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《公共科学图书馆·病理学》。2008年2月；4（2）：e25。
2008年2月1日在线发布。 数字对象标识：10.1371/日志.ppat.0040025
预防性维修识别码：项目经理222952
PMID：18248095

γ-疱疹病毒68病毒BCL-2抑制自噬和细胞凋亡的结构和生化基础

Ku邦苏,#1 Jae-Sung Woo先生,#1 华裔科学家梁澄玉,2 Kwang-Hoon Lee（李光勋）,1 Hyang-Suk Hong公司,1 小飞E,2 金钥匙（Key-Sun Kim）,三 Jae U Jung先生,2和Byung-Ha哦1,*
克劳斯·弗鲁，编辑器
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补充资料

摘要

所有γ-疱疹病毒都表达抗凋亡B细胞淋巴瘤-2（BCL-2）的同源物，以对抗宿主抗病毒防御机制清除受感染细胞。为了深入了解这些病毒BCL-2蛋白的作用机制，我们对小鼠γ疱疹病毒68的病毒BCL-1 M11与前自噬Beclin1和BCL-2同源物3（BH3）片段的相互作用进行了结构和生化分析从一系列促凋亡BCL-2家族蛋白中提取的含域肽。M11主要通过疏水相互作用结合Beclin1的BH3样结构域，解离常数为40毫摩尔，与细胞BCL-2和Beclin2之间的1.7毫摩尔结合亲和力相比，亲和力明显更强。一直以来，M11抑制NIH3T3细胞自噬的效率高于BCL-2。M11还与BAK的BH3结构域肽以及上游BH3-only蛋白BIM、BID、BMF、PUMA和Noxa的BH3区域肽紧密相互作用，但与BAX的BH3域肽作用较弱。这些结果共同表明，M11除了以与细胞BCL-2相似但不同的方式广泛中和促凋亡BCL-2家族外，还有效抑制Beclin1，并且Beclin1-介导的自噬可能是病毒的主要靶点。

作者摘要

在高等动物中，缺陷或过剩的细胞通过一种称为凋亡的过程被清除。另一方面，缺陷或损坏的细胞成分通过一种称为自噬的过程被清除。这两个破坏性的过程对生物体的生存和发展是不可或缺的。虽然细胞凋亡被认为是一种清除病毒感染细胞的中央宿主防御机制，但自噬在病毒感染中的作用最近才出现。许多病毒表达病毒蛋白库，以对抗细胞死亡介导的先天免疫控制。其中一种蛋白质是细胞BCL-2蛋白的同源物，它通过与促凋亡蛋白的抑制性结合来抑制凋亡。小鼠γ疱疹病毒68也编码一种病毒BCL-2，称为M11。在本研究中，我们定量测量了M11对其潜在细胞靶点的结合亲和力，包括十种不同的促凋亡蛋白和促自噬蛋白Beclin1。我们发现M11广泛中和促凋亡蛋白，而不是选择性抑制凋亡。令人惊讶的是，M11与Beclin1结合的亲和力最高，这与其在细胞中的强烈抗自噬活性有关。这些数据表明，M11不仅能抑制细胞凋亡，而且能有效地抑制自噬，最终导致病毒的慢性感染。

介绍

γ-疱疹病毒是DNA病毒，包括疱疹病毒科这些病毒，包括EB病毒、卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）和小鼠γ疱疹病毒68（γHV68），是人类或动物淋巴和上皮肿瘤的病原体[1,2]。所有γ-疱疹病毒编码至少一种细胞凋亡抑制剂BCL-2的同源物，这些病毒BCL-2基因的表达可在各种凋亡诱导条件下防止细胞死亡[三–6]。特别是，γHV68的BCL-2同源物的关键作用已由在体外和体内γHV68病毒发病机制的研究。这种蛋白质，在这里被称为M11，保护细胞免受多种因素诱导的凋亡，如地塞米松治疗、γ射线照射、CD3结扎[7]、肿瘤坏死因子治疗[8,9]、Fas结扎[9]和Sindbis病毒感染[10]。此外，该蛋白有助于建立潜伏期[11]在缺乏γ-干扰素的免疫缺陷小鼠中，在病毒慢性感染期间，它需要有效地从潜伏期中重新出现以及持续复制[12]。这些数据表明，通过细胞死亡清除病毒感染的细胞是宿主抵抗病毒感染的中心防御机制，病毒BCL-2蛋白通过抑制宿主细胞的死亡在病毒复制过程中发挥关键作用[1,13,14].

BCL-2家族蛋白通常被称为凋亡的阳性或阴性调节因子，其特征是包含多达四个保守的氨基酸片段，称为BCL-2同源结构域[15,16]。BH3-only蛋白是一组促凋亡的BCL-2家族，包括BIM、BAD、PUMA和Noxa，感知产生信号并最终激活下游促凋亡成员BAX和BAK[17,18]。活化的BAX和BAK导致线粒体功能障碍，并导致促凋亡分子的释放，如细胞色素c（c）[19,20]。促凋亡BCL-2家族成员与抗凋亡成员如BCL-2和BCL-X之间的相互作用L（左）是控制或促进细胞凋亡的关键事件[15,16]。这些相互作用由促凋亡成员的BH3结构域介导，该结构域与抗凋亡成员中称为BH3结合沟的位点结合[21,22].

