此，S-OPA1可能仅在与L-OPA1复合物中发挥其抗凋亡作用。

我们在菲律宾比索−/−MEF限制了禁令对线粒体的作用，并没有提供任何非线粒体活动的证据。The proliferation of菲律宾比索−/−细胞只有在线粒体靶向PHB2表达后才能恢复，线粒体定位的抑制因子在细胞增殖中起着至关重要的作用。L-OPA1的表达Δ不仅恢复了线粒体的形态发生博士2−/−细胞及其对凋亡的抵抗，也促进了禁令缺陷型MEF的增殖。这些发现直接关联了菲律宾比索−/−细胞线粒体形态发生缺陷。线粒体形态受损如何影响细胞增殖尚待确定。在没有抑制剂的情况下，细胞ATP水平和呼吸没有受到严重影响，这表明线粒体控制细胞增殖独立于其对细胞能量代谢的功能。

禁令如何影响线粒体内OPA1的处理？OPA1断裂与线粒体的能量状态相关，并在细胞凋亡时被诱导(Duvezin-Caubet等人，2006年;Baricault等人，2007年). 然而，删除菲律宾比索不影响线粒体膜电位或呼吸活动，PHB2缺陷细胞也不会在没有刺激的情况下发生凋亡，这表明OPA1的断裂受到抑制剂的直接控制。作为的缺陷博士2−/−L-OPA1可以拯救细胞，对OPA1的生物发生或折叠起抑制作用似乎不太可能。相反，L-OPA1的丢失和S-OPA1亚型的积累菲律宾比索−/−细胞表明，在缺乏PHB2的情况下，L-OPA1亚型不稳定，加工更容易。这让人想起在酵母中发现的情况，在酵母中，禁止基因的缺失导致未组装的内膜蛋白被米-AAA蛋白酶(Steglich等人，1999年). 大型禁令和米-线粒体内膜中存在AAA蛋白酶(Steglich等人，1999年). 此外，在酵母中进行的重组实验表明，各种哺乳动物米-AAA蛋白酶同工酶能够裂解OPA1(Duvezin-Caubet等人，2007年). 值得注意的是，几种肽酶似乎在不同位置调节OPA1的裂解(Cipolat等人，2006年;Ishihara等人，2006年;Duvezin-Caubet等人，2007年;Griparic等人，2007年;Song等人，2007年). 与其他OPA1亚型相比，S4似乎由我-AAA蛋白酶Yme1L(Griparic等人，2007年;Song等人，2007年). 在缺乏的情况下，它以降低的水平积累菲律宾比索−/−细胞，表明抑制物可能通过各种肽酶调节OPA1的裂解。

我们建议禁止物作为内膜中的支架，并定义控制OPA1稳定性和加工以及协调膜融合的成分的空间组织。环状禁令复合物可能隔离OPA1并招募米-AAA蛋白酶到膜结构域参与融合过程。考虑禁令与脂筏相关蛋白的序列相似性(Tavernarakis等人，1999年;Langhorst等人，2005年;莫罗和帕顿2005)，抑制物也可能促进膜脂的横向分离，从而形成脂质微区。周围的膜脂可能会影响OPA1的载体膜错位或OPA1的蛋白水解活性米-AAA蛋白酶。此外，越来越多的证据表明，脂质和脂质微结构域在各种细胞融合事件中起着重要作用(Fratti等人，2004年;Altmann和Westermann 2005;Boukh-Viner等人，2005年;Choi等人，2006年)和凋亡过程(Choi等人，2007年). 现在，作为线粒体嵴形态调节器的抑制剂的鉴定为详细了解空间膜组织在线粒体形态发生和功能中的作用铺平了道路。

材料和方法

条件的生成菲律宾比索老鼠

小鼠条件等位基因的靶向载体菲律宾比索通过在两个外显子之间插入包含外显子3和4的1.4kb基因组片段生成液氧磷pRAPIDflim载体的位点（A.Bruehl和A.Waisman，未解释）。上游2.2kb片段和下游4.5kb片段用作同源臂。此外，目标构造包含一个FRT公司-侧翼PGKneoR盒和单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（HSV-TK）分别用于阳性和阴性选择。转染前通过SwaI消化使最终构建物线性化。

Bruce-4 ES细胞(Kontgen等人，1993年)如前所述，转染、培养和选择C57BL/6小鼠(库恩和托雷斯2002). 使用外部和内部基因组探针通过Southern印迹法筛选G418-和耐更昔洛韦ES细胞集落（补充图S1）。

通过注射博士2fl（新）/+胚胎干细胞从CB20小鼠变成囊胚。雄性嵌合体与C57BL/6雌性嵌合体交配，产生纯C57BL-6遗传背景的生殖系传递后代。

体内缺失FRT公司-侧翼PGKneoR盒式磁带菲律宾比索佛罗里达州/+通过将雄性生殖系传播小鼠与FLPe-delete小鼠杂交获得小鼠(罗德里格斯等人，2000年).菲律宾比索佛罗里达州/+将小鼠杂交以获得纯合子菲律宾比索飞行/飞行应变。通过杂交产生杂合PHB2缺失小鼠博士2佛罗里达州/+Cre-Deleter株小鼠(Schwenk等人，1995年). 利用从尾部活检中分离的基因组DNA，通过PCR对小鼠进行基因分型。PCR引物序列可根据要求提供。所有动物的护理都在机构动物护理委员会的指导方针范围内。