除了在细胞凋亡调控中发挥关键作用外，BCL-2家族蛋白还成为自噬的调节因子，自噬是一种分解代谢过程，通过溶酶体途径降解细胞质成分，在细胞存活、肿瘤抑制和对细胞内病原体的先天免疫防御中发挥关键作用[23–25]。主要工作是将Beclin1鉴定为BCL-2相互作用蛋白[26]。一系列后续研究表明，Beclin1促进自噬，作为包含III类磷脂酰肌醇3-激酶（PI（3）KCIII）和抗紫外线辐射相关基因（UVRAG）的多蛋白复合物的组成部分[27–29]BCL-2负调节Beclin1的自噬促进活性[30]而BH3-only蛋白BAD通过干扰BCL-2或BCL-X的相互作用发挥自噬刺激功能L（左）与Beclin1[31]。虽然Beclin1与BCL-2家族蛋白没有整体序列同源性，但最近报道的BCL-X的结构L（左）在与Beclin1肽的复合物中，发现Beclin 1中存在一个新的BH3结构域，该结构域与BCL-X的BH3结合沟结合L（左）[32]。正如细胞皮肤观察到的那样，KSHV或γHV68的病毒BCL-2蛋白的表达以Beclin1结合依赖的方式显著抑制自噬[28,30]这表明这两种病毒BCL-2蛋白可能作为自噬抑制剂和凋亡抑制剂发挥作用。

在本研究中，我们确定了M11与含有BH3-样结构域的50个残基Beclin1片段的复合物的结构。后续分析表明，M11通过更紧密的疏水相互作用与Beclin1的结合比细胞BCL-2紧密得多。持续、瞬时表达的M11比细胞BCL-2更有效地抑制自噬体的形成。我们还量化了M11与来自凋亡介质BAX和BAK的BH3肽以及上游八个BH3-only促凋亡分子BAD、BIK、BIM、BID、BMF、PUMA、Noxa和Hrk的相互作用，但BAX和Hrk相对较低。在所观察到的亲和力图谱中，M11与细胞BCL-2以及M11L有显著不同，M11L是粘液瘤病毒的毒力因子，是BCL-2的结构模拟物，主要通过隔离BAX和BAK发挥作用[33]。这些数据表明，M11强烈抑制Beclin1依赖的自噬，并广泛中和促凋亡BCL-2家族以破坏宿主抗病毒反应。

结果

Beclin1与M11的相互作用

小鼠Beclin1由448个氨基酸组成。通过共表达试验，我们发现小鼠Beclin1片段由101-150个残基组成，跨越由105-125个残基构成的BCL-2结合区（对应于人类Beclin2的107-127个残基[32])与M11形成紧密复合物，缺少C末端疏水尾。与Beclin1（101–150）复合物中的蛋白质结晶，其结构测定为2.3º分辨率(表1). Beclin1的残基106–124形成α螺旋并在与BCL-X的BH3结合槽相对应的延伸疏水表面裂缝处结合M11L（左）[7] (图1A） ●●●●。在晶体中，Beclin1（101-150）肽的N端5和C端26残基被扰乱。Beclin1（101–150）的结合引起M11的构象变化，重塑BH3结合槽(图1B） 。残基53–55是游离M11中α2的一个环段尾，在Beclin1（101–150）结合M11中形成α2的额外螺旋圈(图1B） 。此外，α3和接下来的片段经历了一个重要的构象转变，涉及到几个残基在距离为4–10μ(图1B） ●●●●。

表1

数据收集和结构优化统计

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M11–Beclin1（101–150）配合物的结构和结合分析

（A） 功能区绘图（左）和曲面表示（右）。M11为粉红色，而Beclin1螺旋线为绿色。初级序列图上的粉红色和绿色区域表示用于结构测定的M11和Beclin1片段。“HT”、“CCD”和“ECD”分别表示疏水尾结构域、螺旋结构域和进化保守结构域。Beclin1只有19个氨基酸显示出明确的电子密度。省略Beclin1螺旋的M11表面呈现表明BH3结合槽主要是疏水性的。表面着色方案如下：Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Met和Ala的橄榄色；Cys、Gly、Tyr和Pro为黄色；灰色表示其他氨基酸。

（B） Beclin1结合导致M11构象发生较大变化。为了清晰起见，仅显示了M11的BH3结合槽区域。Beclin1（101-150）结合M11（粉红色）和游离M11（青色）叠加。结合的Beclin1肽呈绿色。M11的螺旋α3经历了明显的构象变化。箭头表示M11中Asp59和Tyr60的Cα原子的运动。

（C） ITC分析。通过将0.1 mM M11滴定为5μM所示Beclin1片段进行测量。这个K（K） 天根据添加的配体每摩尔积分热量的曲线拟合推导出数值，并汇总在表中。

（D） M11与内源性Beclin1相互作用。用HA标记的M11转染NIH3T3细胞，并使用全细胞裂解物用抗HA进行免疫沉淀，然后用抗Beclin1进行免疫印迹

为了测试晶体结构是否反映Beclin1与M11在溶液中的相互作用，并确定其相互作用的强度，我们使用等温滴定量热法（ITC）进行了定量结合分析(图1C和表S2). 我们使用了一个含有101-267残基的Beclin1片段（称为Beclin 1（101-267）），因为该片段在大肠杆菌而Beclin1（101-150）则不是。这个大的Beclin1片段与M11紧密结合，具有明显的离解常数(K（K） 天)40 nM(图1C） ●●●●。相似的结合亲和力(K（K） 天99 nM）），用合成的Beclin1（101-125）肽观察到(图1C） ●●●●。相反，由101-116残基组成的较短Beclin1片段没有与蛋白质相互作用的迹象（未显示）。出乎意料的是，一种合成的Beclin1（106–125）肽显示出相当低的结合亲和力(K（K） 天M11为1.6μM）(图1C） ，这表明Beclin1的101-105残基在Beclin 1肽与M11的相互作用中是一个重要的片段，尽管这五个残基在晶体中是无序的，因此不可能与M11相互作用。以前的研究表明，BAD肽的残基140–144和161–164通过增加肽的螺旋倾向而不是通过与BCL-X相互作用来促进结合亲和力L（左）[34]。类似地，圆二色性（CD）光谱分析表明，在30%三氟乙醇（TFE）溶液中，Beclin1（101-125）肽的螺旋含量（29.6%）比Beclin 1（106-125）肽链（17.0%）高很多(图S1). 数据支持这样的观点，即Beclin1的101-105残基通过增加以下片段的螺旋倾向，促进Beclin 1（101-125）肽与M11的结合。总之，M11以强大的高亲和力与Beclin1结合，Beclinl的101-125残基构成了足以与M11结合的最小区域。在NIH3T3细胞中，我们可以很容易地检测到瞬时表达的全长M11和内源性Beclin1之间的相互作用(图1D） ●●●●。

与BCL-X的比较L（左）–BAD综合体

细胞抗凋亡BCL-2家族成员在BH1、BH2和BH3结构域中具有较高的序列同源性，这些结构域构成了常见和特征性的BH3结合沟[35]。乍一看，M11和Beclin1（101-150）之间的分子间相互作用类似于细胞抗凋亡BCL-2亲属的BH3-结合沟与含BH3-结构域的肽或片段之间的相互作用[21,22,36]。为了进行详细的结构比较，我们使用了BCL-X的晶体结构L（左）与BAD复合，我们已确定分辨率为2.3º(表1)其中27个BAD残基与BCL-X结合L（左）作为一个延伸的α-螺旋，所有剩余的残基都是完全无序的。基于结构比较的序列比对显示，促凋亡BH3结构域内五分之四的残基对其与BH3结合槽的相互作用至关重要[21]在Beclin1中保守为Leu110、Leu114、Asp119和Phe121(图2A和​和2B）。2B） 。BH3结构域中的剩余残基为异亮氨酸或蛋氨酸，在Beclin1中被替换为Thr117。这五个残基在M11的BH3-结合槽处占据空间和化学等效位置，作为BAD与BCL-X结合的相应残基L（左）(图2A） ●●●●。涉及BCL-X的其他结构比较L（左）–BAK、BCL-XL（左）–BIM和MCL-1–BIM复合物得出了相同的结论，因为这五个残基在BAD、BAK和BIM的BH3结构域中保守(图2B） 它们在BCL-X的BH3结合槽处占据同等位置L（左）或MCL-1(图S2). Beclin1的Thr117侧链羟基位于疏水环境中，因此，与标准BH3结构域中的异亮氨酸或蛋氨酸相比，该残基对螺旋槽相互作用的贡献似乎微不足道或不利。Thr117在脊椎动物的Beclin1直系同源物中是保守的，但在低等生物中不保守(图2C） ●●●●。这个位置的苏氨酸可能被用来调节Beclin1对细胞BCL-2或BCL-X的亲和力L（左）处于生理最佳水平。与标准BH3结构域的另一个显著差异是Beclin1α-螺旋具有一个由Val116、Leu120和Ile123组成的疏水性斑块，这些疏水性斑块不受BH3结合槽的屏蔽(图2D和第3章)，而其他BH3域，包括BAD域(图2D和第3章)，具有明显的两性恋性。Beclin1暴露的疏水残基在整个物种中都是相同或类似的保守的(图2C） 这表明它们可能发挥了迄今为止未知的重要作用。这些结构和序列比较表明，Beclin1具有非典型的BH3结构域，其特征是苏氨酸取代和暴露的疏水补丁。

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Beclin1有一个BH3-样结构域，包含非典型苏氨酸和暴露的疏水补丁

（A） M11–Beclin1（101–150）（左）和BCL-X的结构比较L（左）–不良综合体（右）。M11和BCL-XL（左）显示为曲面模型。木条中显示的Beclin1和BAD残基对应于五个BH3残基，它们对与抗凋亡BCL-2家族成员的相互作用至关重要[21]。它们在两个结构物的BH3结合槽处占据同等位置。表面着色方案如下：Val、Leu、Ile、Tyr、Phe、Trp、Met和Ala为黄色；蓝色代表Lys、Arg和His；红色代表Glu和Asp；灰色代表其他氨基酸。

（B） 小鼠Beclin1的BH3-样结构域与各种BH3结构域的序列比较。保存的残留物以红色或粉红色列突出显示。箭头表示（A）中所示的五个BH3残留物。其中，Beclin1的Thr117（红色箭头）是不保守的。

（C） 序列对齐。Beclin1同源基因的BH3-样结构域对齐（mm，小鼠；hs，人类；xl，非洲爪蟾; 土耳其，红色Takifugu; dm、，黑腹果蝇; 供应链，酿酒酵母). 顶部的箭头表示BH3残留物，如（A）所示。这些残基在所有物种中都高度保守，除了Beclin1小鼠的Thr117，它只在脊椎动物中保守。结构中暴露的Beclin1保守疏水残基由底部的蓝色箭头指示。

（D） α-螺旋轮表示。与M11结合的Beclin1α-螺旋与与BCL-X结合的BADα-螺旋进行了比较L（左）Beclin1螺旋与BAD螺旋不同，在BH3结合槽的另一侧有一个疏水补丁（用星号表示）。

M11与Beclin1的相互作用比细胞BCL-2更紧密，对自噬的抑制作用更强

与M11和Beclin1（101-267）之间的强相互作用相反，我们发现BCL-2与Beclin2（101-277）之间的相互作用较弱K（K） 天1.7μM(图3A） ，类似于K（K） 天BCL-X之间相互作用的值（1.1μM）L（左）和一个Beclin1肽[32]。为了解释结合亲和力的巨大差异，我们将我们的结构与BCL-X进行了比较L（左）–Beclin1肽结构[32]。与950奥相比2BCL-X接口L（左）被22个Beclin1残基掩埋，M11的结合界面较小（8602)并且含有较少的Beclin1残基（总共16个残基）。然而，与BCL-X相比，M11的结合面与Beclin1的疏水相互作用更紧密L（左）(图3B） 。例如，Beclin1的Phe121与BCL-X的Ala93相互作用L（左），它与M11的相应但体积较大的残基Leu44相互作用(图3B） 。另一个显著的区别是，结合的Beclin1螺旋与M11的α3螺旋紧密相互作用，而与BCL-X中的相应区域相互作用较差L（左）(图3B） 电子密度一直很低(图S4)和高温因素[32]。由于这些以及结合相互作用中的其他差异，M11–Beclin1螺旋形成88个分子间碳-碳接触（距离<4.2º），而BCL-XL（左）–Beclin1螺旋进行了76次这样的接触，表明结合亲和力的显著差异源于疏水相互作用的形状互补性以及质量的差异。

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M11与Beclin1的相互作用比BCL-2和BCL-X紧密得多L（左）

（A） ITC分析。通过将0.1 mM M11或BCL-2滴定到5μM所示Beclin1片段中进行测量。这个K（K） 天这些值是从每摩尔添加配体的积分热的曲线拟合中推导出来的。