克隆过程

菲律宾比索从C57BL/6小鼠肝脏cDNA中扩增并亚克隆。使用QuikChange定点突变试剂盒（Stratagene）引入突变。对于PHB2的无细胞合成，菲律宾比索克隆到pGEM4（Promega）中，通过SP6-RNA聚合酶进行表达。全长和截断菲律宾比索克隆到pEGFP-N3（Clontech）中，与EGFP产生C端框内融合。

为了获得能够产生稳定细胞系（pCAGs–STOP–IRES–EGFP）的Cre诱导表达质粒，我们将鸡β-actin启动子（CAGs）插入pSTOP–ERES–EGFP的PacI位点(Sasaki等人，2006年)和子克隆菲律宾比索和突变变异体。

Cre重组酶对MEFs的转导

如前所述表达并纯化重组His-TAT-NLS-Core（HTNC）融合蛋白(Peitz等人，2002年). HTNC在DMEM/PBS中稀释至最终浓度为3-5μM，无菌过滤，并应用于细胞培养皿中生长的MEF。培养细胞20小时，用PBS洗涤，并补充生长培养基。重组效率通过以下方法进行评估菲律宾比索等位基因特异PCR。

细胞增殖评估

MEF（1×106)用Cre重组酶转导，60小时后通过胰蛋白酶消化收集。置于96周的组织培养板上，1×104每孔接种细胞并标记12 h（1μCi三H-胸苷/孔）。采集MEF并在玻璃纤维过滤器上发现。合并三H-胸腺嘧啶核苷用微孔板闪烁β计数器测定。

荧光显微镜

对于博士2本地化研究，1×105MEF被镀在玻璃盖玻片上，并使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）转染所示质粒。转染48小时后，细胞固定在4%第页-甲醛和DAPI染色。使用蔡司Axioplan显微镜采集图像，并使用AxioVision软件（蔡司）进行处理。

使用GeneJuice转染试剂（Merck Biosciences）转染mito-DsRed或pEYFP-mito（Clontech）检测线粒体形态。MEF（2×105)将其涂布在盖玻片上，并用所示质粒转染两次。使用DeltaVision显微镜系统分析线粒体形态。采集了25个堆栈，并进行了反褶积。

细胞色素c（c）用免疫荧光显微镜监测释放情况。MEF（2×105)在盖玻片上生长，转染两次，并用Cre-rewise转导。用放线菌素D（1μg/mL）处理MEF 5 h，固定在4%第页-甲醛，然后用0.15%Triton X-100在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中渗透15分钟。在封闭缓冲液（PBS中的3%牛血清白蛋白）中培养1小时后，用α-细胞色素处理细胞12小时c（c）抗体（BD Biosciences）。MEF用封闭缓冲液清洗三次，每次5分钟，用Alexa Fluor 488α-小鼠二级抗体（分子探针）孵育2小时，并用DAPI染色。在用封闭缓冲液进行三个清洗步骤各5分钟后，安装细胞并使用DeltaVision显微镜系统获取图像。

透射电子显微镜

MEF（2×105)将细胞镀在玻璃盖玻片（厚度0.2 mm）上，转染、转染Cre并平铺以进行透射电镜观察，如下所示：72 h后，将细胞固定在0.1 M HEPES/KOH（pH 7.2）、4 mm CaCl中2，和2.5%戊二醛在室温下保持4小时。用0.1 M HEPES/KOH（pH 7.2）、4 mM CaCl冲洗三次后2，细胞在4°C下于1%四氧化锇中固定45分钟，在蒸馏水中冲洗三次，并在4%醋酸铀酰中培养1小时。根据标准程序，在分级乙醇系列中对样品进行脱水、用Epon渗透和扁平包埋。切割超薄切片（40–70 nm），并将其安装在涂有吡氯福林的铜网格（Plano）上。切片用柠檬酸铅和醋酸铀酰染色，并用蔡司CEM 902透射电子显微镜（卡尔蔡司）在80 kV下观察。使用EMS EM胶片（Maco）拍摄显微照片。使用IMOD软件3.5.5版从扫描胶片上制备三维重建(Kremer等人，1996年).

细胞死亡分析

TUNEL染色，1×105MEF生长在六孔板的玻璃盖玻片上，在需要时用Cre-relubise处理，培养72小时。细胞固定在4%第页-甲醛10分钟后，在PBS中洗涤，使用死端荧光TUNEL系统（Promega）进行TUNEL染色。

MEF（2×106)转染两次，用Cre-regusise转染，并进一步培养72h。为了刺激诱导凋亡，用TNFα（20 ng/mL和2.5μg/mL环己酰亚胺）、足叶乙甙（10μM）、放线菌素D（1μg/mL）或staurosporine（1μM）处理细胞5h，并用免疫印迹法分析细胞裂解物。

致谢

我们感谢K.Mihara提供的OPA1表达质粒和Gudrun Zimmer提供的专家技术援助。这项工作得到了德意志联邦基金会、欧盟（第六框架计划）和德国伊斯雷利项目（DIP赠款F.5.1）对T.L.的资助。

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文章来自基因与发育由以下人员提供冷泉港实验室出版社