（B） M11–Beclin1接口比BCL-X接口更紧密L（左）–Beclin1。M11–Beclin1片段（左）和BCL-X的结构L（左）–并排比较Beclin1肽（右）。在这两种结构中，结合α螺旋和M11或BCL-X侧链的五个一致BH3残基L（左）与这些残留物的相互作用显示为棍子并标记。值得注意的是，Beclin1的N末端区域与M11的α3螺旋的相互作用比BCL-X中的相应区域更紧密L（左）–Beclin1螺旋线（用虚线圆圈表示）。

探讨M11和BCL-2/BCL-X结合亲和力的显著差异L（左）由于Beclin1（101-267）确实与它们的活性相关，我们测量了M11和细胞BCL-2的自噬抑制能力。为了量化自噬水平，使用微管相关蛋白1（GFP–LC3）的绿色荧光蛋白标记轻链3来指示自噬体的形成，自噬体能将细胞成分传递给溶酶体，以便在自噬过程中降解和再循环。GFP–LC3是自噬体的一种特异性标记物，在饥饿和雷帕霉素治疗等促进自噬的条件下，它从核周区进入自噬体膜[37,38]。在NIH3T3小鼠成纤维细胞中，瞬时表达的M11比瞬时表达的BCL-2更有效地抑制自噬体的形成，这从GFP–LC3阳性细胞携带自噬空泡的比率和每个细胞的自噬小体数量可以看出，而M11的表达水平远低于BCL-2(图4A和​和4B）。4B） 。M11和BCL-2的疗效呈剂量依赖性，因为自噬体结合细胞的比例随着转染载体数量的增加而降低(图4C） ●●●●。在这些分析中，M11（AAA），即BH3结合沟中含有三个保守残基（S85A、G86A和R87A）的丙氨酸取代的M11突变[7]几乎无法约束Beclin1[28]，与野生型蛋白相比，抗自噬活性显著降低(图4A、，​A、 4B、，4B、 和​和4C），4C） 表明Beclin1结合能力对M11的抗自噬活性至关重要。为了进一步比较它们的抗自噬能力，还对LC3抗体进行了免疫印迹。LC3-II是LC3前体（LC3-I）产生的一种裂解产物，在自噬过程中积聚在自噬体膜上，因此被广泛用作自噬处理的特异性标记[38,39]。在自噬诱导雷帕霉素处理的NIH3T3细胞中，M11的过度表达比BCL-2的过度表达更有效地抑制LC3-II的形成(图4D） ●●●●。这些数据共同表明，与细胞BCL-2相比，M11是一种更有效的自噬抑制剂，其效力与它们对Beclin1的结合亲和力直接相关。

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M11比BCL-2更有效地抑制NIH3T3细胞自噬体的形成

（A） 自噬的光镜定量。在用GFP–LC3表达质粒和编码所示蛋白的载体转染细胞后，将细胞保持在正常条件下或用2μM雷帕霉素处理4小时。M11（AAA）是一种M11突变体，在BH3结合槽处含有三个丙氨酸替换。自噬被量化为GFP–LC3阳性细胞的百分比（顶部）或每个细胞的自噬体数量（GFP–LCD阳性点）（底部）。M11的表达导致GFP–LC3阳性细胞或斑点少于BCL-2的表达。数据表示三个实验的平均值±标准差。M11、M11（AAA）和BCL-2的表达水平如下所示。

（B） 雷帕霉素处理细胞的共焦显微图像。使用倒置荧光显微镜检测GFP–LC3。箭头表示GFP–LC3标记的自噬体。

（C） 剂量反应。将GFP–LC3表达质粒转染NIH3T3细胞，同时增加编码所示蛋白的质粒数量。在转染后16–18小时，细胞接受2μM雷帕霉素处理4小时，并按照（A）所述定量自噬水平。

（D） LC3移动性转移。用抗LC3和抗微管蛋白抗体对拉法霉素处理的细胞的全细胞裂解物进行免疫印迹（左）。定量带强度的比率也显示（右）。未检测到LC3前体（LC3-I）的裂解形式（LC3-II），并且与表达BCL-2的细胞相比，表达M11的细胞中LC3-II/LC3-I的水平要低得多。数据表示三个实验的平均值±标准差。**，P（P）<0.005与矢量（学生t吨测试）。

M11与促凋亡BCL-2亲属BH3肽的相互作用

为了深入了解M11的抗凋亡活性，我们分析了凋亡介质BAX和BAK与M11之间的相互作用。首先，用HA标记的BAK或标记的BAX以及四种不同GST标记的前生存BCL-2蛋白（包括M11）分别转染293T细胞。这些蛋白质全部以全长形式瞬时表达。随后的免疫沉淀分析显示M11与BAK表现出紧密的相互作用(图5A、 左侧面板，泳道3）和与BAX的相对较弱的相互作用(图5A、 右侧面板，通道2）。正如预期的那样，M11与BAX和BAK的结合依赖于其完整的BH3结合沟，因为沟上的三重突变消除了结合相互作用(图5A） ●●●●。当然，M11与BAK的结合比BCL-2与BAK结合紧密得多(图5A、 左侧面板，通道6）。然而，与BCL-2与BAX结合相比，M11与BAX的结合似乎最多或较弱(图5A、 右侧面板，车道5）。在这种基于细胞的检测中，KSHV BCL-2也与BAK强烈相互作用(图5A、 左侧面板，车道5）。然而，几乎没有检测到它与BAX的相互作用(图5A、 右侧面板，车道4，和图S5)表明KSHV BCL-2对BAX的亲和力比M11差得多。这些结果表明，M11对BAK的抑制作用较强，而对BAX的抑制作用较弱，KSHV BCL-2对细胞凋亡的抑制可能不是通过中和BAX来实现的。接下来，我们量化了M11与包含BAX或BAK BH3结构域的26米肽的相互作用。在使用ITC的分析中，M11与BAX肽的相互作用较弱，显示出K（K） 天690 nM(图5B） 。相比之下，M11与BAK肽的相互作用更加紧密K（K） 天76 nM(图5B） 。这些测定的结合亲和力解释并与使用M11、BAX和BAK全长蛋白的基于细胞的结合分析相关联。我们注意到，16肽（残基69–84）较短，但跨越BAK的BH3结构域，产生了一条平坦的滴定曲线，无法推断其与M11的结合亲和力，因此需要更长的含BH3的BAK序列才能与M11紧密结合。结合试验表明，在NIH3T3细胞中很容易检测到M11与内源性BAK的相互作用(图5C） ●●●●。

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M11或BCL-2蛋白与BAX/BAK相互作用的分析

（A） 基于细胞的结合分析。将HA-标记的BAK或标记的BAX与GST-标记的前生存BCL-2蛋白一起转染293T细胞。用全细胞裂解物进行抗GST免疫沉淀，然后用抗HA或抗Flag免疫印迹。虽然在本次试验中未检测到GST–KSHV BCL-2与Flag–BAX相互作用的谱带，但在另一次试验中检测到微弱的谱带(图S5).

（B） M11与BAX或BAK的BH3肽的相互作用的ITC分析。通过将0.1 mM的指示肽滴定为5μM的M11进行ITC分析。显示了用于滴定26米BAK肽的ITC运行。推导出的K（K） 天值显示在表中。

（C） M11与内源性BAK相互作用。用HA标记的M11转染NIH3T3细胞，用全细胞裂解物与对照兔血清或抗BAK进行免疫沉淀，然后用抗HA进行免疫印迹。

同样使用ITC，我们接下来分析了作用于BAX/BAK上游的八种研究充分的BH3-only蛋白BAD、BIK、BIM、BID、BMF、PUMA、Noxa和Hrk的M11和BH3结构域肽之间的相互作用。这些BH3肽含有24到27个氨基酸，与陈使用的肽相同或长1到2个残基等。用于研究BH3-only蛋白和前生存BCL-2蛋白之间的相互作用[40]。在他们的研究中，BH3长肽似乎没有造成螺旋倾向降低的问题，因为它们能有效地结合至少一种BCL-2蛋白。考虑到这一观察结果和M11的短BH3结合槽，它可以被19个Beclin1残基完全跨越(图2A） ，我们得出结论，BH3肽的长度可能是最佳的。如所示图6和表S2M11与BIM、Noxa、BID、BMF和PUMA肽的相互作用相当紧密K（K） 天值范围为131-370 nM，而它与Hrk肽的相互作用较弱(K（K） 天719 nM）。然而，M11与BAD和BIK肽没有相互作用或相互作用不良，因此K（K） 天无法推断值。使用光学生物传感器，陈等。之前量化了细胞抗凋亡BCL-2亲属的整个队列与BH3-only蛋白的BH3结构域肽之间的相互作用[40]。将这些数据与我们的结果进行比较表明，M11在BH3结构域肽的选择性和亲和力方面与五种细胞BCL-2同源物中的任何一种都不同(表S1). 例如，虽然M11对Noxa肽具有很高的亲和力，但对BAD肽的亲和力可以忽略不计，BCL-2对这两种肽具有相反的结合亲和力(表S1). 重要的是，M11与BIM和PUMA的BH3结构域肽紧密结合，这两种肽具有强大的细胞杀伤活性，这可能是因为它们对所有五种BCL-2抗死亡亲属都具有选择性[40]。此外，M11对BAD和BIK的BH3结构域肽的结合亲和力极低，对BCL-2/BCL-X的选择性有限L（左）凋亡活性相对较差[40].

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M11与BH3-Only蛋白质BH3肽相互作用的ITC分析

显示了具有代表性的ITC运行M11与Noxa和BAD肽的相互作用，并且K（K） 天表中总结了通过该方法确定的值。

讨论

Beclin1成为M11的主要目标

BCL-2的一个新发现的功能是通过其与Beclin1的抑制性结合下调自噬，这似乎对细胞内环境稳定至关重要[30]。如其他人所示[32]在本研究中，BCL-2/BCL-XL（左）与仅与BH3蛋白（如BAD和BIM）的相互作用相比，与Beclin1的相互作用很弱[40]。弱相互作用解释了最近的观察结果，即内源性BH3-only蛋白通过取代BCL-2/BCL-X中的Beclin1诱导自噬L（左）[31]。与细胞皮肤一样，已知来自γHV68和KSHV的两种病毒BCL-2蛋白除了抑制细胞凋亡死亡外，还抑制自噬[28,30]。在本研究中，我们为M11与Beclin1的抑制性相互作用提供了结构基础，这令人想起BH3肽与BH3结合沟之间的典型相互作用。值得注意的是，M11与Beclin1（101–267）的结合比BCL-2更紧密。此外，结合的亲和力(K（K） 天M11和Beclin1（101–267）之间的差异大于M11和本研究中使用的10种不同BH3肽中的任何一种之间的差异。作为验证性实验，我们进行了置换试验，其中两种蛋白质之间的复合物受到另一种蛋白质的挑战。与我们的亲和力测量一致，M11–Beclin1（101–267）复合物与BIM、BID或Noxa肽孵育时保持完整(图S6A） ●●●●。相反，BCL-2–Beclin1（101–267）或BCL-XL（左）–Beclin1（101-267）复合物很容易被BAD或BIM肽破坏(图S6B） 。可以想象，与BCL-2/BCL-X相比，M11可以在诱导凋亡的条件下抵消BH3-only蛋白的促自噬作用L（左）观察到M11与Beclin1片段的强烈相互作用，这与其在NIH3T3细胞中的强烈抗自噬作用有关(图4)提示Beclin1可能是M11的主要靶点，抑制自噬可能有助于细胞的病毒感染。

病毒BCL-2同源物，包括M11，与细胞亲属共享有限的序列同源性[2]。尽管如此，KSHV BCL-2和M11的两个可用结构已经证明，它们在结构上与细胞亲属同源，并且具有一个显著的表面凹槽，可以结合来自促凋亡BCL-2家族成员的BH3结构域肽[7,41]。虽然已知的由α和γ疱疹病毒编码的BCL-2同源物彼此之间的总序列同源性仅为20-30%[2]我们注意到，与Beclin1片段相互作用的M11残基与其他疱疹病毒BCL-2蛋白的相应残基具有60-90%的序列相似性(图S7). 这一观察提出了一种可能性，即至少一些α和γ疱疹病毒BCL-2同源物可以与Beclin1的BH3-样结构域相互作用。此外，BCL-2的一些结构病毒模拟物，如粘液瘤病毒的M11L[33]和疫苗病毒N1[42]，也可能通过BH3结合槽与Beclin1相互作用。

M11广泛参与促凋亡BCL-2蛋白

病毒BCL-2同源物或模拟物如何抑制凋亡的潜在机制尚不清楚。也许粘液瘤病毒M11L在这方面最具特点。通过结构和生化分析，M11L被证明与BAX、BAK和BIM蛋白或肽紧密结合，但与其他促凋亡BH3蛋白无关[33]。使用一组在BH3结合沟处含有氨基酸取代的M11L突变体，证明M11L的生存作用在很大程度上取决于结合BAX和BAK[33]。该观察结果与一般预期一致，即病毒BCL-2更倾向于靶向BAX/BAK，而非上游BH3-only蛋白质[1]。与M11L的结合选择性相反，我们的定量结合分析表明，M11主要靶向BAK，而不是BAX，并且广泛参与除BAD和BIK以外的BH3-唯一蛋白质(图7). 在凋亡诱导条件下，对BAX具有弱结合亲和力的M11如何在激活的BH3-only蛋白浓度升高后对抗细胞凋亡？我们推测，M11对BH3-only蛋白子集（包括BIM、BID、BMF、PUMA和Noxa）的中和作用应该会阻止它们参与细胞增殖BCL-2靶点，这种保护作用将允许增殖蛋白的某些部分继续抑制BAX的激活。这种可能性与以下建议有关：所有BCL-2亲属都要检查BAX，而只有BCL-XL（左）MCL-1根据所谓的间接激活模型抑制BAK[18]。在这种情况下，虽然M11不能中和BAD和BIK，但MCL-1与BAD和BIK的亲和力很低[40]当M11在受感染的细胞中表达时，M11保存的其他生存蛋白分子可以抑制BAX。另一种可能性是M11通过中和BIM、BID和PUMA来抑制BAX激活，根据分级监管方案，这些物质被认为直接激活BAX/BAK[17]。尽管进一步的研究可能会阐明这一重要问题，但这里提供的数据，包括KSHV BCL-2与BAX的弱相互作用(图5A和第5章)表明病毒BCL-2同源物可能不一定针对BAX和BAK来抑制凋亡。

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M11作用机构模型

本研究中的结合分析表明，M11通过同时抑制细胞凋亡和自噬来对抗细胞死亡。表示M11负调控的箭头的变化厚度表示根据K（K） 天在本研究中确定并显示在箭头旁边的值。虚线表示BAX可能被M11抑制，但抑制程度很弱。尽管图中未显示，但受M11保护的细胞BCL-2蛋白可能隔离并抑制BAX（见正文）。PI（3）KCIII和UVRAG分别代表III类磷脂酰肌醇3-激酶和抗紫外线相关基因。

结束语

我们提供了M11如何破坏抗病毒宿主防御机制的结构和生化基础，这可能涉及细胞凋亡和Beclin1依赖性自噬。有必要进行进一步的研究，以评估Beclin1依赖性自噬作为抗病毒措施的重要性，并了解M11与Beclin 1在建立和/或维持病毒慢性生命周期中的强大相互作用的后果。我们的工作为进一步研究Beclin1依赖性自噬的抑制是M11和KSHV BCL-2的独特性质还是其他病毒BCL-2同源物或模拟物的一般特征提供了合理的基础。

材料和方法

M11–Beclin1（101-150）络合物的制备、结晶和结构测定。

编码M11（残基1-137）和小鼠Beclin1（残基团101-150）的DNA片段分别克隆到pET30a（Novagen）和pPROEX HTa（Invitrogen）中。从这些载体中，构建了一个双色载体，用于两种蛋白质的共表达。蛋白质复合物是在大肠杆菌BL21（DE3）菌株（Novagen）在21°C下过夜，并使用Ni-NTA柱（QIAGEN）、Hitrap Q阴离子交换柱（Amersham Pharmacia）和Mono Q阴离子交换柱（Amersham Pharmacia）纯化，用20mM Tris-HCl（pH 8.0）、220mM NaCl和1mM二硫苏糖醇平衡。通过混合并平衡1μl每种蛋白质溶液（10 mg/ml）和含有25%（w/v）聚乙二醇3350、0.2 M氯化镁和0.1 M咪唑（pH 7.0）的沉淀溶液，在24°C下通过悬挂滴蒸气扩散法获得络合物的晶体。在收集数据之前，将晶体短暂浸泡在低温保护剂溶液中，该溶液是贮存液加10%甘油。在韩国浦项加速器实验室的光束线4A上收集了分辨率为2.3º的衍射数据，并使用DENZO和SCALEPACK程序进行了处理[43]。通过分子替换法确定结构CCP4型MolRep版本[44]使用M11的结构[7]作为搜索模型。随后，使用程序O进行了模型构建和改进[45]和CNS[46]。最终模型不包括M11的残基1–4和136–137，以及Beclin1的残基团101–105和125–150，这些残基的电子密度未被观察到或非常弱。

BCL-X的制备、结晶和结构测定L（左）–BAD复合体。

小鼠BCL-X的DNA片段编码L（左）（残基1-196）克隆到pPROEX HTa中。该结构被用作缺失突变的模板，以产生BCL-XL（左）缺乏内部长环（残基45-84）和C末端尾部区域（残基197-235）。将小鼠BAD的DNA片段编码（残基43–204；对应于人类BAD的残基1–168）克隆到pET30a中。由这两个向量构建了一个双色载体。蛋白质复合物在大肠杆菌BL21（DE3）RIG菌株（Novagen）在21°C下过夜，并使用Ni-NTA柱、Hitrap Q阴离子交换柱和HiLoad 26/60 Superdex 75凝胶过滤柱（Amersham Pharmacia）进行纯化，用20mM Tris-HCl（pH 8.0）、100mM NaCl和1mM二硫苏糖醇进行平衡。通过混合并平衡1μl蛋白质溶液（5 mg/ml）和含有10%（w/v）聚乙二醇1000和10%（w/v）聚乙烯醇8000的沉淀溶液，在4°C下通过悬挂滴蒸气扩散法获得络合物的晶体。在收集数据之前，将晶体短暂浸泡在低温保护剂溶液中，该溶液为储液溶液加16%甘油。在日本Spring-8的光束线41XU上收集了2.3º的衍射数据。通过使用BCL-X的结构进行分子替换来确定结构L（左）[47]作为搜索模型。最终模型不包括BCL-X的31–44残基L（左），以及BAD的43–136和164–204残基。晶体学数据统计汇总于表1.

BCL-2家族蛋白和Beclin1片段的纯化。

编码M11（残基1–137）、小鼠BCL-X的每个DNA片段L（左）（残基1-44和85-196）或小鼠Beclin1（残基101-267）被克隆到pPROEX HTa中。还构建了含有人类BCL-2（残基1-50和92-207）编码DNA片段的质粒。由此产生的蛋白质缺乏内部长环（残基51–91），并且含有BCL-X残基33–48取代残基35–50L（左）如前所述，这是蛋白质溶解所必需的[48]。每个构造都被引入大肠杆菌BL21（DE3）菌株。蛋白质在21℃下过夜表达，并使用Ni-NTA柱和Hitrap Q阴离子交换柱纯化。

肽。

合成肽25-mer（Beclin1的残基101-125）、20-mer（Beclin的残基106-125），16-mer（BAK的残基69-84）、26-mer（BAK的残基65-90）、26-mer（BAX的残基52-77）、27-mer（BAD的残基137-163）、25-mer，24 mer（BMF的残基214–237）、26 mer（PUMA的残基130–155）、26 mer（Noxa的残基16–41）和26 mer（Hrk的残基26–51）购自Peptron（韩国）。

等温滴定量热法。

所有测量均在25°C的微量量热系统（MicroCal）上进行。用含有20 mM Tris-HCl（pH 7.4）和100 mM NaCl的溶液透析蛋白质样品。在测量之前，对样品进行20分钟的脱气和离心处理，以去除任何残余沉积物。在单独的实验中测量稀释焓（滴定液进入缓冲液），并从蛋白质和滴定液之间的结合焓中减去。使用Origin软件（OriginLab Corp.）分析数据。

自噬分析。

通过GFP–LC3再分配和LC3迁移率变化评估自噬。对于GFP–LC3再分布分析，将GFP–LC 3表达质粒与编码BCL-2、M11或M11（AAA）的载体一起转染NIH3T3细胞。转染后16–18 h，用倒置荧光显微镜检测在正常和2μM雷帕霉素处理的含有1%FBS的培养基下生长4 h的细胞中的GFP–LC3。在三个独立的实验中测定了点状染色的GFP–LC3阳性细胞的百分比。为了量化每个转染细胞的GFP–LC3阳性自噬体，计算了代表200个细胞的六个随机域。对于LC3迁移率转移分析，将转染有编码BCL-2、M11或M11（AAA）的载体的NIH3T3细胞在冰上处理30分钟，用1%Triton X-100进行裂解，然后用抗LC3抗体进行免疫印迹分析（圣克鲁斯生物技术）。

免疫沉淀分析。

融合蛋白GST–BCL-2、GST–KSHV BCL-2和GST–M11（AAA）分别克隆到pcDNA5/FRT/TO（Invitrogen）中，并与HA标记的BAK或标记的BAX一起在293T细胞中过度表达。HA-M11、HA-M11（AAA）和HA-BCL-2蛋白也分别克隆到pcDNA5/FRT/TO中，并在NIH3T3细胞中过度表达。收集细胞并在添加了完整蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche）的NP40缓冲液中进行裂解。免疫检测采用抗Flag（1:5000）（Sigma）、抗HA（1:5000。

圆二色光谱法。

数据收集在JASCO J-810型分光光度计上，该分光光度仪带有0.2 cm的比色杯。在氮气氛中，在200–250 nm范围内记录CD光谱，多肽溶解在40 mM磷酸钠缓冲液（pH 7.0）中，该缓冲液中含有0.1 mg/mL浓度的30%TFE。光谱是三次扫描的累积，通过从缓冲液控制中减去信号进行校正。222 nm（以毫度为单位）处的定律CD信号被转换为平均剩余椭圆度([θ]光突发事件，单位为度.厘米2 .二甲醇−1)使用方程式

方程式图像

哪里C类是肽浓度（毫摩尔浓度），n个是肽中的残基数量，以及我是路径长度（以厘米为单位）。螺旋的含量(F类 螺旋线)使用公式计算

方程式图像

其中[θ]螺旋线表示0°C下无限长完整螺旋的平均剩余椭圆度（−42500（1−3/n个)度.厘米2 .二甲醇−1)和[θ]线圈是0°C（640度）下完整随机线圈的椭圆度.厘米2.二甲醇−1) [49,50].

支持信息

图S1

Beclin1肽的螺旋性：

使用从显示的圆二色性光谱中获得的222 nm处的平均残基椭圆度计算30%TFE中所示Beclin1肽的α-螺旋含量。Beclin1（101-125）肽的螺旋含量远高于Beclin 1（106-125）肽类。

（257 KB TIF）

图S2

BCL-X的相互作用L（左）/MCL-1带BAK或BIM BH3域：

BCL-X公司L（左）和MCL-1显示为曲面模型。木条中显示的BAK和BIM残基是BH3结构域中的五个保守残基。它们在BH3装订槽处的位置与BAD中的位置相同(图2A） ●●●●。表面着色方案与图2答：。

（4.4 MB TIF）

图S3

与M11结合的Beclin1α-螺旋具有疏水性补丁：

M11和BCL-XL（左）显示为曲面模型。Beclin1和BAD残留物显示为棒状并贴上标签。Beclin1的三个外露疏水残基在BH3结合槽的另一侧形成疏水斑，用红色椭圆和标签表示。相反，结合的BAD螺旋不包含任何暴露的疏水残基。

（3.6 MB TIF）

图S4

Beclin1螺旋（以绿色显示）与M11（左侧）或BCL-X的相互作用L（左）（右）

这两个视图与最后的2个视图以相似的方向显示F类 o个-F类 c（c）图（1σ）分别为2.3Å和2.5Å。Beclin1结合界面的一部分，涉及BCL-X的α3螺旋（虚线圆圈）L（左）与M11的相应区域相比，电子密度较差。

（3.6 MB TIF）

图S5

KSHV BCL-2与BAX的交互比M11紧密得多：

用标记的BAX和GST–M11或GST–KSHV BCL-2转染293T细胞。使用全细胞裂解物进行抗GST免疫沉淀，然后进行抗Flag免疫印迹。

（215 KB TIF）

图S6

位移测试：

（A） 三个BH3肽未能取代与M11结合的Beclin1（101-267）。将M11与Beclin1（101–267）以1:1摩尔比混合并孵育1小时后，将BIM、BID或Noxa BH3肽添加到混合物中并再孵育1小时。M11–Beclin1（101–267）复合物保持完整。

（B） BIM和BID肽取代与BCL-2或BCL-X结合的Beclin1（101-267）L（左）BCL-2和BCL-X之后L（左）以1:4摩尔比与Beclin1（101–267）混合并培养1h，将BAD或BIM BH3肽添加到混合物中。BH3肽与BCL-2或BCL-X之间的复合物L（左）出现。凝胶上方的数字表示所示蛋白质和肽的最终浓度。图示有助于理解实验方案和结果。

（1.8 MB TIF）

图S7

多序列对齐：

对8个α和γ疱疹病毒BCL-2同源物的序列进行了比对（M11；KSHV BCL-2；RRV ORF16，恒河猴鼠疫病毒开放阅读框16；BHV4 BORFB2，牛疱疹病毒4 BORF2；HVS ORF16；赛米林疱疹病毒ORF16；EHV2 ORFE4、马疱疹病毒2 ORF E4）。星号标记表示11个M11残基与Beclin1螺旋在4.0°范围内发生疏水性接触，或与Beclin的Asp119发生亲水性接触。粉色条表示M11结构中的α螺旋，黑色条表示疏水尾（HT）。显示70%以上相似性的残留物被遮蔽。

（586 KB TIF）

表S1

BH3肽与M11或细胞BCL-2家族蛋白质相互作用的结合亲和力列表：

M11的结合亲和力是K（K） 天由ITC测定，而其他细胞BCL-2蛋白的相对值是由Chen报道的竞争结合分析测定的等。[40]。因此，必须比较结合轮廓，而不是结合亲和力。

（125 KB文档）

表S2

ITC确定的M11或BCL-2与指示片段或肽相互作用的热力学值列表：

（211 KB文档）

登录号

M11–Beclin1片段结构和BCL-X的坐标L（左）–BAD结构已存入蛋白质数据库(网址：http://www.rcsb.org/pdb/)分别具有登录代码3BL2和2BZW。本文中提到的结构坐标的登录号为M11（2ABO）、BCL-XL（左）（1AF3），BCL-XL（左）–Beclin1（2P1L），BCL-XL（左）–BAK（1BXL），BCL-XL（左）-BIM（1PQ1）、MCL-1–BIM（2NL9）和KSHV BCL-2（1K3K）。国家生物技术信息中心(网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)序列数据库中蛋白质序列的登录号为小鼠Beclin1(NP_062530号)、BCL-XL（左）(NP_033873号)，BAX（行李）(NP_031553号)，贝克(NP_031549号)，坏(NP_031548号)，自行车(NP_031572号)、BIM(NP_997563)，投标(NP_031570号)、BMF(NP_612186号)，美洲狮(NP_573497号)，诺萨(NP_067426号)，小时(NP_031571号)，人类Beclin1(NP_003757号)，BCL-X公司L（左）(NP_612815号)，BCL-2(NP_000624号)，MCL-1型(NP_068779号)，贝克(NP_001179号)、BIM(NP_619527)，xl贝格林1(AAH73292型)，tr贝格林1(NP_001032963号)，dmBeclin1号机组(NP_651209)，sc贝克林1(BAA32104型)，M11(AAF19336型)，KSHV BCL-2(NP_572068号)、RRV ORF16(AAF59994型)，BHV4 BORFB2(核电厂_076508)、HVS ORF16(CAA73630型)，MeHV BCL-2(NP_073365号)，EBV BHRF1(53396加元)和EHV2 ORFE4(NP_042601号).

致谢

本研究使用了韩国浦项加速器实验室的束线4A。

缩写

γHV68小鼠γ疱疹病毒68
坏BCL-2相关死亡启动子
贝克BCL-2拮抗剂/杀伤剂1
行李BCL-2相关X蛋白
BCL-2型B细胞淋巴瘤-2
制动马力BCL-2同源性
投标BH3-相互作用域死亡激动剂
自行车BCL-2相互作用的杀手
BIM公司BCL-2细胞死亡的相互作用介质
BMF公司BCL-2修正因子
CCD（电荷耦合器件）线圈域
光盘圆二色性
电子海图进化保守域
GFP公司绿色荧光蛋白
消费税谷胱甘肽-S-转移酶
Hrk（小时）哈拉基里语
HT（高温）疏水尾
国际贸易中心等温滴定量热法
KSHV公司卡波西肉瘤相关疱疹病毒
生命周期3微管相关蛋白1轻链3
MCL-1型髓细胞白血病序列1
PI（3）KCIIIⅢ类磷脂酰肌醇3-激酶
彪马 对53-凋亡的预调节介质
全氟乙烯三氟乙醇
UVRAG公司抗紫外线相关基因

脚注

作者贡献。BK、JSW、JUJ和BHO构思并设计了实验。BK、JSW、CL、KHL、HSH、XE和KSK进行了实验。BK、JSW、JUJ和BHO分析了数据。BK、JSW和BHO撰写了这篇论文。

基金。这项工作得到了韩国MOST/KOSEF（至BHO）的创新研究计划（生物分子识别中心）和韩国MOST（至KSK）的功能蛋白质组学中心（21世纪前沿研究计划）的支持。BK、JSW和KHL得到了Brain Korea 21项目的支持。

相互竞争的利益。提交人声明，不存在相互竞争的利益。

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